Clonaggio dei biosensori αS-CFP/αS-YFP con localizzazione

I biosensori sono stati ottenuti clonando separatamente i fluorofori CFP e YFP, due varianti di GFP, in frame con il C-terminale di αS umana wt contenuta nel vettore pcDNA3.1 per l’espressione ubiquitaria o con il C-terminale di αS umana wt contenuta nel vettore pCMV- myc-ER, che dirige l’espressione di αS nel RE, attraverso una sequenza di localizzazione e ritenzione. Il biosensore originariamente citoplasmatico, è stato rinominato ubiquitario in quanto, in successivi esperimenti, è stata osservata una localizzazione più diffusa, fino a livello nucleare. Il clonaggio è stato realizzato utilizzando la metodologia TA-cloning, seguita da un subclonaggio nei vettori di espressione appena menzionati. La scelta del metodo TA è derivata dalla mancanza di adeguati siti di restrizione per i plasmidi originali pE-CFP-C1 e pE-YFP-C1, contenenti CFP e YFP, rispettivamente. Il TA-cloning è una rapida strategia di clonaggio a fase unica per il diretto inserimento di un prodotto di PCR in un vettore plasmidico, che sfrutta l’attività terminal- transferasica dell’enzima Taq polimerasi che, tramite un meccanismo stampo-indipendente, aggiunge deossiadenosina (A) all’estremità 3’ di una molecola di DNA a doppio filamento. Perciò, la maggior parte dei prodotti da PCR amplificati dalla Taq polimerasi è provvisto di 3’A-overhang, ad entrambe le estremità. Il vettore pCR2.1, utilizzato nella reazione di ligazione, è un vettore venduto già linearizzato, caratterizzato da singoli residui di deossitimidina

(T) all’ estremità 3’; questo permette un clonaggio non direzionato ad alta efficienza dei prodotti di PCR, facilitato dalla complementarietà tra il 3’-A dei prodotti di PCR e il 3’-T-overhang del vettore plasmidico.

Ho, quindi, proceduto nel seguente modo: i campioni di interesse, pE-CFP-C1 e pE-YFP-C1, sono stati sottoposti alle rispettive PCR, come descritto nel paragrafo 4.1 di Materiali e Metodi, utilizzando come primer di clonaggio Not-I-CFP-Frw e XbaI-CFP-Rev.

I prodotti di PCR, CFP e YFP, sono stati inseriti nel vettore pCR2.1 mediante ligazione e amplificati tramite trasformazione batterica. A seguito dello screening bianco/blu ho selezionato diverse colonie ed estratto il DNA plasmidico. Per le colonie contenenti l’inserto CFP il DNA plasmidico è stato digerito con enzima di restrizione EcoRI, mentre il DNA plasmidico delle colonie contenenti l’inserto YFP è stato digerito con Pst-I e EcoRV. I frammenti di DNA attesi dalla digestione erano:

- 750 bp ( inserto) e 3.9 kb ( vettore) nel caso di CFP; - 508 bp (inserto) e 4 kb (vettore) nel caso YFP.

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I cloni corretti sono stati sequenziati ed analizzati e ne è stato selezionato uno, rispettivamente per CFP e YFP, per procedere al subclonaggio nei plasmidi pcDNA3.1-αS-wt, per l’espressione ubiquitaria in cellule di mammifero e pCMV-myc-ER-αS-wt, per l’espressione nel reticolo.

Figura 7. Selezione cloni positivi alla reazione di digestione.

La selezione dei cloni corretti dopo clonaggio con la strategia del TA cloning è avvenuta tramite digestione con i seguenti enzimi di restrizione: clone CFP 1-5: digestione con EcoRI, con bande attese all’altezza di 750 bp e 3,9 kb; cloni YFP 1-3: digestione con Pst-I ed EcoRV, con bande attese all’altezza di 508 bp e 4 kb.

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Durante il subclonaggio, vari tentativi di restrizione hanno evidenziato una bassa capacità di taglio dell’enzima XbaI, inserito nella prima fase, così, è stato deciso di optare per una strategia non direzionale, utilizzando i siti di restrizione per NotI fiancheggianti le sequenze di CFP e YFP all’interno del vettore pCR2.1. In questo modo, eseguendo una digestione per entrambi i campioni con l’enzima di restrizione NotI, è possibile ottenere il frammento di DNA di 717 bp, corrispondente alla lunghezza sia di CFP che di YFP.

Il frammento è stato poi inserito con una ligazione al C-terminale di αS contenuta nei plasmidi pcDNA 3.1-αS-wt e pCMV-myc-ER-αS-wt.

I prodotti di ligazione sono stati trasformati in cellule E. Coli e seminati in piastre contenenti agar ed antibiotico ampicillina.

Dal momento che i plasmidi pcDNA 3.1-αS-wt e pCMV-myc-ER-αS-wt non contengono la sequenza di LacZ per il sistema di doppia selezione bianco/blu, le colonie batteriche che cresceranno conteranno il plasmide, che potrebbe anche risultare vuoto. Inoltre, poiché il subclonaggio non era direzionato, le sequenze di CFP e YFP si sono potute inserire nel plasmide ricevente in entrambe le direzioni. Per queste ragioni, un più ampio numero di colonie è stato selezionato ed amplificato per tutti i cloni ottenuti e il controllo tramite digestione per restrizione è avvenuto attraverso due digestioni sequenziali nel caso dei cloni a localizzazione nel RE. Per confermare il corretto inserimento degli inserti nei vettori plasmidici, sono state eseguite reazioni di digestione con enzimi differenti (Figura 8).

In particolare:

 αS-CFP- pcDNA3.1 è stato digerito con l’enzima di restrizione EcoRI e i frammenti di DNA attesi erano di 6.5 kb ( vettore) e 800 bp ( αS-CFP, inserto).

 αS-YFP-pcDNA3.1 è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI, con due bande attese all’altezza di 5.5 kb e 1.2 kb, indicative della lunghezza del vettore e dell’inserto (αS-YFP), rispettivamente.

 αS-YFP-pCMV-myc-ER è stato digerito con l’enzima di restrizione Pst-I, con bande attese di 5.6 kb e 630 bp;

 mentre per il costrutto αS-CFP-pCMV-myc-ER è stata eseguita una doppia digestione. Nella prima sono stati usati due enzimi, Pst-I e Xba-I, mediante i quali sono state ottenute due bande attese: 1,2 kb e 5.1 kb; di queste, la banda di lunghezza 1.2 kb, corrispondente ad αS+CFP, è stata purificata e sottoposta a successiva digestione con l’enzima di restrizione BstN-I.

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Poiché secondo la mappa del vettore pCMV-myc-ER sono presenti più siti di restrizione per l’enzima, a seguito della reazione di digestione saranno attese tutta una serie di bande a basso peso molecolare, tra cui due, una di 500 bp ed una di 300 bp, corrispondenti ad αS e CFP.

I cloni risultati positivi per le reazioni di digestione sopra descritte sono stati selezionati ed analizzati tramite sequenziamento.

a)

43 c) d) e)

Figura 8. Selezione cloni positivi alla reazione di digestione.

I cloni contenenti i plasmidi attesi sono stati selezionati mediante digestione con i seguenti enzimi di restrizione: EcoRI per i biosensori αS-CFP- pcDNA3.1 (a) e α-YFP-pcDNA3.1 (b); Pst-I e Xba-I per αS-CFP-pCMV-myc-ER (c) da cui è stata ottenuta la banda di 1.2 kb, che è stata successivamente sottoposta a restrizione con l’enzima BstN-I (d); Pst-I per αS-YFP- pCMV-myc-ER (e) con bande attese di 5.6 kb e 630 bp. I cloni selezionati sono indicati dalle frecce nere.

44 Figura 9. Schema biosensori.

Schema dei biosensori di αS ottenuti tramite clonaggio. A) Biosensori citoplasmatici. CFP/YFP clonati in frame al C-terminale di αS, inseriti all’interno del vettore pcDNA 3.1.

B) Biosensori per il reticolo endoplasmatico. CFP/YFP clonati in frame al C-terminale di αS, inseriti all’interno del vettore pCMV-myc-ER. In verde sono evidenziati il tag per il segnale di ritenzione (ERLS), al dominio N-terminale di αS, e la sequenza di indirizzamento al reticolo (SEKDEL).

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5.2 L’espressione dei biosensori in cellule di mammifero dimostra come αS-YFP e αs-CFP siano proteine funzionali.

Le coppie di biosensori, αS-CFP-pCDNA3.1, αS-YFP-pCDNA3.1 e αS-CFP-pCMV-myc-ER, αS-YFP-pCMV-myc-ER, così generate, sono state successivamente trasfettate singolarmente in cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y, in modo tale da convalidare il loro livello di espressione e stabilità, nonché il loro peso molecolare.

Questa linea cellulare è frequentemente usata come modello di ricerca nella malattia del Parkinson per le sue origini umane, proprietà neuronali catecolaminergiche (anche se non strettamente dopaminergiche) e la facilità di mantenimento (Xicoy et al., 2017).

Per controllare il livello di stabilità ed espressione dei singoli biosensori, è stato trasfettato 2 µg di DNA per campione, considerando un rapporto DNA: Lipofectamine 1:2.5. Successivamente ho lisato le cellule e separato la componente solubile in detergente ionico (TxSol) e la componente insolubile (TxPel) in detergente non-ionico. I campioni sono stati, quindi, sottoposti a corsa elettroforetica in SDS-Page, trasferiti su membrana in nitrocellulosa e poi incubati con anticorpo primario Syn-1 specifico per αS.

Il Western blot (Figura 10) mostra come i biosensori vengano espressi correttamente dalla cellule come proteine full lenght, con un peso molecolare atteso di circa 40 kDa, risultante dalla fusione delle due proteine (αS circa 15 kDa e YFP o CFP circa 27 kDa). Inoltre, a parità di DNA trasfettato e ammontare di proteine caricato, i biosensori a localizzazione ubiquitaria appaiono maggiormente espressi nella componente solubile rispetto ai biosensori espressi nel RE.

Diversamente, quando la componente insolubile a detergenti non ionici è stata analizzata, i livelli di proteina dei biosensori del RE erano particolarmente elevati, suggerendo come la localizzazione reticolare possa rendere i biosensori più insolubili o più aggregati.

46 a) b)

Figura 10. Verifica dell’espressione e del livello di stabilità dei biosensori tramite western blot.

Western blot dell’espressione dei biosensori nelle due differenti frazioni proteiche (Tx-Sol, A e TX-Pel, B), ottenute da cellule SH-SY5Y. Le cellule sono state trasfettate con ugual quantità di vettore vuoto (V, pCDNA 3.1); αS wt a localizzazione citoplasmatica (pcDNA3.1-αS-wt) o ad espressione nel reticolo (pCMV-myc-ER-αS-wt); e i biosensori ubiquitari αS-CFP-Ubi (αS-CFP- pcDNA3.1) e αS-YFP-Ubi (αS-YFP-pcDNA3.1) o del reticolo αS-CFP-RE (αS-CFP-pCMV- myc-ER) e αS-YFP-RE (αS-YFP-pCMV-myc-ER) che venivano espressi singolarmente.

V αS-Ubi αS-YFP αS-CFP αS-RE αS-YFP αS-CFP 0 20 40 60 80 100 120 Tx-SOL ubi O .D . e sp r e ss ion e p r ote in e /p on c e au RE

V αS-Ubi αS-YFP αS-CFP αS-RE αS-YFP αS-CFP

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Tx-PEL ubi O .D . es p re ss ion e p rote in e/ p on ce au RE

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Una volta appurata la loro espressione e stabilità, ho confermato la loro funzionalità e localizzazione cellulare mediante in vivo cell imaging.

In questo caso, la trasfezione in cellule SH-SY5Y è stata eseguita con 0.6 µg di DNA, mantenendo il rapporto di 1:2.5 DNA-Lipofectamine, poiché, a seguito di varie prove sperimentali, è risultata la condizione ottimale in termini di efficienza di trasfezione e di qualità del segnale.

Come da protocollo, le cellule sono state differenziate con 10 µM di RA, in modo tale da indirizzare lo sviluppo verso un fenotipo neuronale. Dopo 24h, l’espressione dei biosensori è stata rilevata mediante live imaging al microscopio confocale. Come evidenziato in Figura 11, tutti i sensori espressi mostravano un segnale di fluorescenza intenso, confermando che le proteine di fusione erano funzionanti ed avevano una localizzazione cellulare attesa. In particolare, è da notare come i sensori αS-CFP e αS-YFP hanno un’espressione ubiquitaria con un segnale diffuso ed omogeneo, che si estende anche a livello nucleare, anche se di minor intensità. In contrasto, i biosensori αS-CFP e αS-YFP ad espressione reticolare presentavano una localizzazione più specifica, tipica del RE, che delimitava la membrana nucleare. Inoltre, quando venivano espressi i biosensori αS-CFP e αS-YFP/RE, erano spesso evidenti delle zone dot-like di più alta intensità di segnale, che suggeriscono la presenza di punti focali di aggregazione di αS. Questo esperimento ha inoltre permesso di osservare come, a parità di DNA trasfettato, l’intensità di segnale mostrata dall’espressione di αS-CFP (sia ubiquitario che reticolare) era sempre maggiore che rispetto al costrutto recante YFP. Per tale ragione, gli esperimenti successivi di espressione dei biosensori sono stati condotti trasfettando le cellule con una quantità di DNA di 0.6µg per αS-CFP e 2.4µg per αS-YFP, sia ad espressione ubiquitaria che nel reticolo.

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a)

b)

Figura 11. Live cell imaging dei singoli biosensori.

Immagini di Live cell imaging di cellule SH-SY5Y trasfettate, singolarmente, con αS-CFP, αS-YFP o αS-CFP-RE e αS-YFP-RE. Il segnale di fluorescenza è emesso nel canale 458 nm (CFP, ciano) e nel canale 514 nm (YFP, giallo). In A) è riportata la fluorescenza dei biosensori ad espressione ubiquitaria, mostrando una diffusione più omogenea, estesa anche a livello nucleare. In B) è raffigurato il segnale di fluorescenza dei biosensori ad espressione nel RE, in cui si possono notare zone “dot-like”, che indicano punti di aggregazione di αS (frecce rosse). Scale bar, 10µm

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5.3 Co-localizzazione cellulare con marcatori del RE dimostra una corretta distribuzione dei biosensori.

A conferma della corretta localizzazione cellulare delle due coppie di biosensori, ho eseguito un ulteriore esperimento di co-localizzazione, confrontando l’espressione delle sonde con quella di un noto marcatore reticolare, Grp94.

Brevemente le cellule SH-SY5Y sono state co-trasfettate con una quantità di DNA pari a 0.6µg per αS-CFP e 2.4µg per αS-YFP, sia ad espressione ubiquitaria che nel reticolo e poi differenziate il giorno successivo con 10 µM di RA. Dopo 48h dalla trasfezione le cellule venivano fissate in paraformaldeide ed incubate con l’anticorpo Grp94, a 4°C O/N. Il giorno successivo, dopo un breve lavaggio, le cellule erano incubate con anticorpo secondario coniugato al fluoroforo 633 Alexa Fluor e montate su vetrino.

Le immagini sono state ottenute mediante un’acquisizione seriale separata, eccitando dapprima con il canale per CFP (458nm), poi il canale per YFP (514nm) e infine con il canale per il 633 . Ancora una volta, veniva confermata la differente distribuzione del segnale fra le due coppie di biosensori. In figura 12 A, B, C è riportata l’espressione dei biosensori del reticolo sovrapposta all’espressione del marcatore Grp94 singolarmente (A,B) o in combinazione (C), in cui si evidenzia una specifica e prevalente sovrapposizione del segnale in determinate zone, confinate all’interno o sulla superficie del reticolo.

Al contrario, la figura 12 D,E,F mostra la sovrapposizione del segnale fluorescente dei tre canali (CFP, YFP e Grp94) per l’espressione dei biosensori ad espressione ubiquitaria, singolarmente (D,E) o in combinazione (F). In questo caso, il segnale appare molto più omogeneo e la parziale localizzazione che si può osservare tra biosensori e marcatore del reticolo è dovuto probabilmente alla distribuzione diffusa di questi biosensori all’interno della cellula, anche in prossimità del RE.

50 A) B) C)

51 D) E) F)

52

Figura 12. Co-localizzazione delle coppie di biosensori con il marcatore del reticolo.

Cellule SH-SY5Y co-trasfettate per entrambe le coppie di biosensori e co-localizzate per immunofluorescenza con Grp94, marcatore del reticolo. In A, B, D, E è riportata la singola co- localizzazione dei biosensori ad espressione nel RE (A,B) o ubiquitaria (D,E) con Grp94, mentre in C,F la colocalizzazione è stata fatta sovrapponendo tutti e tre i canali (RE, C e ubiquitaria F). È ben evidente la differente diffusione di segnale delle due coppie di costrutti.

53

5.4 L’analisi FRET mostra una scarsa aggregazione dei biosensori, sia a livello del RE che ubiquitario.

Una volta appurato livello di stabilità, espressione e localizzazione cellulare dei biosensori, tramite i precedenti esperimenti, ho voluto verificare se, effettivamente, i biosensori fossero in grado di interagire ed aggregare producendo un segnale FRET.

Nuovamente, le cellule SH-SY5Y sono state trasfettate con le coppie di biosensori singolarmente o in coppia, ad espressione ubiquitaria o ad espressione nel reticolo, mantenendo gli stessi parametri sperimentali fissati nei precedenti esperimenti. Inoltre, come controllo di FRET le cellule sono state trasfettate con: un plasmide per il controllo positivo che conteneva nello stesso vettore (pE-CFP/YFP) YFP e CFP separate da un polylinker; due plasmidi per il controllo negativo, uno contenente YFP (pE-YFP) e l’altro CFP (pE-CFP) che venivano co-trasfettati nelle cellule. Mentre il controllo positivo e negativo servivano per stabilire l’efficienza della trasfezione e del segnale di FRET, i biosensori trasfettati singolarmente hanno permesso di settare i parametri di BT Donatore e BT Accettore da usare nella normalizzazione dei valori di FRET per i biosensori co-trasfettati. L’acquisizione delle immagini è stata effettuata dopo differenziazione e a 48h dalla trasfezione. Come da figura (figura 13), si può notare la presenza di un segnale di FRET sia per il controllo positivo che per i biosensori, sia ubiquitari che del RE, il quale è assente, invece, nel caso i cui YFP e CFP sono co-espresse, ma non interagiscono (controllo negativo). Inoltre, in accordo con la localizzazione cellulare dimostrata in precedenza, anche per quanto riguarda il segnale di FRET esiste una differenza sostanziale tra i biosensori. Infatti, mentre per il biosensore del reticolo, il segnale di FRET è condensato in punti focali all’interno della cellula, nel caso del sensore ubiquitario il segnale FRET è diffuso ed omogeneo.

54 A) B) C) D)

55

Figura 13. Rilevamento segnale FRET in cellule esprimenti le coppie di biosensori.

Le cellule SH-SY5Y sono state co-trasfettate con 0.6µg di DNA per αS-CFP e 2.4µg di DNA per αS-YFP, sia per i biosensori ad espressione ubiquitaria (C) che ad espressione nel reticolo (D). Inoltre, sono mostrate anche le immagini del controllo positivo (A), in cui è stato trasfettato 0,6 µg di DNA del plasmide pE-CFP/YFP e le immagini del controllo negativo (B), in cui le cellule SH-SY5Y sono state co-trasfettate con 0,3 µg di DNA pE-CFP e 0.3 µg di DNA pE-YFP. Le immagini sono state acquisite nel canale donatore (CFP; 458 nm), nel canale dell’accettore (YFP; 514 nm) e nel canale FRET. L’indice di intensità FRET è rappresentato dal pannello di colori che va dal blu scuro al bianco, indicando assenza di FRET (blu) e un’alta intensità del segnale FRET (rosso).

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Una volta acquisite le immagini, è stata fatta l’analisi per entrambi i biosensori, quantificando il segnale di NFRET mediante comparazione delle regioni a più alta intensità di fluorescenza, intese come zone di più alta probabilità di aggregazione, con regioni a bassa intensità di segnale, interpretate come zone in cui i biosensori non aggregano e quindi il segnale FRET scompare. In grafico sono riportati i valori NFRET per entrambe le coppie di biosensori (Figura 14). Ciò che si osserva è una lieve differenza di segnale FRET tra punti focali di aggregazione e zone a bassa intensità, solo per quanto riguarda il biosensore del reticolo, ma non per il biosensore ad espressione ubiquitaria. Tale differenza non è, però statisticamente significativa. Questo potrebbe essere dovuto al fatto che l’aggregazione del sensore del reticolo non è uniforme nella popolazione cellulare, per cui alcune cellule (probabilmente un basso numero) formano aggregati, mentre nelle altre l’interazione fra i due fluorofori è scarsa. Per quanto riguarda il biosensore ubiquitario, l’assenza di segnale FRET potrebbe essere dovuta all’espressione più diffusa ed omogenea e l’assenza di zone di più alta intensità sfavorirebbe l’analisi, dal momento che tutte le regioni appaiono ugualmente fluoroscenti.

Cosa possa dettare l’aggregazione in una cellula e non in un'altra è ancora sconosciuto. Bisogna, però, ricordare che l’esperimento è stato condotto su un modello cellulare (SH-SY5Y) in cui la presenza di aggregati di αS è determinata semplicemente dalla proprietà intrinseca della proteina di formare oligomeri/aggregati e non da stress cellulari, come stress ossidativi o dei proteosomi, che potrebbero favorire aggregazione (Wang, 2006; Colla et al., 2012). Inoltre i biosensori sono espressi transientemente, solo per 48h, per cui è possibile che un’espressione continua potrebbe migliorare l’aggregazione e il conseguente segnale di FRET.

57 Figura 14. Analisi FRET dei biosensori.

Il grafico riporta i valori medi di FRET normalizzati misurati sull’emissione di fluorescenza delle due coppie di biosensori co-trasfettate, separatamente, in cellule SH-SY5Y come da Fig.13. Per ogni coppia di biosensori, è stata determinata la fluorescenza in zone a più alto segnale (high intensity, verde scuro) e in zone in cui il segnale è più basso (low intensity, verde chiaro). Per ogni condizione è stata misurato il valore di FRET su un campione di 20 cellule circa (n=20). L’analisi statistica fatta con test ANOVA One Way ha evidenziato come la differenza nel segnale di NFRET a livello di RE tra punti focali più intensi (verde scuro) rispetto a valori più bassi (verde chiaro), non sia significativa (n.s.).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 high intensity low intensity

N

FR

E

T

RE

Ubi

n.s.

n.s.

58

6. Conclusioni e

59

Le coppie di biosensori generate a seguito del mio progetto di tesi sono risultate essere proteine funzionali, con una corretta espressione e localizzazione cellulare, come dimostrato dagli esperimenti appena descritti. Tuttavia, il segnale di FRET generato dopo la co-espressione dei fluorofori era così debole da non permettere di verificare se effettivamente ci fosse aggregazione della proteina αS a cui i due fluorofori sono legati.

Questo è derivato da diverse motivazioni: innanzitutto, bisogna sottolineare il fatto che l’aggregazione, in questa linea cellulare, è promossa semplicemente dalla proprietà intrinseca della proteina di formare oligomeri/aggregati e non da condizioni che possono indurre stress cellulari come stress ossidativo o dei proteosomi, considerati tra le principali cause responsabili dell’aggregazione di αS .

Allo stesso modo, una trasfezione transiente con un’emivita della proteina limitata sicuramente contribuisce a non facilitare l’aggregazione di αS e genera un segnale FRET poco efficiente.

In virtù di tali conclusioni, sono già in atto verifiche e prove sperimentali per migliorare il modello :

- utilizzo di agenti che inducano stress ossidativo/del RE/ del proteosoma, nella linea cellulare SH-SY5Y, come controllo di aggregazione della proteina contenuta nei biosensori;

- utilizzo di un modello cellulare stabile ed inducibile di aggregazione, basato sul sistema Tet-ON di induzione, per permettere di raggiungere livelli basali duraturi di espressione e di fibrillogenesi. Inoltre tale sistema permetterebbe, non solo di seguire l’aggregazione di αS nel tempo, ma anche di determinare se i biosensori possano venire inglobati e quindi marcare aggregati preformati.

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1. Bartels T, Choi JG, Selkoe DJ. alpha-Synuclein occurs physiologically as a helically

folded tetramer that resists aggregation. Nature. 2011; 477:107–110

2. Blandini F., Nappi G., Tassorelli C. & Martignoni E. (2000) Functional changes of the

basal ganglia circuitry in Parkinson's disease Prog Neurobiol 62,63-88