Correlazione con anti-CCP

Al momento il test più utilizzato per la determinazione degli ACPA è il CCP2 test.

Abbiamo valutato la correlazione tra i metodi da noi sviluppati e il CCP.

I grafici seguenti mostrano i risultati ottenuti; come si può vedere esiste un elevato livello di correlazione (p<0,0001) fra i livelli di anticorpi misurati con ciascuno dei 4 peptidi e i livelli di anti-CCP.

Figura 4.3 Analisi della correlazione tra Anti-CCP e Anti-VCPs e Anti-HCPs

Infine abbiamo valutato se esistesse correlazione tra la presenza di anticorpi anti VCPs o HCPs e la presenza di particolari parametri clinici (artrite simmetrica, artrite erosiva, artrite attiva) o parametri sierologici (fattore reumatoide, proteina C reattiva) caratteristici dell’AR. Abbiamo anche analizzato il rapporto fra fumo e produzione di ACPA.

Abbiamo rilevato una elevata correlazione tra la presenza degli anti- VCP1, VCP2, HCP1 e HCP2 e la presenza di fattore reumatoide.

Non abbiamo invece osservato alcuna correlazione tra la presenza degli anticorpi e la presenza degli altri parametri clinici e sierologici analizzati. In particolare la presenza di anti-HCP o anti-VCP non si associa ad artrite erosiva né è limitata alle artriti reumatoidi in fase di attività. Analogamente, non c’è correlazione fra l’abitudine al fumo e la presenza di anti-HCP o anti-VCP.

Risultati simili si ottengono prendendo in considerazione gli anticorpi anti-CCP.

D

La diagnosi sierologica di AR è sempre stata difficile: i sieri di soggetti con artrite reumatoide (AR) contengono infatti diverse specificità anticorpali, ma ben pochi anticorpi hanno specificità e sensibilità sufficienti a consentirne l’uso nella diagnostica. Soltanto la determinazione del fattore reumatoide e degli anticorpi contro i peptidi citrullinati ha un’elevata utilità diagnostica ed è disponibile nella pratica clinica.

Il fattore reumatoide non è però specifico della AR; è infatti prodotto in corso di malattie infiammatorie e infettive ed è anche presente nel siero di soggetti sani, specie nell’età avanzata. Nei soggetti con AR, d’altra parte, spesso non è presente nei primi anni di malattia, quando la diagnosi differenziale con altre forme di artrite cronica è difficile su basi esclusivamente cliniche.

Gli ACPA sono invece pressochè esclusivi dell’AR. I dati della letteratura indicano in modo assolutamente concorde che meno del 5% dei sieri di soggetti affetti da altre artriti croniche o da malattie del connettivo contengono ACPA (32,36,40). Per questa loro stretta associazione con l’AR e la loro presenza nelle fasi precoci di malattia sono stati recentemente inclusi nei criteri classificativi della malattia (33).

In questo studio gli ACPA sono stati determinati utilizzando substrati che sono probabilmente rilevanti per la patogenesi della malattia. Abbiamo infatti utilizzato peptidi derivati da proteine virali codificate dal virus di Epstein Barr e peptidi di origine istonica.

Il virus di Epstein Barr è considerato uno degli agenti ambientali che contribuiscono alla patogensi dell’AR. E’ noto da tempo che i pazienti affetti da AR hanno elevati livelli di anticorpi contro le proteine replicative e latenti dell’EBV (23,24). Più di recente, è stato osservato che il contenuto di DNA virale è 10 volte più elevato nei linfomonociti periferici dei soggetti con AR rispetto ai normali o a quelli affetti da altre artriti croniche (47). La presenza del virus a livello sinoviale è un argomento controverso: alcuni studi documentano segni di infezione da EBV nella sinovia reumatoide (48) ma sono stati riportati anche risultati negativi (49,50).

Nuovi dati sono stati recentemente ottenuti dall’analisi dei centri germinativi ectopici a livello sinoviale: l’espressione di proteine della

fase di latenza e litica e di RNA virale è stata dimostrata nelle cellule B e nelle plasmacellule sinoviali. Queste plasmacellule sono produttrici di ACPA ed in particolare di anticorpi diretti contro i peptidi virali citrullinati VCP1 e VCP2 (51).

I peptidi virali utilizzati in questo studio derivano da EBNA1, espresso nelle cellule nell’infezione latente da EBV, ed EBNA2, espresso nelle cellule B nelle fasi recenti dell’infezione. I dati ottenuti dall’analisi dei sieri di AR e di controlli normali confermano la specificità dei test impiegati, con una sensibilità paragonabile a quella ottenuta in precedenza (26,27,40).

La scelta di peptidi di origine istonica deriva da recenti osservazioni sulla risposta immune ad istoni citrullinati che si osserva nell’artrite reumatoide. Gli istoni sono probabilmente le proteine deiminate più abbondanti nell’organismo. La deiminazione degli istoni è un evento biologico di importanza fondamentale, che regola la trascrizione genica e rientra nei meccanismi di difesa dell’immunità innata. Gli stimoli infiammatori, ed infettivi in particolare, inducono deiminazione degli istoni, decondensazione della cromatina e formazione delle trappole extracellulare dei neutrofili (NET), in cui gli istoni del core rappresentano la componente più abbondante. I sieri di AR reagiscono in particolare con l’istone H4 deiminato, e con 2 sequenze in esso contenute, HCP1 e HCP2 (43).

Nel gruppo di pazienti da noi studiato, gli anticorpi anti-HCP1 e anti- HCP2 sono presenti nel 57,6% e nel 58,1% dei soggetti.

I titoli degli anticorpi anti-VCP1, VCP2, HCP1 e HCP2 sono altamente correlati fra loro e con il titolo di anticorpi anti-CCP. Questo livello di correlazione tra diversi metodi per la determinazione di ACPA è assolutamente tipico e indica come i vari metodi misurino popolazioni di anticorpi ampiamente sovrapposte. Come evidenziato dall’analisi della concordanza fra i vari test, la sovrapposizione non è però totale, suggerendo che esistano anticorpi della famiglia ACPA che sono misurabili con un determinato metodo e non con altri.

Un altro risultato della nostra analisi del tutto simile a quanto già riportato in letteratura è la forte correlazione tra la positività al FR e la presenza di ACPA. Uno stesso substrato genetico, rappresentato dallo shared epitope, predispone infatti sia alla produzione di fattore reumatoide che di ACPA e i titoli dei 2 tipi di autoanticorpi sono fortemente correlati.

La presenza di ACPA non è invece associata all’attività dell’artrite, come osservato nel presente studio e in molti lavori precedenti.

Per quanto riguarda la severità di malattia, è stato riportato che la presenza di ACPA sia associata al danno radiologico nei pazienti con AR; anche nei rari pazienti ACPA-positivi non affetti da AR la presenza di ACPA si associa all’artrite erosiva (38).

Secondo alcuni studi, la positività degli ACPA ha un valore predittivo positivo elevato per le forme di artrite di recente insorgenza ma persistenti e con andamento erosivo (52). Infatti, valutati a distanza di tempo dall’esordio dell’artrite, i pazienti positivi per ACPA presentano uno score radiologico sensibilmente più elevato rispetto ai pazienti negativi, indicando l’associazione tra gli anticorpi e una variante di malattia più aggressiva (53). Queste osservazioni sono valide per diversi componenti della famiglia ACPA: l’associazione con artrite erosiva è infatti dimostrata per gli anticorpi anti-CCP (52,53) ma anche per gli anticorpi anti-VCP2 (27).

In questo studio non abbiamo invece riscontrato nessuna associazione fra presenza di singole specificità ACPA, o fra positività ad almeno un peptide citrullinato, ed artrite erosiva: il numero di pazienti inclusi nello studio potrebbe essere troppo basso per raggiungere la significatività. Non possiamo però escludere che i criteri da noi utilizzati per la valutazione radiografica delle erosioni non siano completamente sovrapponibili a quelli impiegati in altri studi.

Nell’analisi dei nostri dati, abbiamo anche ricercato un’associazione fra abitudine al fumo e presenza di ACPA. Il fumo è infatti un fattore ambientale importante nel provocare deiminazione delle proteine: nel liquido di lavaggio bronco-alveolare dei fumatori è presente un’aumentata quantità di proteine citrullinate ed è stato dimostrato che il fumo è il più importante fattore ambientale associato ad AR (54). In

questo studio, non abbiamo dimostrato nessun rapporto fra fumo e produzione di ACPA ma anche in questo caso la numerosità del campione potrebbe essere determinante.

In conclusione, questo studio conferma che la determinazione di ACPA è importante per la diagnosi di artrite reumatoide ma non per valutarne l’andamento; suggerisce inoltre che antigeni rilevanti per la malattia (auto antigeni come gli istoni o antigeni esogeni come quelli di origine virale) possano essere utilizzati a scopo diagnostico.

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Desidero ringraziare la Prof.ssa Paola Migliorini per avermi dato la possibilità di svolgere il mio lavoro di tesi presso il Dipartimento di Immunologia Clinica ed Allergologia e per essere stata sempre disponibile nei miei confronti.

Un sentito grazie va al Dott. Federico Pratesi per il suo quotidiano aiuto nella realizzazione di questo lavoro.

Grazie ai miei amici che spesso e volentieri hanno dovuto sopportare le mie paranoie non facendomi mai mancare un sorriso o una parola di incoraggiamento.

E poi, grazie a voi:mamma, papà, Lele e Dario. Grazie per essermi sempre accanto nonostante il mio caratteraccio e mi fermo qui perché ogni parola sarebbe riduttiva e insufficiente per esprimere la mia gratitudine.