Diversi studi condotti in vivo e in vitro hanno evidenziato che la Cx36 è implicata nei fenomeni di sincronizzazione neuronale in varie strutture cerebrali ed in particolare nell’ippocampo (Ross et al., 2000; Gajda et al., 2003)
E’ noto che i fenomeni di sincronizzazione neuronale facilitano l’insorgere di eventi epilettiformi.
La stimolazione delle fibre muscoidi determina sia nelle slices ottenute dai topi WT che nelle slices ottenute dai topi Cx36 KO, perfuse con normale soluzione aCSF, dei potenziali di campo registrati nello strato CA3 che consistono di un fEPSP positivo con sovrapposto un singolo population spike. Questo tipo di risposta riflette la scarica sincrona di una popolazione di neuroni. Inoltre in tutte le slices prese in esame non sono stati osservati né PDSs né scariche spontanee di tipo interictali per tutto il periodo della registrazione.
Se la normale aCSF viene sostituita con aCSF-Mg2+-free + 4 AP (50 µM), si registrano eventi epilettiformi spontanei consistenti di una serie di PDSs di variabile ampiezza in entrambi i gruppi di
slices.
Mentre la frequenza media dei “bursts” registrati extracellularmente dall’area CA3 era di 28.3 ± 1.0 al minuto per le slices ottenute dai topi WT, nelle slices provenienti dai topi
Cx36 KO la frequenza è risultata di 13.6 ± 2.0 al minuto, valore significativamente più basso rispetto a quello delle slices dei topi WT (P < 0.05)(Figura 11).
Questo dato suggerisce che la mancanza della Cx36 determina una minore suscettibilità ad eventi epilettici indotti sperimentalmente.
CAPITOLO 5
Discussione
Negli ultimi anni lo sviluppo di nuove tecniche ha permesso di approfondire il ruolo svolto dalle gap junctions nella comunicazione neuronale. E’ stato evidenziato che le sinapsi elettriche possono giocare un ruolo chiave nel sincronizzare l’attività neuronale in diverse aree cerebrali; in particolar modo è stato osservato che le gap junctions formate dalla connessina 36 possono modulare l’attività oscillatoria neuronale a diverse bande di frequenza, come le onde gamma (40-90 Hz) e le onde ripples (200 Hz) (Blatow et al., 2003; Buzsaki and Chrobak, 1995; Ylinen et al., 1995; Draguhn et al., 1998; Traub et al., 2000; Hormuzdi et al., 2001; McBain and Fisahn, 2001; Traub et al., 2003), entrambi questi tipi di onde sono state proposte essere alla base di processi cognitivi (Hormuzdi et al., 2004).
I risultati ottenuti in questo lavoro dimostrano un ruolo della connessina 36 nell’espressione del potenziamento a lungo termine nell’area CA1 dell’ippocampo di topo.
L’utilizzo di topi Knockout per la connessina 36 ( Cx36 KO) ci ha permesso di studiare il ruolo di questa connessina nel fenomeno dell’LTP.
Nelle fette di ippocampo ottenute dai topi di controllo (wild type) la stimolazione ad alta frequenza delle collaterali di Schaffer ha indotto un potenziamento della risposta sinaptica che permane per tutto il tempo della registrazione, mentre nelle fette provenienti dai topi Cx36 KO è stato osservato solo un potenziamento a breve termine della risposta.
Questi risultati sono in accordo con i recenti studi comportamentali condotti da Frisch e collaboratori (2005), i quali hanno osservato che i topi Cx36 KO sono incapaci di riconoscere oggetti dopo solo 15 minuti dalla prima presentazione e presentano deficits della memoria che variano con la complessità dello stimolo presentato. Altri studi hanno evidenziato che le gap junctions formate dalla connessina 36 nell’ippocampo svolgono un ruolo nella comunicazione neuronale (Srinivas et al., 1999) principalmente tra gli interneuroni (Traub et al., 2003); inoltre l’accoppiamento elettrico tra neuroni è stato implicato nella sincronizzazione neuronale che si manifesta durante gli stati di attenzione o percezione (Fricker and Miles, 2001). Studi condotti sia in vitro che in vivo hanno dimostrato che la delezione della Cx36 determina una riduzione sia delle onde gamma che delle onde theta (Hormuzdi et al., 2001; Buhl et al., 2003). L’attivazione degli interneuroni potrebbe essere uno degli eventi
interneuronale con blocco degli eventi di potenziamento della risposta sinaptica prolungati nel tempo.
La mancanza della connessina 36 altera la trasmissione sinaptica di base come dimostrato dal fatto che le curve stimolo/risposta delle slices ottenute dai topi KO e quelle di controllo sono significativamente differenti. Poiché la Cx36 media l’accoppiamento elettrico tra gli interneuroni GABAergici e le cellule principali giocando un importante ruolo nella coordinazione del network inibitorio (Condorelli et al., 2003), si può ipotizzare che la mancanza della connessina 36 determini una riduzione del tono inibitorio mediato dai neuroni GABAergici, come si osserva dalle curve I/O e dal potenziamento post-tetanico. Inoltre è stato osservato che il blocco farmacologico delle gap junctions determina un aumento dell’attività sinaptica spontanea e influenza l’attività spiking registrata dagli interneuroni sia nell’ippocampo che nella neocorteccia (Cruikshank et al., 2004). Per quanto riguarda la ridotta scarica epilettica riscontrata nelle
slices dei topi Cx36 KO possiamo ipotizzare che la mancanza
delle gap junctions formate da questa connessina non permetta la sincronizzazione neuronale che è alla base dei processi epilettici. E’ stato infatti osservato che il segnale elettrico mediato dalle gap junctions può essere alla base di varie forme di epilessia riscontrate sia in vivo (Szente et al. 2002; Traub et al. 2002; Gajda
et al. 2003; Perez Velazquez et al. 2000) sia in vitro (Ross et al. 2000; Kohling et al. 2001; Traub et al. 2001; Jahromi et al. 2002). Inoltre è stato osservato che trattamenti che favoriscono l’apertura dei canali delle gap junctions possono promuovere attività di tipo epilettica (Kohling et al. 2001; Gajda et al. 2003), mentre i bloccanti delle gap junctions possono ridurre le scariche di tipo epilettico (Ross et al., 2000; Jahromi et al. 2002: Gajda et al., 2005).
Conclusioni
I risultati di questa tesi dimostrano che l’inattivazione della Cx36 induce alterazioni nella trasmissione sinaptica di base e non permette l’instaurarsi di un LTP. Questi dati sono in accordo con i risultati ottenuti con studi comportamentali, dimostrando che vi è un’ottima correlazione tra i risultati elettrofisiologici e i tests comportamentali.
Ulteriori indagini di tipo farmacologico saranno necessarie per determinare i meccanismi coinvolti in questa alterazioni.
Indice delle abbreviazioni 4-AP: 4 amino piridina
aCSF: soluzione cefalo-rachidiana artificiale
AMPA: α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxaxolepropionico
APV: 2-amino-5-phosphonovalerate CaM: calmodulina
CaMKII: Calcium-Calmodulina-dipendente II cAMP: adenosin monofosfato ciclico
CNQX: 6-cyano-7-nitroquinoxalin-2,3-dione Cx36: Connessina 36
DAG: diacil glicerolo
DNQX: 6,7-dinitroquinoxalin-2,3-dione
EGTA: glycol-bis(β-aminoethyl ether) N,N,N',N'-tetraacetic acid EPSP: potenziale eccitatorio post sinaptico
fEPSP: potenziale postsinaptico eccitatorio di campo I1: inibitore 1
IP3: inositolo 3-fosfato
KO: Knock-out
LTP: potenziamento a lungo termine MAPK: mitogen-activated protein kinase MCPG: α-methyl-4-carboxyphenyl-glycine
mGluR: recettori metabotropici per il glutammato
NMDA: N-metil-D-aspartico
PDS: paroxysmal depolarization shift PKA: protein chinasi A
PKC: protein chinasi C PLC: fosfolipasi C PP1: protein fosfatasi 1 PSD: densità postsinaptica
PTP: potenziamento posttetanico SNC: Sistema Nervoso Centrale STP: potenziamento a breve termine
t-ACPD: trans-(±)-1-amino-1,3-cyclopentanedicarboxylic acid WT: Wild-type
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