JNKs. Altro composto dotato di un’eccellente selettività è l'inibitore covalente 72 (JNK-IN-8) che viene preso in considerazione come, probe di alta qualità per le JNKs.
Tuttavia, nessun inibitore selettivo di JNKs è ad oggi in commercio. Oltretutto, la necessità di un inibitore selettivo è ancora un argomento controverso Inoltre, lo sviluppo di inibitori selettivi non è un compito banale dal punto di vista della progettazione. All'interno della tasca di legame dell'ATP, le differenze tra le JNKs sono molto sottili e limitate a due posizioni nella regione idrofobica I. In questa regione, JNK1 e JNK2 differiscono solo per due aminoacidi (Met77 vs Leu77 e Ile106 vs Leu106) e JNK1/3 e JNK2/3 differiscono per un solo aminoacido ciascuno (Ile106 vs Leu144 o Leu77 vs Met115).
Oltre all'uso di inibitori di JNK ATP non competitivi, un ulteriore approccio più efficace potrebbe essere quello di andare ad inibire le chinasi a monte della via che regolano le JNKs. Un obiettivo possibile può essere rappresentato dalla chinasi DLK (dual leucine zipper kinase, MAP3K12), che è espressa prevalentemente nelle cellule neuronali. DLK attiva JNKs attraverso la fosforilazione di MKK4 e MKK7. Recenti studi suggeriscono che DLK svolge un ruolo centrale come un regolatore della degenerazione neuronale.42 Pertanto, questa chinasi potrebbe essere utile target per il trattamento di malattie neurodegenerative.
Un altro possibile approccio per il targeting della via delle JNKs, potrebbe essere l'inibizione selettiva di varianti di splicing, che hanno diverse affinità per il substrato e diversa cinetica enzimatica quindi presentano diverse funzioni biologiche. In
60
questo caso, piccole molecole indirizzate ai siti di legame allosterico e doppi inibitori dei siti di legame del substrato e della tasca di legame dell'ATP, potrebbero risultare interessanti.
Un approccio alternativo è quello di inibire in maniera selettiva le interazioni tra le JNKs e i singoli substrati.
Un ulteriore passo in avanti sarebbe quello di inibire un target specifico di JNKs, dal momento che diventa sempre più evidente che il ruolo fisiologico delle JNKs è in gran parte dipendente dalla loro localizzazione cellulare. Tuttavia, tutti questi approcci richiedono strategie innovative di progettazione di inibitori che devono comprendere competenze nella chimica farmaceutica classica e in chimica organica, insieme a competenze in chimica, biologia e biotecnologia. Inoltre, dovranno essere messi a punto nuovi saggi cellulari e in vitro per consentire lo sviluppo di tali inibitori e di valutare il loro potenziale clinico.
61 RIASSUNTO
Recenti studi sulle protein chinasi N-terminali c-Jun (JNKs) hanno messo in evidenza un loro coinvolgimento nel meccanismo patogenetico di molte malattie, quali stati neurodegenerativi e condizioni infiammatorie. Inoltre, enzimi a monte e substrati a valle della via delle JNKs, entrano in gioco nello sviluppo e nella progressione di alcune neoplasie come il carcinoma del pancreas, il carcinoma polmonare non a piccole cellule, il carcinoma ovarico e il glioblastoma. L’inibizione di JNKs rappresenta una strategia terapeutica attraente e può risultare utile nel trattamento di varie patologie, tra cui Parkinson, Alzheimer, infiammazione, cancro.
Le JNKs sono protein-chinasi mitogeno attivate (MAPKs), e vengono attivate tramite due step di fosforilazione all’interno della cascata di chinasi detta “a tre livelli”. L’attivazione delle MAPKKK tramite stimoli esterni, (fattori di crescita, citochine, stress), porta alla fosforilazione e attivazione delle MAPKK, che a loro volta stimolano l’attività di MAPK attraverso una doppia fosforilazione sui residui di treonina e tirosina all’interno della sequenza Tyr-Pro-Thr. Esistono tre isoforme di JNKs, classificabili in JNK1, JNK2 e JNK3. Mentre le JNK1 e JNK2 sono espresse ubiquitariamente, JNK3 è presente principalmente nel cervello e in misura minore nel cuore e nei testicoli. Le JNKs sono molto simili agli altri componenti della famiglia di MAPKs, quali p38α, p38β e ERK2, quindi la sfida per i ricercatori è quella di progettare inibitori selettivi verso JNK e soprattutto selettivi verso le varie isoforme di queste ultime..
In questa tesi vengono riportati vari esempi di inibitori di JNKs, in grado di bloccare la cascata di attivazione delle JNKs a vari livelli e con potenza e selettività diversa. Attualmente nessuno di questi composti è in commercio, alcuni però sono in fase clinica.
Tra i composti più interessanti va sicuramente citato l’inibitore peptidico allosterico di JNK, XG-102, che è attualmente in fase II di sperimentazione clinica, per il trattamento dell’uveite. Su questo derivato, Xigen ha recentemente condotto uno studio di fase III conclusosi nel gennaio 2017, in cui è stato studiato il possibile
62
coinvolgimento di XG-102 nella riduzione dello stato flogistico post-operatorio della cataratta ed è stato dimostrato che alla dose di 900 μg, XG-102, somministrato per iniezione sub-congiuntivale, è in grado ridurre l’infiammazione e, conseguentemente, la sintomatologia dolorifica.
In questa tesi di laurea, sono riportati anche degli esempi di inibitori multitarget, come gli inibitori doppi non peptidici bidentati JNK/LRRK2, i quali si legano al sito di legame per l’ATP e ad una tasca di legame superficiale di JNK3, sono selettivi verso JNK3 e LRRK2, entrambe chinasi associate alla progressione della malattia di Parkinson.
È stato fatto anche un accenno agli inibitori covalenti, in merito ai quali la Harvard Medical School ha condotto nuovi trial clinici riaprendo il dibattito sui potenziali effetti fuori-target degli stessi. Alcuni inibitori covalenti, derivanti da modifiche strutturali su Imatinib, noto per essere un inibitore covalente di JNKs già utilizzato nel trattamento di alcune forme di leucemia, sono risultati selettivi verso JNK2/3 con concentrazioni IC50 nel subnanomolare, accompagnati però da effetti fuori- target.
63 BIBLIOGRAFIA
1. Andras Zeke, Mariya Misheva, Attila Remenyl, Marie A. Bogoyevitch.