IV Congresso Nazionale AIPVet

Comunicazione orale INTRODUZIONE

In patologia veterinaria l’indagine immunoistochimica rappresenta un metodo diagnostico utile ed efficace per identificare la presenza di batteri patogeni nei tessuti di animali. Tale metodica presenta dei vantaggi rispetto ad altre metodiche (come l’isolamento batterico o la PCR) perché permette di determinare la precisa localizzazione di un microrganismo in un tessuto e di valutare la relazione tra la presenza di tale microrganismo e la risposta dell’ospite (in particolare la presenza di batteri associati ad una lesione) consentendo una migliore valutazione di tipo diagnostico e patogenetico.

Di fronte ad un nuovo anticorpo anti-batterio da testare il principale ostacolo da affrontare è il reperimento di adeguati campioni istologici da utilizzare come controlli positivi per la messa a punto della metodica e per la valutazione della specificità degli anticorpi. Inoltre, come qualsiasi altra prova sierologica, l’immunoistochimica necessita di opportuni controlli positivi e negativi per ogni test effettuato (Burry, 2000)

La valutazione della specificità di un anticorpo è indispensabile per una corretta interpretazione dei risultati e si basa sulla dimostrazione che l’anticorpo testato si lega solamente all’immunogeno impiegato per la sua produzione (Petrusz et al., 1976; Swaab et al., 1977; Mills, 1992; Burry, 2000; Miller, 2002). Per valutare la specificità di un anticorpo si utilizza un tessuto di controllo contenente l’antigene noto (Burry, 2000). La prova di specificità è quindi fondamentale nella valutazione di anticorpi anti-batteri di natura policlonale perché sono prodotti per inoculazione di conigli che possono avere nel loro siero anticorpi diretti verso batteri che frequentemente infettano tale specie animale e con cui sono venuti precedentemente a contatto, come ad esempio Escherichia coli (Miller, 2002). La presenza di questi anticorpi "di background" può portare ad un’errata interpretazione dei risultati di una prova immunoistochimica a scopo diagnostico.

In questo studio noi descriviamo un semplice metodo per allestire campioni istologici contenenti batteri noti da utilizzare come campione di controllo positivo: il sandwich. Una volta allestiti una serie di controlli batterici positivi, per valutare la loro riuscita li abbiamo utilizzati come campioni di controllo nella messa a punto della diluizione d’uso e nella verifica della specificità di alcuni anticorpi anti-batteri policlonali di coniglio.

MATERIALI E METODI

Il sandwich è composto da due strati esterni di polmone di cavallo e da uno strato centrale di batteri. I polmoni di cavallo sono stati prelevati al macello e utilizzati entro 24 ore dalla macellazione. I batteri utilizzati come controllo sono stati seminati in coltura pura su piastre di agar sague e incubati in aerobiosi a 37°C per 24-48 ore. Sono state utilizzate colture batteriche di Staphylococcus

aureus (Dr.ssa A. Invernizzi, IZSLER Milano), Escherichia coli K99- (Dr.ssa A. Invernizzi, IZSLER Milano), Pasteurella multocida (Dr. G. Lombardi, IZSLER Brescia), Mannheimia haemolytica (Dr. G. Lombardi, IZSLER

Brescia), Arcanobacterium pyogenes (Dr. G. Lombardi, IZSLER Brescia), Campylobacter jejuni ATCC 49943 (Dr.ssa A. Invernizzi, IZSLER Milano) e Campylobacter

fetus subsp. fetus [sheep abortion Abdn1076, Scotland

(Dr.ssa A. De Cesare, Bologna)]. Per allestire i sandwiches, dai polmoni di cavallo sono state prelevate mediante una lama da microtomo due sezioni seriali di polmone dello spessore di circa 0,5 cm (fig. 1). Le sezioni rimosse sono state poste su un piano, sovrapposte e rifilate in modo da ottenere un rettangolo di circa 2 x 3 cm. Le due sezioni sono state quindi spalmate sulla loro superficie interna con le colture batteriche pure, utilizzando un’ansa da batteriologia adeguatamente sterilizzata (fig. 2). Le sezioni spalmate, giustapposte e suturate ai quattro lati con filo da sutura (di tipo intrecciato) (fig. 3) sono state poste in biocassette e fissate in formalina tamponata al 10% per 24 ore. Dopo l’inclusione, dal campione impregnato di paraffina e mediante una lama da microtomo sono stati eliminati i punti di sutura e sono state tagliate delle sezioni seriali trasversali di circa 3 mm di spessore. Le sezioni trasversali (in numero di 2 o 3) sono state poste in uno stampo metallico e incluse in un blocco di paraffina (fig. 4). Per ogni ceppo batterico sono stati allestiti più sandwich (2 o 3).

Previa valutazione delle sezioni colorate con Ematossilina-Eosina (EE) per verificare la presenza di batteri nelle sezioni, i controlli positivi così preparati sono stati utilizzati in prove immunoistochimiche per la messa a punto della diluizione d’uso (definita come diluizione con la quale si ha la massima intensità del segnale positivo dei batteri omologhi in presenza del minimo/assente segnale di fondo del tessuto polmonare) e per la verifica della specificità di alcuni anticorpi primari policlonali prodotti in coniglio sia di provenienza commerciale [E. coli (Dako);

Helicobacter pylori (Dako)] sia prodotti da uno degli autori

[P. multocida, M. hemolytica, A. pyogenes (Dr. G. Lombardi)]. L’anticorpo anti-H. pylori (Dako) è stato valutato utilizzando campioni contenenti Campylobacter spp. (C. fetus e C. jejuni), in quanto è noto che anticorpi (monoclonali o policlonali) prodotti nei confronti di una

www.aipvet.it

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________ IV Congresso Nazionale AIPVet

delle due specie siano in grado di identificare entrambe le specie batteriche. Per quanto riguarda la prova di specificità, i sieri selezionati sono stati testati su controlli positivi batterici contenenti S. aureus, E. coli,

P. multocida, M. haemolytica e A. pyogenes. Le prove

immunoistochimiche sono state eseguite mediante il metodo avidina-biotina-perossidasi (ABC), utilizzando come cromogeno la DAB. Per la valutazione di tutti i sieri indagati, ad eccezione dell’anti-H. pylori (Dako), è stato eseguito uno smascheramento antigenico in tampone citrato pH 6 per 15’ a 96°C in bagnetto termostatato.

RISULTATI

La valutazione mediante colorazione EE dei campioni istologici ottenuti con il metodo del sandwich ha messo in evidenza sezioni costituite da 2 strati esterni di polmone con uno strato centrale di batteri di spessore variabile a seconda del campione e della sezione esaminata. Raramente, in alcune delle sezioni erano presenti batteri in quantità minime oppure i batteri erano del tutto assenti. I campioni ritenuti idonei sono stati utilizzati come controlli positivi batterici per le prove immunoistochimiche di diluizione degli antisieri policlonali selezionati. La prova di specificità degli antisieri policlonali nei confronti di S. aureus, E.

coli, P. multocida, M. haemolytica e A. pyogenes è stata

effettuata utilizzando le diluizioni d’uso ricavate per ciascun anticorpo ed ha dimostrato come tutti gli antisieri indagati contenessero anticorpi diretti verso S.

aureus e, ad eccezione dell’antisiero anti-H. pylori

(Dako), anche verso E. coli, P. multocida, M.

haemolytica e A. pyogenes (tabella 1). DISCUSSIONE E CONCLUSIONI

Il presente metodo per produrre controlli positivi batterici si è dimostrato efficace ed assicura la presenza di elevate quantità di un’unica specie batterica nota in un campione istologico fissato e processato secondo le stesse modalità dei campioni diagnostici. La produzione di sandwich multipli per ciascun ceppo batterico e l’inclusione di 2 o 3 sezioni per blocco di paraffina si è dimostrata necessaria perché la quantità di batteri è risultata variabile a seconda delle sezioni esaminate.

La scelta del polmone di cavallo per allestire i sandwich è stata fatta in base ad alcune caratteristiche fisiche che lo rendono un buon substrato: elastico

(facilmente spalmabile) e spugnoso (buona capacità di assorbimento dei batteri sulla superficie).

Per quanto riguarda la specificità dei sieri policlonali prodotti in coniglio il presente studio ha dimostrato la presenza in tutti gli antisieri testati di anticorpi “aspecifici” diretti verso numerosi batteri, come S. aureus,

E. coli, P. multocida, M. haemolytica e A. pyogenes. La

presenza di tali anticorpi è riconducibile all’immunizzazione naturale del coniglio produttore di antisiero nei confronti di batteri di comune riscontro in tale specie (Miller, 2002). Tra gli antisieri testati l’anticorpo policlonale anti-H. pylori (Dako) si differenzia rispetto agli altri antisieri perché pur lavorando ad una diluizione d’uso molto inferiore (1:1.000 rispetto a 1:20.000-40.000) ha mostrato di reagire solamente nei confronti di S. aureus. Questa differenza è probabilmente imputabile al differente metodo di produzione dell’anticorpo che è stato preparato inoculando solo antigeni termostabili di H. pylori ed è stato ulteriormente purificato da anticorpi contaminanti mediante estrazione in fase solida (http://www.dako.it). Al contrario gli altri antisieri testati sono stati preparati inoculando lisati batterici o batteri interi inattivati e sono costituiti o da una frazione immunoglobulinica purificata [E. coli (Dako)] o da siero intero di coniglio. Con entrambi questi ultimi due metodi di preparazione possono essere comunque presenti anticorpi diversi da quelli specifici (Mills, 1992).

Nella messa a punto di un anticorpo policlonale anti-batterico è quindi di fondamentale importanza disporre di adeguati controlli positivi per definire la corretta diluizione di utilizzo e per verificarne la specificità.

BIBLIOGRAFIA

Burry R. W. 2000. Specificity controls for immunocytochemical methods. J Histochem Cytochem 48:163-165.

Miller K. 2002. Immunocytochemical techniques. In: Bancroft JD, Gamble M. Theory and Practice of Histological Techniques. Fifth edition. Churchill Livingston (Elsevier). pp 421-464.

Mills B. 1992. Immunohistochemistry. In: Prophet EB, Mills B, Arrington JB, Sobin LH. Laboratory methods in histotechnology. Armed Forces Institute of Pathology, Washington, D.C. pp 247-251.

Petrusz P, Sar M, Ordonneau P, DiMeo P. 1976. Specificity in immunocytochemical staining. J Histochem Cytochem. 24: 1110-1112.

Swaab DF, Pool CW, Van Leeuwen FW. 1977. Can specificity ever be proven in immunocytochemical staining? J Histochem Cytochem. 25:388-390.

Associazione Italiana di Patologia Veterinaria – Italian Association of Veterinary Pathologists

www.aipvet.it

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________ IV Congresso Nazionale AIPVet

Tabella 1 – Prova di specificità di antisieri policlonali

Controlli positivi batterici Antisiero policlonale

(ditta produttrice) Diluizione d’uso S. aureus E. coli _multocida P. _haemolytica M. A. pyogenes

E. coli (Dako) 1:20.000 +++ +++ +++ +++ +

H. pylori (Dako) 1:1.000 +++ - - - -

P. multocida 1:30.000 +++ ++ +++ +++ +

M. haemolytica 1:30.000 +++ ++ +++ +++ +++

A. pyogenes 1:40.000 +++ +++ +++ +++ +++

Associazione Italiana di Patologia Veterinaria – Italian Association of Veterinary Pathologists

www.aipvet.it

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________ IV Congresso Nazionale AIPVet

Figura 1. Prelievo di 2 sezioni seriali di polmone di cavallo mediante lama da microtomo.

Figura 2. Le sezioni seriali di polmone dopo essere state ritagliate in un rettangolo di 2 x 3 cm vengono spalmate con una cultura batterica pura e suturate insieme mediante punti di sutura.

Figura 3. Blocchetti in paraffina contenenti sezioni trasversali multiple di sandwich.

Figura 4. Sandwich A. pyogenes colorato con antisiero policlonale anti-A. pyogenes (IZSLER) (DAB-emallume, 4x).

Associazione Italiana di Patologia Veterinaria – Italian Association of Veterinary Pathologists

www.aipvet.it

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________ IV Congresso Nazionale AIPVet

Figura 5. Sandwich M. haemolytica colorato con antisiero policlonale anti-E. coli (DAKO) (DAB-emallume, 20x).

A SIMPLE METHOD FOR THE PRODUCTION OF POSITIVE CONTROLS FOR THE