Recenti sviluppi di nuovi inibitori delle chinasi N-terminali c-Jun

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DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Farmacia

TESI DI LAUREA

RECENTI SVILUPPI DI NUOVI INIBITORI DELLE

CHINASI N-TERMINALI C-JUN

Relatore: Candidata:

DIGIACOMO MARIA ROSSI GIULIA

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Indice

■ BERSAGLI TERAPEUTICI DELLE JNKs ... 12

Malattie neurodegenerative ... 12 Infiammazione ... 14 Neoplasie ... 14 Altre malattie ... 15 ■ INIBITORI DI JNKs ... 16 Diamminopurine ... 20 Azaindoli ... 23 Pirazoliluree ... 24

Amminopirimidine e strutture correlate ... 26

Piridinilisossazoli ... 37

Triazoloni ... 38

Benzimidazoli ... 40

Piperazinammidi ... 41

Inibitori a struttura tiofenica ... 43

Chinoloni e Azachinoloni ... 47

Indenochinossaline ... 48

Inibitori di JNK allosterici, bidentati e peptidici ... 49

Inibitore doppio non peptidico bidentato JNK / LRRK2 ... 53

Inibitori covalenti ... 55

■ CONCLUSIONI E PROSPETTIVE ... 59

RIASSUNTO ... 61

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4 ■ INTRODUZIONE

Le proteine chinasi sono una grande e diversificata famiglia multigenica di proteine con attività enzimatica; rappresentano circa l’1,7% del genoma umano e mediano la maggior parte degli eventi di trasduzione del segnale all’interno delle cellule eucariotiche, fosforilando proteine bersaglio. Tra queste, le chinasi c-Jun N-terminale (JNKs) sono state ampiamente studiate per oltre due decenni, sia per quanto riguarda gli aspetti generali sia gli aspetti più specifici delle stesse, come ad esempio il loro ruolo a livello del cervello o il possibile utilizzo come target terapeutico nella patologia neoplastica di tale distretto e non solo.1

Le JNKs sono delle serina/treonina chinasi appartenenti alla famiglia delle protein-chinasi mitogeno attivate (MAPK), le quali regolano importanti processi fisiologici, tra cui le funzioni neuronali, azioni immunologiche e lo sviluppo embrionale.

Le JNKs, note anche come “protein-chinasi attivate da stress”, fosforilano diversi substrati in risposta a stimoli da parte di eventi di stress cellulare e citochine proinfiammatorie, quali il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) e l’interleuchina 1β (IL-1β). (Fig. 1) Tra le diverse proteine identificate come substrato di JNK, troviamo c-Jun, che attiva il fattore di trascrizione 2 (ATF-2) e la JNK proteina di interazione 1 (JIP-1).

5 MAPKs

Le MAPKs appartengono al gruppo di chinasi CMGC (dal nome dei suoi più noti membri: chinasi ciclina-dipendenti (CDK), MAPKs, glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK3), e chinasi CDKlike (CLKS). Le chinasi CMGC presentano molte somiglianze nei loro domini chinasici, in particolare in prossimità del loro sito catalitico, e come conseguenza di ciò, essi riconoscono sequenze identiche o molto simili nelle loro proteine substrato. La maggior parte delle chinasi CMGC (e tutte le MAPK) richiedono la fosforilazione nel loro ciclo di attivazione per la completa attività catalitica; fanno eccezione solo alcune, costitutivamente attive (casein chinasi).

Nel caso delle MAPK classiche, come JNKs, ERK1/2, p38, o ERK5, sono richiesti due step di fosforilazione, all’interno della cascata di chinasi detta a “tre livelli”: MAPK, MAPK chinasi (MAPKK) e MAPKK chinasi (MAPKKK). (Fig. 2)

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Le MAPKKKs, sono Ser/Thr chinasi, spesso attivate tramite fosforilazione e/o interazione con proteine della famiglia delle Ras/Rho in risposta a stimoli extracellulari. L’attivazione di MAPKKKs porta alla fosforilazione e attivazione di MAPKKs, che a loro volta stimolano l’attività di MAPKs, attraverso la doppia fosforilazione sui residui di Thr e Tyr all’interno di una sequenza Thr-Pro-Tyr localizzata nel loop di attivazione del sottodominio chinasico VIII, (TPY nel caso di JNKs). (Fig. 3)

Figura 3: Domini chinasici

Le MAPKKKs sono state considerate le "custodi" delle vie MAPK, ma nonostante la loro importanza, la maggior parte di esse rimangono poco caratterizzate a livello molecolare e nessuna struttura di MAPKKKs è stata determinata ad oggi. Ciò che è chiaro è che le MAPKKKs sono strettamente controllate da meccanismi multipli e normalmente non possono essere attivate in un unico passaggio. Molte MAPKKKs, come MEKK1, MEKK4 e MLK3, sono soggette ad auto inibizione da parte di vari domini regolatori associati ai loro domini chinasi.1 Inoltre MAPKKKs come, MLK3 o MEKK1, vengono attivate allostericamente per dimerizzazione del dominio chinasico , mentre per MEKK2, è necessaria la dimerizzazione del suo dominio chinasico, affinchè si realizzi l'attivazione completa di JNK in sede intracellulare. Resta ancora non del tutto chiaro il funzionamento del dominio

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catalitico chinasico di dimerizzazione di queste MAPKKKs. I più importanti substrati delle MAPKKKs all'interno della cascata di JNK sono le MAPKKs, noti come MKK4 e MKK7 (Fig. 4), che sono proteine altamente specializzate della famiglia chinasi STE (o MAPK). La fosforilazione MAPKKK-mediata è l'unico meccanismo di attivazione riportato per MKK4 e MKK7 in condizioni fisiologiche e si realizza attraverso la fosforilazione dei residui Thr183 e Tyr185 (JNK1 / JNK2) presenti a livello del tratto Thr-Pro-Tyr, situato nel sito di attivazione. Il grado di fosforilazione di MKK4 e MKK7 può variare anche in base alla natura dello stimolo iniziale. Ad esempio, l'interleuchina-1 (IL-1) o TNF attivano preferenzialmente MKK7, mentre MKK4 e MKK7 sono entrambi attivati da input stressogeni. A differenza di MKK7, che è selettiva per JNKs, MKK4 può anche fosforilare p38 MAPK sia in vitro che in vivo,1 quindi, in tal caso, le vie JNK e p38 MAPK non sono nettamente separate.

Figura 4: Organizzazione generale delle vie di segnalazione di JNK

8 I geni di JNK

Il genoma umano contiene tre geni strettamente correlati per JNK: JNK1, JNK2, e JNK3,2 che codificano proteine di 400 amminoacidi. I geni, JNK1 (MAPK8), JNK2 (MAPK9) e JNK3 (MAPK10) codificano per 10 diverse isoforme, con peso molecolare compreso tra 46 e 55 kDa.JNK1 e JNK2 presentano quattro diverse isoforme ciascuna (JNK1/2- α1, -α2, -β1, e -β2), mentre di JNK3 se ne conoscono solo due (JNK3- α1 e -α2). Tali isoforme differiscono nella sequenza aminoacidica dei sottodomini IX e X (α e β), le varianti α2 e β2 hanno un C-terminale di 43 aminoacidi in più rispetto alle isoforme α1 e β1. JNK1 e JNK2 sono espressi in quasi tutti i tessuti, mentre l'espressione di JNK3 è in gran parte limitata al sistema nervoso centrale (SNC) e, in misura, minore si trova in cuore e testicoli. Le attività enzimatiche delle proteine JNK codificate da geni differenti, o da diverse isoforme di ogni gene, possono essere molteplici, fermo restando che le isoforme di JNK1 e JNK2 contribuiscono attivamente alla fosforilazione di c-Jun così come JNK3 in sede neuronale.1

Inoltre, è stata dimostrata, utilizzando topi JNK knockout, la differente attività regolatoria di JNK1 e JNK2 nei confronti di fibroblasti, macrofagi e linfociti T e la capacità delle stesse di influenzare i meccanismi di riparazione della cute lesionata. Alcuni processi, quali la neurogenesi in vitro, richiedono l’intervento di JNK1 ma non JNK2 né JNK3, mentre altre vie coinvolgono prevalentemente JNK1 e, secondariamente, anche JNK2, come nel caso dell’omeostasi metabolica. L’azione sinergica e cooperativa di JNK1 e JNK2 si riscontra nello sviluppo di cheratinociti epidermici e dei neuroni gangliari a spirale, nella differenziazione delle cellule embrionali pluripotenti, nell’apoptosi UV- o arsenite indotta dei fibroblasti nella lipolisi degli adipociti.1

Negli ultimi anni sono stati svolti importanti ed interessanti studi riguardanti la carcinogenesi grazie all’utilizzo di animali da sperimentazione mutati geneticamente; in particolare topi JNK1 -/-, presentando la comparsa spontanea di neoplasie intestinali, la maggior inclinazione allo sviluppo di melanomi maligni dopo esposizione a raggi UV, hanno così confermato il ruolo onco-sopressore delle JNKs, inibitrici della proliferazione cellulare e pro-apoptotiche per diversi

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citotipi.1 Il ruolo onco-sopressore di JNK1 è però confutato dall’osservazione di come questi stessi animali siano meno predisposti allo sviluppo di neoplasie gastro-epatiche nitrosamina-indotte, e di come l’azione sinergica JNK1 e JNK2 possa essere coinvolta nello sviluppo di gliomi, tumori primari del sistema nervoso centrale (SNC). Le ragioni di questi risultati discordanti non sono ancora del tutto chiare, ma alcuni ricercatori hanno proposto come possibile spiegazione di tale divario un modello di “rigenerazione”, particolarmente valido a livello epatico.1

Nei topi JNK1 -/- si verifica in misura minore l’apoptosi e, di conseguenza, si ha una minore richiesta di rigenerazione degli epatociti e quindi un minor numero di divisioni cellulari. Questo stato di riduzione proliferativa, rispetto ai numeri elevati di cellule proliferanti esposte a danni genetici negli animali wild-type (wt), può aiutare a proteggere contro lo stress geno-tossico. Tuttavia, rimane sempre valida la possibilità che JNK1 e/o JNK2 migliorino la sopravvivenza e la capacità metastatica di certi citotipi maligni in modo tumore-specifico e/o tessuto-specifico.

10 Caratteristiche strutturali di JNK

Le proteine JNK sono costituite da un singolo dominio protein-chinasico (struttura a sinistra). (Fig. 5 A) Il sito di ancoraggio, costituito dalla regione con carica negativa (CD) (blu) e dalla scanalatura idrofobica (beige), svolge un ruolo importante nel legare i substrati (rosso). Queste due regioni insieme, costituiscono il principale sito di alloggiamento (D-site) delle proteine JNK. La reazione di fosfotransfer dall’ATP (giallo) avviene al lato opposto della chinasi, in cui si trovano i residui catalitici (rosa). Oltre al sito di ancoraggio, ritroviamo l’inserto CMGC (arancione), che è unico per le MAPKs e alcune relative proteine chinasi. Questo ospita anche una superficie di ancoraggio chiamata sito FxFP. Le proteine substrato meglio caratterizzate contengono un motivo lineare in grado di interagire con il D-site direttamente (substrati diretti [top]) (Fig. 5 A) o interagire con una terza proteina avente tale motivo attraverso interazioni eterologhe (substrati indiretti [bottom]). (Fig. 5 B) Lo stesso sito di ancoraggio è utilizzato per interagire con chinasi attivatrici (MAPKKs) responsabili della fosforilazione di JNK, con fosfatasi che defosforilano gli stessi residui, così come con altre proteine coinvolte nella regolazione della via. Molti substrati utilizzano anche lo stesso sito di ancoraggio per accedere alla chinasi. Pertanto la maggior parte dei partner di JNKs sono in concorrenza diretta l’uno con l’altro per il legame e l’accesso al sito catalitico.

Substrati di JNK

JNK è la chinasi principale responsabile della fosforilazione di c-Jun, anche se in realtà sono stati descritti molti substrati aggiuntivi, la cui completa identificazione non è però semplice a causa soprattutto della bassa selettività delle JNKs per i siti di fosforilazione: infatti molti dei substrati di JNK possiedono più di un sito di fosforilazione e molti meccanismi regolatori mediati da parte delle stesse JNK. Può essere che solo 1 o 2 di questi siti sarà fondamentale per la regolazione di una data funzione fisiologica, ma la stessa proteina può anche avere multipli siti

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regolatori, con ruoli diversi o, talvolta opposti.1 I principali substrati di JNK sono rappresentati da differenti e numerose famiglie di fattori di trascrizione. Inoltre, co-attivatori e co-repressori, incapaci di legare in modo diretto il DNA (esempio YAP1, yes-associated protein 1) possono anch’essi essere bersaglio di JNK.

Agendo su questi substrati del fattore di trascrizione nucleare si può regolare efficacemente la trascrizione di molti geni bersaglio. Si tratta di geni necessari non solo all'adattamento cellulare in risposta a stimoli di stress o apoptosi, ma anche in corso di sviluppo embrionale. Tuttavia, a livello molecolare, differenti fattori di trascrizione possono essere regolati da meccanismi diversi, poiché la proteina JNK può fosforilare più substrati associati alla trascrizione. Nonostante l'importanza di fattori di trascrizione come substrati di JNK, non tutti i substrati di JNK che si legano al DNA sono fattori di trascrizione.

JNK può anche fosforilare proteine che partecipano nella riparazione del DNA (RAD18), replicazione del DNA (CDT1) o all'impacchettamento del DNA (mediante regolazione della sirtuina istone deacetilasi). Inoltre, JNK può anche influenzare l'espressione genica attraverso proteine fosforilatrici coinvolte nello splicing dell'mRNA e di altri componenti trasduzionali. Citoscheletro e proteine di trasporto intracellulare sono altri importanti substrati di JNK.

La fosforilazione di JNK può regolare il trasporto vescicolare (attraverso la fosforilazione di JIP1 e APP Amyloid precursor protein), nonché l'esocitosi di vescicole specializzate contenenti Glut4 (attraverso la fosforilazione insulino-stimolata di IRS1 e IRS2, Insuline receptor substrate1/2). Inoltre, JNK può, potenzialmente, controllare la famiglia di piccole proteine G, Rho, (tramite JIP3), la migrazione cellulare, in particolare nello sviluppo del SNC, e il processo di adesione cellula-cellula, giacché l’attivazione di JNK può portare a cambiamenti nella morfologia epiteliale, aderenze, e giunzioni strette tra le cellule. Le JNKs sono importanti anche per la promozione di apoptosi cellulare in specifici distretti attraverso la fosforilazione di proteine regolatrici dell'apoptosi della famiglia Bcl2. L'attivazione di JNK può anche influenzare altre vie di segnalazione, tra cui importante è la via del recettore dell'insulina, in cui la fosforilazione di JNK mediata da IRS1/2 inibisce l'azione dell'insulina. JNK può anche, più in generale antagonizzare la via di segnalazione Akt/PKB.

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Inoltre, JNK regola anche le funzioni sinaptiche e dei processi di apprendimento dei neuroni adulti attraverso i suoi substrati PSD-95 e GluR2 -/- GluR4, rispettivamente. Recenti ricerche sulle interazioni di JNK hanno scoperto molti altri potenziali substrati di JNK, compresi i componenti di segnalazione AMP ciclico (cAMP) -dipendente (ad esempio, PDE4B, AKAP6), più componenti della classica via di segnalazione Wnt (APC2), e Akt/PKB (INPP5F / SAC2), così come il complesso TNF-recettore (RIPK2) e la via JNK stessa (MEKK1, MLK2).1

Insieme, questi studi evidenziano la possibilità di parlare di un complesso di segnalazione e feedback mediati dalla fosforilazione JNK-dipendente dei suoi substrati.

■ BERSAGLI TERAPEUTICI DELLE JNKs

Gli studi che utilizzano topi knockout, cioè privi di una o più specifiche isoforme di JNK, hanno permesso di riconoscere il ruolo di ciascuna di esse nello sviluppo e nella progressione di varie patologie.2 Le JNKs sono infatti implicate in numerose malattie, da disturbi del SNC a infiammazione e tumori.

Malattie neurodegenerative

Tra le principali malattie neurodegenerative di particolare interesse nello studio delle JNK ritroviamo il morbo di Parkinson (PD), la malattia di Alzheimer (AD), la corea di Huntington (HD) e la sclerosi multipla (SM). Si tratta di sindromi complesse, nella cui evoluzione sono stati identificati molteplici bersagli.

Il ruolo della chinasi JNK3 in vari disturbi del SNC è stata valutata attraverso numerosi studi con topi knockout:Dagli studi condotti è stato possibile evidenziare

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che l’attività di JNK3 è tipicamente bassa a livello del distretto cerebrale, ma aumenta quando si verificano anomalie metaboliche coinvolgenti lo stesso. Per esempio, un incremento di attività di JNK3 è stata rilevata nell'analisi post-mortem di cervelli di pazienti affetti da AD. Uno studio di Yoon et coll. ha dimostrato che JNK3 modifica il precursore della proteina amiloide (APP) stimolando la produzione del peptide β-amiloide 42 (Aβ42) che rappresenta un elemento patologico determinante nell’AD.2

Di contro la deplezione genetica di JNK3 nei topi con AD familiare (FAD, Familial Alzheimer's disease) comporta una drastica riduzione del peptide Aβ42 e quindi del deposito di placche, nonché un aumento del numero di neuroni e un miglioramento cognitivo, fornendo così il giusto razionale all’inibizione di JNK3 nel trattamento di questa patologia.

JNK3 sembrerebbe associato al PD, una malattia cronica, progressiva, neurodegenerativa caratterizzata da disfunzioni motorie dovute alla perdita di neuroni dopaminergici. L'analisi post-mortem del cervello dei pazienti affetti da PD ha rilevato un’aumentata attività di JNK, con conseguenti alti livelli di c-Jun fosforilata rispetto ai pazienti di controllo sani.

Uno studio di Hunot et coll., prendendo come riferimento il modello di intossicazione acuta da 1-metil-4-fenil tetraidropiridina (MPTP), ha dimostrato che topi JNK3, JNK2, e soprattutto JNK3/2 knockout, erano resistenti all’azione di MPTP, diversamente dai topi JNK1 knockout e wild-tipe (privi di mutazioni).2 Inoltre, topi JNK3/JNK2 doppio knockout hanno mostrato una ridotta perdita di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNpc) e un aumento dei livelli di dopamina striatale rispetto ai topi wt trattati con MPTP.

La sopravvivenza dei neuroni dopaminergici nella SNpc dopo iniezione di 6-idrossidopamina (6-OHDA), un altro comune modello del PD, era significativamente più alta in topi JNK3 knockout rispetto a quelli wt. Un effetto non significativo di protezione su tali neuroni è stato osservato nello stesso studio utilizzando topi JNK2 knockout, mentre nel caso dei topi JNK1 knockout non si è riscontrato alcun effetto sulla sopravvivenza neuronale. Questi dati sollevano la questione se nel trattamento del PD sarebbe preferibile un inibitore JNK3 selettivo o un doppio inibitore JNK2/JNK3.

14 Infiammazione

La fosforilazione del fattore di trascrizione ATF-2 ad opera delle JNKs innesca il rilascio di citochine pro-infiammatorie, quali TNF-α e IL-1β. L'inibizione di JNK potrebbe essere una strategia promettente per il trattamento di malattie infiammatorie come l'artrite reumatoide (AR), le malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) e la psoriasi. In un modello murino di AR indotta da collagene utilizzando topi JNK2 knockout, il prodotto genico si è mostrato un fattore determinante nella progressiva degradazione della matrice, però l'assenza di tale isoforma ha presentato una scarsa influenza sulla flogosi e tumefazione delle zampe del modello animale analizzato.2 In un recente studio che prendeva in considerazione l'influenza delle JNK1 e JNK2 sull'artrite antigene-indotta, topi JNK1 deficienti, ma non JNK2 deficienti, hanno mostrato una riduzione di infiltrazione da parte delle cellule infiammatorie e un conseguente minor danno articolare.

Neoplasie

Enzimi a monte e substrati a valle di JNKs sono coinvolti nello sviluppo e nella progressione di diversi tipi di tumori. In particolare membri del complesso del fattore trascrizionale AP1 (Activator Protein 1), ATF-2 e c-Jun, sono implicati nella perdita della normale crescita cellulare e nella progressione tumorale. Studi effettuati su animali JNK1 o JNK2 knockout in diversi modelli neoplastici però hanno portato a risultati contraddittori; in alcuni casi, JNKs hanno mostrato attività di onco-soppressori, mentre altri studi supportano una funzione pro-oncogenica di JNKs.2 Topi JNK1 knockout erano più suscettibili ai tumori cutanei indotti dal promotore tumorale 12-O-tetradecanoilforbolo-13-acetato (TPA) rispetto ai topi wt. D'altra parte, topi JNK2 knockout mostravano più bassa molteplicità del papilloma indotto da TPA rispetto ai topi wt. Inoltre i papillomi su topi wt crescevano rapidamente ed erano ben vascolarizzati rispetto alle neoformazioni presenti nel gruppo di animali JNK2 knockout.2 Al contrario, in un modello murino di carcinoma del fegato indotto da dietilnitrosamina-fenobarbital, topi JNK1-knockout

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sviluppavano un numero sempre più piccolo di tumori epatici rispetto ai topi

JNK2-knockout e a quelli wt. Questi risultati sottolineano la necessità di sviluppare

inibitori selettivi di JNK isoforma specifici.

Altre malattie

La famiglia JNK è implicata in vari altri processi patologici, quali malattie cardiovascolari e disturbi metabolici.È stato dimostrato che la deplezione di JNK3 ha un reale effetto protettivo sul cervello dopo ischemia / ipossia cerebrale, suggerendo un possibile ruolo di JNK3 nell’ambito delle terapie neuroprotettive. Un più recente studio ha dimostrato che topi JNK1 -/- e JNK2 -/- sono meno soggetti ad apoptosi cellulare in vivo dopo il danno da ischemia / riperfusione, mentre uno studio analogo paradossalmente aveva concluso che l'inattivazione di JNK1 fosse protettiva contro l’apoptosi e l’infarto a seguito di ischemia prolungata ma non da ischemia a breve termine. Inoltre, è stata recentemente dimostrata una maggior resistenza al danno da ischemia / riperfusione nei ratti con blocco della segnalazione mitocondriale di JNKs e questo può quindi costituire un trattamento efficace per prevenire la morte dei cardiomiociti indotta da ischemia / riperfusione.2

Recentemente sono stati sviluppati inibitori di JNK per il trattamento dei pazienti con danno da ischemia / riperfusione, arruolati in un importane e lungo trial clinico.1

Ormai noto e inconfutabile il conivolgimento delle JNKs in disturbi metabolici sempre più diffusi nella nostra società, in primis il diabete. Studi su topi JNK1

knockout, con diabete mellito di tipo 2, hanno dimostrato che questi topi sono

protetti dallo sviluppo di obesità indotta dalla dieta ad alto contenuto di grassi, dalla glucosio intolleranza, e dalla insulino-resistenza.Al contrario, JNK2 svolge un ruolo centrale nel diabete mellito di tipo 1.2

Alcune serie di composti sono stati sviluppati contro tali patolgie, ma ad oggi non esistono studi clinici avviati. JNK1 e JNK2 hanno anche dimostrato di svolgere un ruolo importante nella fisiologia e patogenesi del fegato, regolando l'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS), la segnalazione dell'insulina e la carcinogenesi, attraverso molteplici vie.È stato dimostrato che il silenziamento di JNK1 previene la morte cellulare degli epatociti TNF-indotta, mentre il

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silenziamento di JNK2, impedisce il danno epatico acetaminofene-indotto. Il ruolo delle JNKs nel danno epatico da ischemia / riperfusione, nella fibrosi del fegato e nella rigenerazione di quest’organo è tuttora oggetto di discussione. L'implicazione delle JNKs nella morte delle cellule sensoriali ciliate presenti nella coclea dell’orecchio interno ha portato allo sviluppo di inibitori JNK per il trattamento della perdita dell'udito. L'inibitore peptidico di JNK XG-102 (AM-111, D-JNKI-1) prodotto da Xigen è stato ampiamente caratterizzato attraverso modelli animali.2 Ulteriori indicazioni riguardanti JNKs come potenziali bersagli terapeutici comprendono la fibrosi polmonare, l’arteriosclerosi e la neuroprotezione dopo lesione del midollo spinale.

Tuttavia, in tutte le patologie sopra discusse, il distinto ruolo di ogni isoforma di JNK non è ancora del tutto chiaro, essendo necessari studi in grado di sintetizzare e utilizzare inibitori selettivi per le diverse isoforme di JNKs.

■ INIBITORI DI JNKs

Negli ultimi anni le proteine chinasi hanno rappresentato un target farmacologico molto ambito. Attualmente oltre venticin que differenti inibitori di JNK sono stati introdotti nel mercato come anti-tumorali, con la sola eccezione dell’inibitore chinasico janus “tofacitinib”, oggi approvato in campo reumatologico per il trattamento dell’AR attiva moderata e grave in associazione a metotressato (MTX). La progettazione di inibitori chinasici selettivi è impegnativa a causa della somiglianza strutturale del sito di legame dell'ATP, target della maggior parte degli inibitori chinasici. L’azione di tali inibitori è però poco selettiva all'interno del kinome (insieme delle proteine chinasi nel genoma) e determina effetti collaterali tollerabili nell’ambito della terapia oncologica, ma non nelle applicazioni croniche, come ad esempio per disturbi infiammatori o metabolici. Inoltre, nel trattamento dei disturbi del SNC, sorge la necessità di rendere tali inibitori chinasici in grado di penetrare la barriera emato-encefalica (BEE) per poter agire sulle cellule

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bersaglio. L'inibizione delle JNKs è una strategia terapeutica interessante che recentemente è stata molto studiata sia da parte dell'industria farmaceutica che del mondo accademico.

Recentemente, si è conclusa la fase II dello studio dell’inibitore pan-JNK bentamapimod (PGL5001, AS602801; Fig. 6) per il trattamento dell’endometriosi.2

Bentamapimod è un inibitore di JNK ATP-competitivo, il cui sito di legame è un dominio altamente conservato tra le chinasi.

Figura 6: Struttura chimica di Bentamapimod/AS602801/PGL5001

Attualmente sono in corso studi in vitro e in vivo, (Masashi et coll.) sulla possibile attività antitumorale di AS602801. In vitro, AS602801 ha evidenziato citotossicità sia contro siero-colture di cellule tumorali non-staminali sia cellule staminali tumorali derivate da carcinoma del pancreas, carcinoma polmonare non a piccole cellule, carcinoma ovarico e glioblastoma a concentrazioni che non intaccano la vitalità dei fibroblasti umani normali. AS602801 ha mostrato effetto inibitorio anche contro il processo di auto-rinnovamento e contro la capacità del tumore di avviare a proliferazione le cellule staminali tumorali sopravvissute. Questi risultati fanno di AS602801 un possibile e promettente agente antitumorale, giustificando così la necessita di ulteriori indagini che ne confermino ulteriormente la validità di utilizzo in campo dell’oncologia medica.3

Anche l’inibitore di JNK, CC-930 ( tanzisertib, Fig.7) ha raggiunto la fase II di sperimentazione clinica per il trattamento di fibrosi polmonare idiopatica (IPF) e lupus eritematoso sistemico (LES).3

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Figura 7: Struttura chimica di CC-930, tanzisertib

L'inibitore peptidico di JNK XG-102, che sembra legarsi a proteine strutturali e substrati a valle, ha recentemente completato la fase II di sperimentazione con applicazione sia in pazienti affetti da perdita dell'udito neurosensoriale acuta, sia nel terapia dei pazienti post-colpo apoplettico (ictus),4 ed è attualmente oggetto di uno studio in corso in campo oculistico da parte della Xigen.5 (Fig. 8)

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Figura 8: XG-102 sviluppi clinici

Negli anni 2011-2012, Xigen ha completato la fase I in Svizzera, nonché un trial clinico di fase IB in Francia sul composto XG-102. Nel 2013 la fase II di studio multicentrico nel campo della oftalmologia è stata completata in Europa.

Nel gennaio 2017 si è concluso lo studio di fase III, avviato negli Stati Uniti due anni prima, riguardante la riduzione dell’infiammazione post-intervento chirurgico alla cataratta; i risultati riportati sono stati che alla dose di 900 µg per via sub-congiuntivale, XG-102 riduce infiammazione e dolore.(clinicaltrials.gov) In parallelo, un trial clinico multicentrico di fase II con XG-102 è stato completato in Europa dalla Partner Auris Medical, una società con sede in Svizzera.5

Il composto SP600125 rappresenta il primo inibitore di JNK ATP-competitivo. Il suddetto composto (Fig. 9) è stato ampiamente studiato, con l'obiettivo di chiarire il ruolo di JNKs in diverse malattie.6 Questo inibitore viene soprattutto utilizzato come composto di riferimento nei saggi biologici di JNK.

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Figura 9: Struttura di pan-JNK inibitore SP600125

Diamminopurine

Una classe più recente di JNK inibitori è stata proposta nel 2012 dai ricercatori di Celgene. Krenitsky et coll. hanno sviluppato le 2,8-diaminopurine trisostituite come JNK inibitori per la prevenzione di ischemia / riperfusione e per il trattamento della fibrosi polmonare idiopatica (IPF).7 Partendo da uno screening iniziale (high throughput screening (HTS)) di una serie di composti allo scopo di identificare un composto “hit”, è stato scelto il composto 3, che però ha mostrato scarsa selettività chinasica. Il composto 3 è stato opportunamente modificato a livello dei residui in posizione C2, C8, e N9 della purina ottenendo diversi inibitori di JNK con selettività fino a 500 volte superiore contro p38α MAP chinasi (Fig. 10).7

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Il composto hit 3, è stato co-cristallizzato con JNK3 al fine di approfondire meglio la modalità di legame di questa classe di sostanze (Fig. 11a). Il sostituente eteroarilico lega la regione a cerniera della chinasi tramite un legame a idrogeno bidentato che coinvolge l'N in 3 della purina e l’NH del residuo Leu148, e anche il sostituente amminico sul C2 e il carbonile di Met149. La porzione ciclopentilica occupa la tasca del ribosio, mentre il residuo di anilina in C2, con il sostituente metossilico si inserisce nella regione idrofobica II.8 Il frammento anilinico in C8 occupa la tasca idrofoba posteriore (regione idrofobica I), formando un legame a idrogeno con la Lys93. È interessante notare che il residuo gatekeeper di Met146 viene spostato di 2.3 Å dalla sua posizione nella apo-struttura di JNK3, permettendo alla porzione anilinica in C8 di penetrare la regione idrofobica I. Questa tasca posteriore viene spesso definita "tasca selettiva" perché si differenzia significativamente tra chinasi (anche all'interno della altamente conservata famiglia JNK), e quindi è stata oggetto di studio.

Figura 11: a)Sovrapposizione della struttura cristallina ai raggi X del composto 3 in complesso con JNK(PDB code(verde pallido) e apo-JNK3 (,blu)) b)Sovrapposizione della

struttura cristallina ai raggi X del composto 1 in complesso con JNK3(salmone)

La modifica più importante per aumentare la selettività di questi composti è stata quella di sostituire la porzione anilinica in C2 con una cicloalchilammina. La stabilità metabolica potrebbe essere aumentata con l'introduzione di ulteriori atomi di fluoro ai residui anilinici in C8, che non hanno un grande impatto sulla potenza e selettività nei confronti di JNKs. Ulteriori studi di SAR hanno rivelato che sostituenti alchilici ciclici sull’N9 sono più adatti.

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Il composto 4 (CC-359), relativamente agli studi di prevenzione dal danno da ischemia / riperfusione, ha mostrato di inibire tutte le isoforme di JNK pur essendo circa 10 volte più selettivo contro p38α MAP chinasi (Fig. 10). Il composto inibisce la fosforilazione cellulare di c-Jun e il rilascio di TNF-α indotto dal lipopolisaccaride (LPS), nel sangue intero di ratto (IC50 = 1.5 µM). Il composto 4 ha esibito una buona efficacia in un modello murino di ischemia / riperfusione, alla dose endovena di 3 e 10 mg/kg. Mentre il profilo farmacocinetico del composto 4 nei cani e nei ratti non era particolarmente favorevole, si è rivelato adeguato nelle scimmie, mostrando una lenta clearance iv di 5 ml min-1 kg-1 e un tempo di dimezzamento di 37 min alla dose di un 1 mg/kg. Inoltre il composto 4 mostrando di non inibire il citocromo P450 (CYP) a 30 µM e inibendo moderatamente il canale hERG (59% a 10 μM), è ben tollerato in vivo (ratti) e pertanto può essere un buon candidato per l’uso clinico. Tuttavia, ad oggi non è stato pubblicato alcun studio clinico.

Il secondo studio degli stessi autori si focalizza sullo sviluppo di inibitori JNK antifibrotici. Il composto 1 (CC-930) presenta la 2,4,6-trifluoroanilina nella porzione purinica C8 e la trans-4-idrossicicloesilammina in posizione C2,inoltre la porzione ciclopentilica in N9 del composto 3 è stata sostituita da un residuo chirale 3-tetraidrofuranilico. L'enantiomero S presenta maggiore affinità per JNK2/3, moderata selettività contro JNK1, e ottima selettività contro p38α MAP chinasi.

L'inibitore 1 è stato cristallizzato in un complesso con JNK3 mostrando una simile modalità di legame del composto 3. (Fig. 11)

La differenza di potenza e selettività tra i due enantiomeri è prevalentemente causata da interazioni elettrostatiche. La frazione tetraidrofuranile altera le proprietà fisico-chimiche del composto, portando ad un aumento della potenza. Nonostante l'elevata clearance nei ratti, il composto 1 era lentamente metabolizzato in cani e scimmie e mostrava un profilo complessivo farmacocinetico favorevole. La selettività all'interno di un gruppo di 240 chinasi è stata apprezzabile, e EGFR (IC50 = 0.38 µM) e ERK1(extracellular-regulated kinase 1) (IC50 = 0.48 µM) sono state le uniche chinasi con un valore IC50 al di sotto 3 µM, senza coinvolgere atri recettori o enzimi non chinasici.

Due studi clinici di fase II sono stati avviati nel 2011 in pazienti con IPF (fibrosi polmonare idiopatica) e lupus eritematoso discoide (DLE), ma sono state concluse

23

precocemente a causa di un inadeguato rapporto beneficio / rischio.9 I composti sviluppati da Celgene non erano destinati a raggiungere il SNC e, di conseguenza, la penetrazione della barriera emato-encefalica non è stata valutata, Le proprietà fisico-chimiche di tali molecole suggeriscono una trascurabile penetrazione nel SNC, tuttavia, non può essere escluso che l'inibizione centrale di JNK potrebbe parzialmente essere responsabile del profilo di effetti collaterali sfavorevoli che ha portato a sospendere questi studi clinici.

Azaindoli

Una serie di derivati 7-azaindolici sono stati riportati da Graczyk et coll. e da Eisai, come pan-JNK inibitori in un recente lavoro e in diversi brevetti.2 L'inibitore prototipo 5 (ER-358063) era potente, ma moderatamente selettivo (Fig. 12).

Figura 12: Strutture e valori IC50 di JNK inibitori 7-azaindolici

Saggiando il composto 5 alla dose di 20 mg/kg al giorno, in un modello murino di encefalomielite sperimentale autoimmune (EAE), modello in vivo per MS (sclerosi multipla), è stata osservata una protezione contro la perdita di sostanza bianca e neuroni del midollo spinale lombare. Tuttavia, a causa degli effetti collaterali ad esso associati, sono stati valutati altri composti, meno potenti ma più selettivi, come i composti 6 (ER-409903) e 7 (ER-417258).

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Questi due derivati, hanno mostrato di possedere un profilo farmacodinamico favorevole, buona biodisponibilità orale e buone capacità di penetrazione cerebrale in aggiunta ad un’elevata selettività, in uno screening di 270 recettori. Nei topi, i composti 6 e 7 hanno avuto efficacia simile al composto 5, e un miglioramento in termini di effetti collaterali.

Pirazoliluree

Un importante contributo nel campo degli inibitori di JNK, è stato apportato dai gruppi di ricerca di LoGrasso e Kamenecka presso la Scripps Research Institute. Con sforzi congiunti, questi gruppi di ricerca hanno sviluppato diverse serie di inibitori JNK con distinti profili di selettività, principalmente focalizzati ad una applicazione nel SNC.

Sono stati identificati inibitori molto potenti a struttura pirazolil-ureica in grado di penetrare la BEE. Il lavoro iniziale si è concentrato sullo sviluppo di indazolo-derivati per semplificazione del composto 8 (SR-3737) presente in letteratura10 (Fig. 13)

Figura 13: Struttura dei derivati 8,9 e 10

Il composto 8 è in grado di inibire JNK1 e JNK3 con valori di IC50 di 73 e 9 nM, rispettivamente, ma soffre di scarsa capacità di penetrazione della BEE.

Le modifiche principali hanno riguardato l’anilide e l’anilina presenti nella molecola

8. In generale, derivati N-arilammidici riescono con difficoltà a penetrare nel SNC.

L'introduzione di una catena ammidica alifatica come nei composti 9 e 10, (Fig. 13) da una parte ha portato ad un miglioramento delle capacità penetrative della BEE, registrando elevate concentrazioni del farmaco nel cervello e nel plasma,

25

dall’altra parte ha provocato una diminuzione dell'attività inibitoria rispetto al composto 8.

I composti 9 e 10, sono stati ulteriormente testati come inibitori della fosforilazione di c-Jun in un modello cellulare in vitro (cellule INS-1). Questi composti hanno mostrato una modesta potenza (ad esempio per il composto 9, IC50 = 5,3 µM). In questa serie, il composto 10 ha presentato il miglior profilo farmacocinetico nel ratto, con un assorbimento orale moderato (F=27%), una breve emivita (3.3 minuti) e una clearance di 25 mL min-1 kg-1 (dosaggio di 1 mg / kg, iv e 2 mg / kg po).

Poiché nessuno dei composti mostrati (8,9,10) presentava sufficiente selettività verso p38 MAP chinasi, il nucleo indazolico è stato sostituito con un sistema pirazolil-ureico. (Fig.14).

Figura 14: Dall'indazolo 8 alle pirazoliluree 11 e 12. Strutture e valori di IC50

La logica alla base di questa strategia sintetica si basa sul presupposto che data la natura dei legami sp2 dell'urea siano in grado di mantenere una disposizione planare simile a quella degli indazoli mantenendo simili modalità di legame e affinità. All'interno di questa serie di pirazolil-uree, il composto 11 (SR-3576) era particolarmente potente e mostrava una selettività verso p38 MAPK, 2800 volte più elevata.Nonostante l'ottima potenza biochimica, il composto era un moderato inibitore della fosforilazione di c-Jun nelle cellule INS-1 (IC50 = 1.3 µM), presumibilmente a causa della insufficiente penetrazione nelle cellule. Per approfondire gli studi su questi composti sono stati analizzati ai raggi X i complessi

26

cristallini dei composti 8 e 12 con la chinasi JNK3.10 Entrambi gli inibitori erano ancorati alla regione cerniera (hinge region) attraverso due legami idrogeno. In modo simile alle diamminopurine trisostituite, uno spostamento a livello del

gatekeeper della Met146, consentiva al residuo anilinico di occupare la tasca

posteriore idrofobica. Gli autori sostengono che questa modalità di legame che induce un adattamento automatico, sia responsabile della moderata selettività verso JNK3 di entrambi gli inibitori, poiché la regione idrofobica I è costituita da amminoacidi leggermente diversi in JNK1 rispetto a JNK3. Tuttavia, non si riesce ancora a spiegare esattamente la selettività contro p38 MAP chinasi.

Amminopirimidine e strutture correlate

Kamenecka et coll hanno progettato un’ampia serie di inibitori di JNK a struttura 2-amminopirimidinica,11 correlati strutturalmente all'inibitore chinasico Imatinib.Studi preliminari di queste amminopirimidine come inibitori JNK per il trattamento di disturbi infiammatori e del diabete mellito di tipo 2, sono stati riportati da ricercatori dell’UCB Celltech12

e della Pfizer.2 Anche se sono risultati essere inibitori di JNK molto potenti, presentavano scarsa selettività verso la chinasi ciclina dipendente (CDK2) e verso le altre chinasi. (Fig.15)

27

Da un successivo e ampio studio di SAR, sono stati presi in considerazione 12 derivati con alta selettività verso p38 MAP chinasi.10 Il composto 14, più potente, presentava valori di IC50 nell’ordine del basso nanomolare verso JNK1 e JNK3 pur essendo praticamente inattivo sulla p38 MAP chinasi (JNK2 non è stato valutato).10 Nonostante fosse abbastanza potente nelle cellule INS-1, il composto

14 penetrava con difficoltà nel cervello probabilmente a causa della sua elevata

polarità.Il composto 15 (SR-3562) si è rivelato meno potente nei test in vitro, ma ha mostrato una maggiore capacità penetrativa nelle cellule portando quindi ad una più forte inibizione della fosforilazione di c-Jun.10 Il composto, inoltre, ha presentato una buona biodisponibilità orale nei ratti (F = 45%) e un buon grado di penetrazione della BEE, come indicato dal rapporto cervello / plasma pari al 75%.

Il legame alle proteine plasmatiche nel topo, ratto, cane, scimmia e negli umani è risultato essere elevato (92-98%), e in più il composto ha mostrato una considerevole stabilità nei microsomi epatici. Studi in vivo sui ratti hanno indicato un profilo farmacocinetico favorevole con un'emivita di 2.4 h e una clearance di 20 mL min-1 kg-1 (1 mg / kg, iv). Inoltre, il composto 15 ha dimostrato inibire la produzione di ROS nelle cellule INS-1, con una potenza nell’ordine del subnanomolare. La limitazione principale del composto 15 è l'inibizione di numerosi enzimi CYP450; ad esempio, CYP450 2C9, 3A4, e 1A2 che sono stati inibiti tra il 70% e 90% alla concentrazione dell'inibitore di 10 µM. La struttura cristallina ai raggi X di 15 legato a JNK3 ha rivelato un modo di legame inaspettato, basato esclusivamente su interazioni idrofobiche (Fig. 16a). Il composto è legato a JNK3 attraverso una disposizione planare dei cicli aromatici, che non formano alcun legame ad idrogeno con l'enzima. L'inibitore non ha indotto uno spostamento della Met146 nella catena laterale come osservato in altre strutture cristalline di JNK.Al contrario, amminopirimidine analoghe, progettate da Alam et coll., formano un legame ad idrogeno bidentato tra il nucleo 2-amminopirimidinico e la regione cerniera della chinasi (Fig. 16c) .

28

Figura 16: a)Sovrapposizione della struttura cristallina del composto 15 legato a JNK3. b) e c)Confronto del farmacoforo di 15 e della struttura correlata dell' inibitore di Alam et al. Mentre il 15 si lega esclusivamente attraverso interazioni idrofobiche, il composto di Alam

et al. è ancorato alla chinasi da quattro legami idrogeno, due dei quali comportano un ponte amminopirimidinico.

Inoltre, un altro legame idrogeno si instaura tra l’NH dell’Asn152 e il carbonile dell'urea del composto, sommato al legame a idrogeno acqua-mediato tra l’NH indolico e la catena laterale della Lys93. A differenza della serie di Kamenecka et coll., queste 2-amminopirimidine analoghe causano un movimento del residuo

gatekeeper pur non facendo cadere il loop ricco di glicina verso la fessura di

legame dell'ATP.12

Altro derivato amminopirimidinico interessante è rappresentato dal composto 16 (SR-3306), che è stato sottoposto a studi in vitro e in vivo per PD. 13 (Fig. 17)

29

Figura 17: Strutture e IC50 di amminopirimidine JNK inibitrici,valutate in modelli animali per neurodegenerazione e danno da ischemia/riperfusione

Il composto 16 in test in vitro, ha inibito le JNKs con potenza simile al derivato 15 e ha mantenuto un’elevata selettività verso p38 MAP chinasi, anche se circa 4 volte meno potente in un ambiente cellulare. L'inibitore 16 è stato testato a 3 µM contro un gruppo di 347 chinasi14 e ha dimostrato di essere moderatamente selettivo, andando ad interagire solo con trentacinque delle chinasi (nessun altro membro della famiglia MAP chinasi tranne JNK1 e JNK3), inoltre quattro delle chinasi testate (KIT, KIT V559D, PDGFR-β, TYK2) hanno mostrato valori di Kd sotto 1 µM.

In particolare il composto 16 possedeva valori di IC50 > 30 µM per il canale hERG e > 50 µM contro nove enzimi CYP testati (1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 e 3A4).

Anche l’analogo 17 (SR-2502) con potenza simile, risultava essere selettivo verso p38 MAP chinasi in un pannello di 67 recettori, canali ionici, e trasportatori (MDS

Pharma Lead Profiling Screen). Questi risultati confermano che questa classe di

composti è altamente selettiva. Solo i recettori dell'adenosina A2A e A3 hanno mostrato significativa inibizione a 10 µM (55% e 93%). Nella serie di composti esaminati, il derivato 16 è stato scelto come candidato per ulteriori sviluppi. Esso

30

ha mostrato una buona distribuzione cervello / plasma del 30-40%, e un buon profilo farmacodinamico, simile al composto 17. Inoltre sembra possedere un effetto neuroprotettivo, contro la morte cellulare indotta da metil-fenil-tetraidropiridinio (MPP+) nei neuroni dopaminergici primari, esibendo una neuroprotezione superiore al 90% ad una concentrazione di 300 nM.

L’inibitore 16, somministrato alla dose di 30 mg/kg, per via orale, in topi trattati con MPTP, è in grado di proteggere i neuroni dopaminergici nella SNpc. Un secondo studio in vivo effettuato con il composto 16 è andato a studiare il miglioramento comportamentale del topo nel modello di PD della 6-idrossidopamina (6-OHDA). Mentre non è stata rilevata nessuna protezione dei terminali dopaminergici nello striato del ratto utilizzando il modello MPTP, nel modello 6-OHDA (10 mg kg-1 giorno-1) si osservava la protezione sia dei neuroni dopaminergici nella SNpc che delle loro proiezioni nello striato. La protezione di circa il 30% dei neuroni dopaminergici nella SNpc determinava una riduzione del 90% del deficit comportamentale. Recentemente, un terzo studio in vivo ha dimostrato che 16, protegge efficacemente contro il danno da ischemia / riperfusione nei ratti, riducendo il volume dell'infarto del 34% alla dose moderata di 5 mg/kg.15 Successivamente la serie 2-amminopirimidinica è stata integrata con una libreria di 2-ammino-4-(pirazolil)piridine, che presentavano una buona farmacocinetica e buona capacità penetrativa del cervello. Mentre composti senza sostituenti sul pirazolo in posizione C4 (es, 18) erano selettivi contro p38 MAP chinasi, l’introduzione di una porzione 4-fluorofenilica (19) migliora significativamente l'inibizione di JNK, riducendo la selettività su p38 MAP chinasi (Fig. 18).16

31

Figura 18: Strutture,valori IC50 e dati PK di amminopiridine

A causa della somiglianza strutturale tra 19 e gli inibitori p38α MAP chinasi a struttura piridinilimidazolica, la diminuzione della selettività era prevedibile. La distribuzione cervello/plasma del composto 19 rispetto ai derivati 15 e 16, è sfavorevole, e anche il profilo complessivo di farmacocinetica è peggiore. Se però si guarda il composto 18, questo riesce meglio a penetrare la BEE e mostra un profilo di farmacocinetica migliore, rendendo, comunque questa classe di composti un valido punto di partenza per un'ulteriore ottimizzazione.

Inibitori strutturalmente simili basati sullo scheletro delle 2-amminochinazoline sono stati proposti da He et al.17 Questi composti sono stati progettati come ibridi combinando la porzione 2-amminopirimidinica (15) e quella 3-amminoisochinolinica (20). (Fig. 19)18

32

Figura 19: Amminochinazoline JNK inibitrici come ibridi di amminopirimidine e amminoisochinoline.

Il composto principale 21 è un potente inibitore di JNK1/3 in vitro, inibisce moderatamente la fosforilazione di c-Jun nelle cellule INS-1 e ha mostrato un buon rapporto cervello / plasma del 40%.17 Purtroppo, la selettività contro p38 MAP chinasi non è stata valutata. LA SAR di questa classe di composti ha rivelato che l'introduzione di un sostituente sul nucleo chinazolinico in posizione orto al pirazolo, determina una maggiore potenza e per alcuni composti migliora il rapporto cervello / plasma. Questo potrebbe essere spiegato, ipotizzando una modifica torsionale dell'anello pirazolico causato dal sostituente orto, insieme ad un aumento della lipofilia. Tra le molecole presentate in questo studio, i composti

33

Figura 20: Strutture, valori IC50 e dati di PK di composti amminochinazolinici JNK inibitori

Il composto 24, nonostante sia risultato meno attivo, grazie alla sua buona distribuzione nel SNC, è stato ulteriormente studiato.17 Ha mostrato nei ratti un buon profilo farmacodinamico con un'emivita di 3 h ed una biodisponibilità orale del 19%.

Song et coll hanno proposto una classe di composti a struttura piridinica e pirimidinica. A partire dal composto 25, le modifiche iniziali si sono concentrate sui sostituenti in posizione C5 dell’anello piridinico e nella porzione fenossi (Fig. 21).

34

Figura 21: Strutture e valori di IC50 della fenossianilinopiridina e della fenossianilinopirimidina

Mentre un atomo di cloro (26) o un gruppo trifluorometile (27) si sono rivelati i sostituenti più favorevoli della piridina in C5, residui alcossi erano più adatti per la posizione para del gruppo fenossi. L'inserimento di un atomo di azoto nella porzione piridinica del composto 26 ha portato alla pirimidina 28, il più potente analogo all'interno di questa serie di composti. Questi inibitori dovrebbero essere in grado di legarsi a JNK3 in maniera simile ai derivati 4-anilinopirimidinici ma né dati cristallografici né modelli molecolari hanno confermato questa ipotesi. Tuttavia, è probabile che il gruppo carbossammidico e l'adiacente diarilamminico adottino una conformazione periplanare, che è stabilizzata da un legame idrogeno intramolecolare. I composti 26 e 27 hanno mostrato una buona biodisponibilità orale e un buon rapporto cervello/plasma (75% e 52% per 26 e 27 rispettivamente). Il composto con il profilo farmacodinamico più favorevole era il

27 (t1/2 = 1 h e F = 79% nei ratti), mentre il 28 ha mostrato uno scarso profilo

farmacodinamico in vivo. In uno studio di follow-up su inibitori di JNK2 per il trattamento del glioblastoma multiforme (GBM), la classe delle 2,4-dianilinopirimidine è risultata estremamente potente.19 Il composto principale 29 è stato ampiamente modificato per ottenere analoghi più potenti, quali i composti 30 e 31 (Fig. 22).20

35

Figura 22: Strutture e valori IC50 di inibitori di JNK a struttura dianilinopiridinica e dianilinopirimidinica

La catena laterale morfolinica presente in questi composti è stata successivamente sostituita con un pirrolidone dando il composto 32, uno degli inibitori di JNK più attivi in vitro.19 Purtroppo, il composto 32 possedeva un basso profilo farmacodinamico. La migliore penetrazione a livello della BEE è stata osservata per il composto 30 (rapporto cervello / plasma del 100%), mentre il 31 era molto potente nelle cellule e aveva il profilo farmacocinetico globale più favorevole (t1 / 2 = 1 h e F = 30% nel ratto, B / P = 17% nei topi).

Un'altra serie di amminopirimidine è stata recentemente riportata da ricercatori della Roche (Fig. 23).21

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Figura 23: Struttura e dati biologici di attività delle amminopirimidine (Roche)

Poiché sia JNK1 che JNK2 potrebbero essere importanti per la funzione di immuno-modulazione, i ricercatori hanno progettato inibitori JNK1/JNK2 per il potenziale trattamento dell’artrite reumatoide (RA). Il composto 33 ha mostrato una certa selettività per JNKs nei confronti di CDKs e nessuna inibizione di p38α MAP chinasi. La fosforilazione di c-Jun nelle linee cellulari di condrosarcoma SW1353, è stata inibita dal composto 33 con valori nel range del basso micromolare.21 Alcune benzotriazolil-amminopirimidine hanno mostrato un'alta affinità per enzimi del citocromo P450. La sostituzione del gruppo 1,2,3-benzotriazolico con un anello indazolico o indolico ha portato ad un miglioramento in termini di selettività e nessuna influenza sul CYP. All'interno della serie indazolica, la potenza viene incrementata dall' introduzione di sostituenti in posizione 4, come nel composto 34.21 I dati della cristallografia di 34 complessato con JNK1 hanno rivelato che il raggruppamento metilsulfonilpropossilico si inserisce correttamente lo spazio sottostante il loop ricco di glicina. Ogni atomo di ossigeno del solfone è coinvolto nel legame ad idrogeno con Lys55 e Gln37, e la parte amminopirimidinica forma un legame a idrogeno bidentato nella regione cerniera.

37

Relativamente alla serie delle amminopirimidine sostituite da gruppi indolici, a livello del C4 del cicloesano è stata introdotta una porzione ammidica. Composti sostituiti sull’ammide con gruppi alcolici, come nel caso del composto 35, hanno mostrato una buona potenza cellulare e stabilità metabolica. Uno screening del composto 35 su un pannello di 317 chinasi ha rivelato selettività moderata (43 valori di Kd <10 µM). Tuttavia, la selettività contro p38α e p38β MAP chinasi era eccellente. Il composto 35 ha mostrato una bassa clearance in vivo e una ragionevole permeabilità intrinseca, ma un alto rapporto di efflusso del trasportatore.

Piridinilisossazoli

Un’ altra classe di composti interessante è quella dei 3-piridinilisossazoli, sintetizzati da He et coll. che sono risultati essere inibitori di JNK1/3 con buona selettività contro p38 MAP chinasi e profilo farmacocinetico moderato.22 Inizialmente, partendo dalla serie di 4-pirimidinilpirazoli , 36 è stata utilizzata come modello per progettare il piridinilpirazolo 37 (Fig. 24).22

Figura 24: Piridinilisossazoli e pirimidinpirazoli inibitori di JNK

Il nucleo del pirazolo è stato successivamente sostituito dall’isossazolo, dando il composto 38.22

38

All'interno di questa serie di composti, il 39 recante un sostituente idrossilico in posizione C5 dell'anello isossazolico, è risultato il più potente inibitore di JNK3 con selettività moderata contro JNK1 e p38 MAP chinasi (Fig. 25).22

Figura 25: Strutture e valori di IC 50 di piridinilisossazoli e isossaloni,inibitori di JNK

Purtroppo, questo derivato era poco stabile nei microsomi epatici umani.

Altri tipi di sostituzioni sugli anelli dell’isossazolo e della piridina hanno portato ad inibitori di JNK1/3 con potenze nell’ordine del nanomolare e con una selettività più pronunciata contro p38 MAP chinasi, come mostrato dai composti 40 e 41.22 Mentre 41 era più potente in vitro, 40 aveva un profilo farmacodinamico più favorevole (t1 / 2 = 1,5 h; F = 37%), ma con un peggior rapporto cervello / plasma (4.5%).

Triazoloni

I ricercatori della Elan Pharmaceuticals hanno progettato dei derivati 1,2,4-triazolonici come inibitori di JNK2 e JNK3.23 Il composto 42, ottenuto da uno screening HTS (screening ad alto rendimento), è stato utilizzato come composto principale per studi di ottimizzazione (Fig. 26).23

39

Figura 26: Strutture e valori di IC50 dei triazoloni inibitori di JNK e del composto 42

Il composto 42 possiede debole attività inibitoria contro tutte le JNKs. Modifiche a livello del nucleo triazolonico e della porzione naftilica, nonché l’introduzione di porzione amminica alla piridina in posizione C2, hanno portato al derivato 43.23 Quest’ultimo inibisce JNK2 e JNK3 nel range del nanomolare con una moderata selettività su JNK1, senza alcun effetto su ERK2 e p38α MAP chinasi e altre 38 proteine chinasi. La N-sostituzione del nucleo triazolonico era ben tollerata e non influenzava il profilo di selettività, inoltre, portava ad un miglioramento della permeabilità e dell’attività cellulare. Nel test di neurotossicità nella corticale neuronale β-amiloide umana, il composto 44a ha mostrato un valore EC50 di 12 µM,24 mentre il composto 43 non ha mostrato alcuna attività (EC50>50 µM).23 L'atomo di azoto piridinico e la funzione ammino piridinica nel C2 sono coinvolti in un legame a idrogeno con Met149, inoltre il naftalene si inserisce saldamente nella regione idrofobica I e interagisce tramite interazione zolfo- π con la catena laterale della Met146. Questo composto è risultato molto selettivo in quanto grazie alla porzione ingombrante del naftile, non riesce ad interagire con le altre chinasi che presentano una tasca più piccola, infatti JNK2 e JNK3 possiedono una Leu144 nella regione idrofobica I, mentre JNK1 ha una più ingombrante Ile106, quindi meglio tollerata dagli inibitori 42-44, che risultano avere selettività moderata rispetto JNK1.

40 Benzimidazoli

Una serie di 1-eteroaril-2-aril-1H-benzimidazoli-derivati, sono stati riportati da Kim et coll, come inibitori di JNK3.25 Il composto 45, possiede una moderata azione inibitoria di JNK2 e JNK3 e una buona selettività contro 50 chinasi ed è stato individuato come composto principale di questa serie di composti.(Fig. 27).

Figura 27: Strutture e valori di Kd di composti benzimidazolici JNK inibitori

Studi di docking (tecnica che permette lo studio delle interazioni tra due molecole)26 del composto 45 suggeriscono una modalità di legame in cui la porzione 3-idrossifenil si inserisce nella regione idrofobica I. L'atomo di azoto piridinico e la funzione ammino piridinica sul C2 interagiscono con un legame a idrogeno bidentato con la Met149 nella regione cerniera, l'anello della piperidina si lega, invece, alla regione idrofobica II. Modifiche strutturali sul composto 45, come la sostituzione del fenolo con un più ingombrante 2-naftile, l’introduzione di un gruppo ossidrilico nel raggruppamento ammino-benzimidazolico, acilazione dell'anello di piperidina e sostituzione della piridina con un anello pirimidinico

41

hanno portato ad un potente inibitore di JNK3, il composto 46, che ha mostrato un valore di Kd nel range del nanomolare.25 L'inibitore 46 blocca quasi completamente la fosforilazione di c-Jun nelle cellule SH-SY5Y del neuroblastoma umano ad una concentrazione di 10 µM e inibisce l'espressione di mRNA del TNF-α in queste cellule con un valore IC50 di 1.09 µM.

Piperazinammidi

Shin et coll. hanno progettato la sintesi di una serie di piperazinammidi, che sono risultati essere inibitori di JNK1 e JNK3.27 Il composto leader è stato il composto

47 (Fig. 28), cheè risultato essere un inibitore di JNK moderatamente competitivo con ATP con buona selettività contro p38α MAP chinasi.27 _{L’introduzione di}

piccole catene laterali alchiliche insature nella posizione N4 della piperazina, come per esempio l’allile (composto 48) o il propargile (composto 49), hanno migliorato l'attività inibitoria. 27

Figura 28: Strutture e IC50 delle piperazinammidi

La struttura cristallina a raggi X dell'inibitore 49 legato nel sito di legame dell'ATP di JNK3, ha rivelato che l'inibitore si lega con entrambi gli anelli arilici e il legame

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ammidico è disposto in maniera coplanare. L'orientamento planare può essere stabilizzato da un legame a idrogeno intramolecolare formato tra l’NH ammidico e l’O del furano. La porzione 5-bromofuranil si trova in corrispondenza della regione di legame dell'adenina. L'anello della piperazina è disposto perpendicolarmente al resto della molecola e forma legami di van der Waals con Ile70 e Val78 nonché con Val196 e Leu206, stabilizzando il p-loop. Il furano interagisce con legami di van der Waals con una parte della catena della Met146. L'atomo di ossigeno dell'ammide interagisce con l’idrogeno legato all’ NH della Met149 situato nella regione cerniera.

Ulteriori modifiche hanno rivelato che piccoli sostituenti in posizione C3 del fenile come Cl, CH3, e F sono meglio tollerati da entrambi gli enzimi rispetto a quelli più

grandi. La sostituzione del furano, raggruppamento ricco di elettroni, con eterocicli a cinque o sei termini ha portato ad una diminuzione sostanziale nell'attività confermando l’importanza del legame a idrogeno intramolecolare. I più potenti inibitori di questa serie, composti 50 e 51,27 contengono una piperidina al posto della piperazina nella posizione C2 del fenile. (Fig. 29)

Alcune molecole di questa serie sono state sottoposte a screening per la loro capacità di inibire la fosforilazione di c-Jun attraverso un ELISA-test. Tuttavia, questi composti hanno mostrato un notevole calo dell'attività (fino a 40 volte) nell’ambiente cellulare.

43 Inibitori a struttura tiofenica

Altri inibitori di JNK, sono quelli a struttura tiofenica, riportati dai ricercatori della Elan Pharmaceuticals. Il composto principale di questa serie è il composto 52.28 Dagli studi cristallografici risulta che l'ossigeno carbonilico del gruppo ammidico interagisce con l'NH della Met149 tramite legami a idrogeno, che si traduce in un orientamento planare della parte centrale della molecola. La porzione tiofenica è orientata quasi perpendicolarmente al resto della molecola. Opportune manipolazioni sulla porzione tiofenica e su quella esterea hanno portato ad inibitori pan-JNK molto potenti con valori di IC50 nel range del nanomolare, come nel caso dell’inibitore 53.29

(Fig. 30)

Figura 30: Strutture e valori di IC50 degli inibitori di JNK a struttura tiofenica

Uno studio di SAR ha indicato che anelli biciclici, quindi più grandi, erano tollerati nella posizione 2-acetilica. La sostituzione della funzione esterea con altri gruppi di dimensioni simili in grado di formare un legame a idrogeno intramolecolare con

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l'NH ammidico, determinavano perdita di attività, evidenziando l'importanza dell'orientamento planare del legame per l’interazione con JNK. La sostituzione della funzione esterea con anelli eterociclici a cinque membri come un triazolo, in grado di agire come un accettore di legame a idrogeno per l’NH dell'ammide secondaria era tollerata. La presenza di un anello eterociclico a cinque o a sei termini (etero), al posto della porzione N-tienilica, ha comportato una netta diminuzione di potenza, tranne nel caso dell’anello fenilico isosterico. La posizione dell'atomo di zolfo in questo anello tiofenico ha solo una lieve influenza sull'attività inibitoria, pertanto, è stato fatto un derivato con un anello tiofenico trisostituito e con l'atomo di zolfo spostato in posizione orto rispetto all’ammide. Piccoli sostituenti, come il metile o il gruppo ciano, come nel composto 53, sono ben tollerati, mentre sostituenti più grandi hanno determinato una drastica riduzione dell'attività. La struttura cristallina di 53 con JNK3 ha evidenziato le stesse interazioni fondamentali come per il composto 52. L'ossigeno carbonilico interagisce tramite legame a idrogeno con l'NH di Met149 e l'NH dell'ammide forma un legame ad idrogeno intramolecolare con l'anello triazolico, risultando in un orientamento planare di questa parte della molecola. Il gruppo ciano in posizione C4 dell'anello tiofenico si trova vicino (3.4 Å) alla catena laterale e il gruppo carbonilico del diidrochinolone agisce come accettore di legame ad idrogeno per la catena laterale dell’Asn152. L'anello biciclico fuso è disposto in maniera periplanare e punta verso la regione idrofobica II. In una successiva fase di ottimizzazione, l'anello diidrochinolinonico è stato sostituito con un anello chinolonico metabolicamente più stabile, e sono stati introdotti dei sostituenti nella parte fenilica dell'anello chinolinonico per interagire con la regione idrofobica II. La posizione C6 del nucleo chinolinonico può rappresentare una posizione adeguata per migliorare la stabilità metabolica, come nei composti 54 e 55.(Fig. 31)

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Figura 31: Strutture e attività dei composti 54 e 55

Alcuni inibitori selezionati sono stati valutati per il loro profilo farmacocinetico. Il composto 54 possedeva un basso rapporto di efflusso della P-gp (P-glicoproteina) di 0.61 a pH 7.4 in cellule MDR1-MDCK e un rapporto cervello / plasma del 70%. L'inibitore 54 è biodisponibile per via orale nel ratto (F = 34%, dosaggio di 2 mg / kg) ma mostra una breve emivita di 4,6 min (al dosaggio di 1 mg/kg, iv).

Uno screening sulla selettività dell'inibitore 54 ha rivelato che su 36 chinasi, solo JNK3 era inibita alla dose di 10 µM. Inoltre, è stato dimostrato che il composto 54 presentava proprietà neuroprotettive nel saggio di neurotossicità nella corticale neuronale β-amiloide umana (EC50 = 2.9 µM). Un'altra serie di composti a struttura tiofenica, in grado di inibire JNK1 e JNK2 sono stati riportati da De et coll.30 Tiofene-3-carbossammidi potrebbero andare sul sito di legame dell' ATP così come sul sito di legame del JIP di JNK1, anche se con potenza relativamente bassa (Fig. 32).

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Figura 32: Struttura e valori IC50 dell'inibitore di JNK tiofene-3-carbossammidico

Il composto 56, il più potente di questa serie, sembra spiazzare

pepJIP1(JNK-interacting protein peptide 1) con un valore IC50 di 4.62 μM.30 La fosforilazione TNF-α-stimolata da c-Jun in cellule HeLa viene inibita da 56 con un valore IC50 di 7.5 µM. Lo screening di 56 su 26 chinasi ha rivelato che questo composto inibisce esclusivamente JNKs (79%, 72%, e 18% inibizione della JNK1, JNK2, e JNK3 rispettivamente, ad una concentrazione di prova di 25 µM) ed è inattivo contro altre MAP chinasi e chinasi dei lipidi. Esperimenti di colorimetria isotermica in presenza e in assenza di concentrazioni sature di un analogo non idrolizzabile dell'ATP o di pepJIP1 hanno rivelato che il composto 56 si lega a JNK2 con un valore di Kd di 640 nM, con un rapporto stechiometrico 2:1 tra ligando e proteina. L'affinità di legame di 56 diminuisce significativamente in presenza di ATP o pepJIP1. I valori di Kd determinati per interazioni tra il composto 56 e JNK1 sotto queste stesse condizioni erano 1,1 µM e 3,1 µM in presenza di ATP e pepJIP1 rispettivamente, entrambi con un rapporto ligando / proteine di 1:1.

47 Chinoloni e Azachinoloni

I ricercatori della Roche hanno pubblicato una serie di 4-chinoloni come inibitori duali di JNK1 e JNK2.31 La progettazione del composto principale 57 è derivata dallo screening HTS e dalle considerazioni risultanti dallo studio di SAR di inibitori JNK simili riportati da Takeda32,33 (Fig. 33).

Figura 33: Strutture e dati biologici di 4-chinoloni e azachinoloni

Lo studio cristallografico di un inibitore di questa serie con JNK1, ha rivelato che l'ossigeno carbonilico di questa classe di inibitori forma un legame a idrogeno con Met111 situato nella regione cerniera. L'atomo di cloro punta verso la regione idrofoba I mentre la posizione para del benzile è orientata verso la zona anteriore esposta al solvente consentendo, così, in questa posizione l'introduzione di vari gruppi. Raggruppamenti più grandi sono ben tollerati da entrambi gli enzimi come nel caso degli inibitori di JNK1 e JNK2 più potenti, ad esempio, il composto 58.31 Mostrando ottima selettività, l'inibitore 58 dispone anche di una buona farmacodinamica. In un insieme di 317 proteine chinasi, il composto 58 ha mostrato attività inibitoria solo verso gli enzimi JNK (non è specificato se JNK3 è stato incluso nell’insieme). Il composto 58 inibisce l'infiltrazione di neutrofili nel lavaggio broncoalveolare (BAL) del 55% 4 ore dopo la somministrazione e di tutti i globuli bianchi del 40% con un dosaggio di 10 mg/kg. Tuttavia, l'inibitore non è riuscito a mostrare gli attesi livelli di inibizione di JNK, conTNF-α in vivo. L'introduzione di un atomo di azoto nel sistema chinolonico ha condotto ad una