DC-MS ir ESC metodikų palyginimas

Palyginus pasirinktų benzodiazepino darinių nustatymui taikytas DC-MS ir ESC metodikas, gauti skirtingi rezultatai. Gauti rezultatai parodė, kad dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu benzodiazepino dariniai – diazepamas, medazepamas, bromazepamas, klonazepamas, alprazolamas ir lorazepamas buvo atskirti greičiau nei taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą (visa analizės trukmė atitinkamai – 16 min. ir 24 min.). Palyginus metodikų rezultatų glaudumo įvertinimus, DC-MS metodo gauti pakartojamumo ir tarpinio preciziškumo rezultatai taip pat geresni. Šiame tyrime DC-MS metodas nebuvo taikytas kiekybinei tirtų benzodiazepino darinių analizei, dėl to negalime įvertinti ir palyginti šių dviejų metodų rezultatų. Tačiau remiantis turimais rezultatais, galime daryti prielaidą, kad DC-MS metodas lyginant su ESC metodu benzodiazepino darinių nustatymui pasižymi didesniu specifiškumu ir greitesne analize.

Analizuotoje literatūroje nebuvo rasta atliktų tyrimų, identifikuojant būtent šiuos 6 benzodiazepino darinius mišinyje.

Lyginant pasirinktą DC-MS validuotą metodą su autoriaus M. Accikkol ir kt. [7] atlikta benzodiazepino darinių analize, mums pavyko atskirti daugiau junginių ir pati analizė buvo trumpesnė laiko atžvilgiu analizė užtruko trumpiau laiko atžvilgiu (atitinkamai 28 min. ir 16 min). N. Karlonas ir kt. [2] pasiūlė itin greitą benzodiazepino darinių analizę: benzodiazepinai atskirti per 3 minutes, tačiau atskirti tik 2 dariniai. Shimadzu korporacijos [57] metodu atskirti 9 benzodiazepinai (atskirai po kelis junginius), tačiau, lyginant su mūsų metodu, jų analizė užėmė labai daug laiko (bendra visos analizės trukmė – 84 min.). M. Pujadas kartu su kitais mokslininkais [35] paskelbė paprastą ir greitą tyrimą taip pat 6 benzodiazepino darinių atskyrimui. Analizės laikas buvo panašus: paskutinis junginys atskirtas praėjus apie 13,6 min. (mūsų analizėje paskutinis junginys atskirtas – 13,39 min.). Tuo tarpu G. Famiglini ir kt. [17] pasiūlė greitą ir efektyvų metodą benzodiazepino darinių analizei: 8 benzodiazepino dariniai buvo atskirti per 13 minučių. Taip pat greitą ir specifišką metodą aprašė ir L. Gautam ir kt. [19], kurio analizė truko apie 12 min., tačiau buvo sėkmingai atskirti tik 3 benzodiazepino dariniai.

Lyginant ESC validuotą metodiką su P. Fernandez ir kt. [18] taikytu metodu, analizė truko ilgiau nei mūsų pasirinktu metodu (atitinkamai 28 min. ir 24 min.). A. Ževžikovas ir kt. [4] pasiūlė greitą ir jautrią analizę benzodiazepinų atskyrimui mišinyje. Benzodiazepino dariniai buvo atskirti per

10 min., tačiau atskirta mažiau junginių. Lyginant H. al Hawasli ir kt. [22] atliktą tyrimą su mūsų taikyta ESC metodika, buvo atskirti tik 3 benzodiazepino dariniai ir visa analizė truko ilgiau (35 min.).Tuo tarpu M. N. Uddin kartu su kitais mokslininkais [48] pristatė greitą, jautrų, selektyvų metodą ir nustatė 6 benzodiazepino darinius per 15 min. A.G. Kazemifard ir kt. [25] sėkmingai atskyrė net 7 benzodiazepino darinius mišinyje, tačiau analizė užėmė daugiau laiko: paskutinis junginys (diazepamas) atskirtas 16,783 min. (mūsų analizėje paskutinis junginys atskirtas 15,024 min.). S. Thangadurai ir kt. [43] pasiūlė itin greitą metodą benzodiazepino darinių atskyrimui. Analizės trukmė – 10 min. Tačiau šiuo metodu sėkmingai buvo atskirti 4 benzodiazepino dariniai. A.N. Mahjoub su kitais tyrėjais [28] pristatė jautrų metodą 5 benzodiazepino darinių atskyrimui, tačiau, lyginant su mūsų metodu, jų analizė truko ilgiau (30 min.). Apibendrinus galime teigti, jog mūsų taikyti DC-MS ir ESC metodai pasirinktų benzodiazepino darinių nustatymui mišinyje yra greiti, specifiški ir jautrūs.

IŠVADOS

1. Pasirinkta dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodika pritaikyta benzodiazepino darinių (diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo) kokybiniam įvertinimui mišinyje, tiriamieji benzodiazepino dariniai identifikuoti pagal masių spektrus.

2. Pasirinkta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika pritaikyta benzodiazepino darinių (diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo) kokybiniam įvertinimui mišinyje. Junginių atskyrimui naudota gradientinė eliuavimo sistema, sudaryta iš 0,1 proc. trifluoracto rūgšties tirpalo ir acetonitrilo, tiriamieji benzodiazepino dariniai identifikuoti pagal sulaikymo laikus ir UV absorbcijos spektrus.

3. Pasirinkta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika pritaikyta benzodiazepino darinių mišinio kiekybinei analizei. Atlikus metodikos validavimą nustatyta, kad validacijos parametrai atitinka kiekybiniam vertinimui keliamus reikalavimus. Nustatytos benzodiazepino darinių aptikimo (0,04-6,02 µg/ml) bei nustatymo (0,1-11,03 µg/ml) ribos.

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Tyrimo metu modifikuotos ir validuotos metodikos galėtų būti pritaikytos nustatant tirtus benzodiazepino darinius atskirai ar mišinyje toksikologinių tyrimų laboratorijoje. Dujų chromatografijos-masių spektrometrijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos tinkamos kokybinei analizei, o efektyviosios skysčių chromatografijos ir kiekybinei analizei in vitro.

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Kalibatas P., Babianskienė I., Būtėnienė N., Viščinskienė G., Cibulskienė G., Tamošaitienė V., Kinčinienė O. Ūminiai atsitiktiniai vaikų apsinuodijimai 2003–2010 metais: kas, kuo ir kada? Medicinos teorija ir praktika 2012; 18 (4.1): 481 –485.

2. Karlonas N, Padarauskas A, Ramanavicius A, Minkuviene Z, Ramanaviciene A Rapid and highly sensitive determination of clonazepam and 7-aminoclonazepam in whole blood using gas chromatography with negative ion chemical ionization mass spectrometry. Chemija 2012; 23: 91-99.

3. Šniepienė G., Vitkus D., Slatvickis D. Mirtingumo nuo apsinuodijimo psichoaktyviomis medžiagomis tendencijos Klaipėdos apskrityje 2010–2014 m. Visuomenės sveikata. 2015;(1); 96-101

4. Ževžikovas A., Bertulytė A., Dirsė V., Ivanauskas L. Benzodiazepino darinių mišinio tyrimas didelio slėgio skysčių chromatografijos metodu. Medicina. 2003; 39 (2): 30-36

5. Ževžikovienė A., Ževžikovas A., Bertulis A. Diazepino darinių: alprazolamo, medazepamo, clordiazepoksido mišinio tyrimas didelio slėgio skysčių chromatografijos metodu. Medicina. 2003; 39 (2): 37-41

6. VVKT. 2016 metų suvartojimo ataskaita. [elektroninis išteklius] [žiūrėta 2017 m. rugpjūčio 20 d.] Prieiga per internetą: http://www.vvkt.lt/Suvartojimo-ataskaitos

7. Acikkol M, Mercan S., Karadayi S. Simultaneous Determination of Benzodiazepines and Ketamine from Alcoholic and Nonalcoholic Beverages by GC-MS in Drug Facilitated Crimes. Chromatographia. 2009;70 (7-8):1295-1298

8. Bachhuber M, Hennessy S, Cunningham C, Starrels J. Increasing Benzodiazepine Prescriptions and Overdose Mortality in the United States, 1996–2013. American Journal of Public Health. 2016;106 (4): 686-688

9. Bairros A.V., Almeida R.M., Pantaleão L., Barcellos T., Silva S.M., Yonamine M. Determination of low levels of benzodiazepines and their metabolites in urine by hollow-fiber liquid-phase microextraction (LPME) and gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS). Journal of Chromatography B. 2015; 975: 1-32

10. Bugey A., Staub C. Rapid analysis of benzodiazepines in whole blood by high-performance liquid chromatography: use of a monolithic column. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2004; 35(3): 555-562

11. Cirimele V, Kintz P, Mangin P. Detection and quantification of lorazepam in human hair by GC-MS/NCI in a case of traffic accident. International Journal of Legal Medicine. 1996; 108 (5): 265-267

12. Coben J, Davis S, Furbee P, Sikora R, Tillotson R, Bossarte R. Hospitalizations for Poisoning by Prescription Opioids, Sedatives, and Tranquilizers. American Journal of Preventive Medicine. 2010;38(5):517-524

13. Drummer O.H. Benzodiazepines — Effects on human performance and behavior. Forensic Science Review. 2002; 14(1):1-14

14. Drummer O.H. Benzodiazepines. In: Jamieson A, Moenssens A, ed. by. Wiley Encyclopedia of Forensic Science. 1st ed. United Kingdom; 2009: 293-297.

15. Eshaghi Z, Daneshvar L, Salari P, Bandegi S. Determination of low-residue benzodiazepine, lorazepam, in environmental water samples by suspended droplet microextraction and high performance liquid chromatography-diod array detector. Chemija 2009. 2009; 20 (3): 180-185 16. Espinosa-Bosch M, Ruiz-Sánchez A, Sánchez-Rojas F, Bosch-Ojeda C. Analytical Methodologies

for the Determination of Midazolam in Pharmaceuticals. Chromatographia. 2015; 78 (9-10): 609-619

17. Famiglini G, Capriotti F, Palma P, Termopoli V, Cappiello A. The Rapid Measurement of Benzodiazepines in a Milk-Based Alcoholic Beverage Using QuEChERS Extraction and GC-MS Analysis. Journal of Analytical Toxicology. 2015;39(4):306-312

18. Fernandez P, Vįzquez C, Lorenzo R, Carro A, Bermejo A. Development of a Liquid Chromatographic Method for the Simultaneous Determination of Six Benzodiazepines in Human Plasma After Solid-Phase Extraction. Analytical Letters. 2010; 43 (6):1075-1084

19. Gautam L, Sharratt S.D., Cole M.D.. Drug Facilitated Sexual Assault: Detection and Stability of Benzodiazepines in Spiked Drinks Using Gas Chromatography-Mass Spectrometry. PLoS ONE. 2014;9(2):e89031

20. Gunn J, Kriger S, Terrell AR Simultaneous determination and quantification of 12 benzodiazepines in serum or whole blood using UPLC/MS/ MS. Methods Mol Biol. 2010; 603: 107-119

21. Hagan R.L. Clarification of Benzodiazepine Structural Classes. Journal of Analytical Toxicology. 1995; 19 (1): 58-59

22. Hawasli H, Khayat M, Mardini M. Development of a validated HPLC method for the separation and analysis of a Bromazepam, Medazepam and Midazolam mixture. Journal of Pharmaceutical Analysis. 2012;2(6):484-491

23. Hernandez S, Nelson L. Prescription Drug Abuse: Insight Into the Epidemic. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 2010; 88 (3):307-317

24. Yilmaz B, Akba V. Rapid and Simple Methods for Determination of Medazepam in Pharmaceutical Preparations using GC-FID and GC-MS. Analytical Letters. 2009; 42 (18): 2978-2985

25. Kazemifard A, Javadzadeh N, Gholami K. New Universal High-Performance Liquid Chromatographic Method For Determination Of 1,4-Benzodiazepines As Bulk Drugs And In Pharmaceutical Formulations. Acta Poloniae Pharmaceutica - Drug Research. 2008;65 (2): 179-186

26. Kiss B, Bogdan C, Pop A, Loghin F. A rapid UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of flunitrazepam, 7-aminoflunitrazepam, methadone and EDDP in human, rat and rabbit plasma. Talanta. 2012; 99: 649-659.

27. Kronstrand R, Forsman M, Roman M. A screening method for 30 drugs in hair using ultrahigh-performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry. Ther Drug Monit. 2013; 35: 288-295

28. Mahjoub A., Staub C. Simultaneous determination of benzodiazepines in whole blood or serum by HPLC/DAD with a semi-micro column. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2000;23(2-3):447-458

29. Manchester K, Lomas E, Waters L, Dempsey F, Maskell P. The emergence of new psychoactive substance (NPS) benzodiazepines: A review. Drug Testing and Analysis. 2017;10 (1):37-53 30. Ming D.S, Heathcote J. A rapid and accurate UPLC/MS/MS method for the determination of

benzodiazepines in human urine. Journal of Chromatography B the Analytical Technology in the Biomedical and Life Sciences. 2011; 879: 421-428

31. Moffat A., Osselton M., Widdop B., Watts J. Clarke's analysis of drugs and poisons. 4th ed. London: Pharmaceutical Press; 2011

32. Patel R, Patel A, Patel M, Shankar M, Bhatt K. Estimation of Alprazolam and Sertraline in Pure Powder and Tablet Formulations by Performance Liquid Chromatography and High-Performance Thin-Layer Chromatography. Analytical Letters. 2009; 42 (11):1588-1602

33. Perez E, Knapp J, Horn C, Stillman S, Evans J, Arfsten D. Comparison of LC–MS-MS and GC– MS Analysis of Benzodiazepine Compounds Included in the Drug Demand Reduction Urinalysis Program. Journal of Analytical Toxicology. 2016;40(3):201-207

34. Persona K, Madej K, Knihnicki P, Piekoszewski W. Analytical methodologies for the determination of benzodiazepines in biological samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2015;113:239-264

35. Pujadas M, Pichini S, Civit E, Santamariña E, Perez K, de la Torre R. A simple and reliable procedure for the determination of psychoactive drugs in oral fluid by gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2007;44(2):594-601

36. Recommended Methods for the Detection and Assay of Barbiturates and Benzodiazepines in Biological Specimens, Manual for Use by National Laboratories, ST/NAR/28, United Nations, 1997

37. Rudolph U, Knoflach F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nature Reviews Drug Discovery. 2011;10(9):685-697

38. Rust KY, Baumgartner MR, Meggiolaro N, Kraemer T Detection and validated quantification of 21 benzodiazepines and 3 “z-drugs” in human hair by LC-MS/MS. Forensic Sci Int. 2012; 215: 64-72

39. Samanidou V, Pechlivanidou A, Papadoyannis I. Development of a validated HPLC method for the determination of four 1,4-benzodiazepines in human biological fluids. Journal of Separation Science. 2007;30(5):679-687

40. Sauve EN, Langųdegård M, Ekeberg D, Ųiestad AM. Determination of benzodiazepines in ante-mortem and post-ante-mortem whole blood by solid supported liquid-liquid extraction and UPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2012 883-884: 177-88

41. Shih HI¹, Lin MC, Lin CC, Hsu HC, Lee HL, Chi CH, Sung FC, Chang YJ, Kao CH. Benzodiazepine therapy in psychiatric outpatients is associated with deliberate self-poisoning events at emergency departments—a population-based nested case–control study. Psychopharmacology. 2013;229(4):665-671

42. Thangadurai S, Dhanalakshmia A, Kannana M. Separation and Detection of certain Benzodiazepines by Thin-Layer Chromatography. Malaysian Journal of Forensic Sciences. 2013;4(1):47-53

43. Thangadurai S, Kulantheswaran M, Kanagaraj B. Simultaneous Separation and Detection of Clobazam, Clonazepam, Flurazepam and Midazolam in Pharmaceutical Dosage Form by Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography. Malaysian Journal of Forensic Sciences. 2016;7(1):1-9

44. Tsai IL, Weng TI, Tseng YJ, Tan HK, Sun HJ, et al. Screening and confirmation of 62 drugs of abuse and metabolites in urine by ultrahigh-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 2013; 37: 642-651

45. Uddin M. An Overview on Total Analytical Methods for the Detection of 1,4-Benzodiazepines. Pharmaceutica Analytica Acta. 2014;05(06)

46. Uddin M, Samanidou V., Papadoyannis I. Bio-Sample Preparation and Gas Chromatographic Determination of Benzodiazepines – A review. Journal of Chromatographic Science. 2013; 51 (7): 587-598

47. Uddin M, Samanidou V., Papadoyannis I. Development and Validation of an HPLC Method for the Determination of Six 1,4‐Benzodiazepines in Pharmaceuticals and Human Biological Fluids. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2008;31(9):1258-1282.)

48. Uddin M, Samanidou V, Papadoyannis I. HPLC Method for Simultaneous Determination of 1,4-Benzodiazepines and Tricyclic Antidepressants in Pharmaceutical Formulations and Saliva—A Useful Tool in Medicinal Chemistry. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2009;32 (10):1475-1504

49. United Nations Office on Drugs and Crime. Recommended Methods for the Identification and Analysis of Barbiturates and Benzodiazepines under International Control. Manual for Use by National Drug Analysis Laboratories. NewYork; 2012

50. Wang L., Zhao H., Qiu Y., Zhou Z. Determination of four benzodiazepine residues in pork using multiwalled carbon nanotube solid-phase extraction and gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2006;1136 (1): 99-105

51. Availability of Narcotic Drugs for Medical use [Internet]. Incb.org. 2017 [cited 2017 Aug 14]. Available from: https://www.incb.org/incb/en/narcotic-drugs/Availability/availability.html 52. Bachhuber M.A., Hennessy S., Cunningham C.O., Starrels J.L. Increasing Benzodiazepine

Prescriptions and Overdose Mortality in the United States, 1996–2013 [Internet] 2016 Mar 9 [cited 2017 Oct 15]. Available from: https://ajph.aphapublications.org. DOI: 10.2105/AJPH.2016.303061

53. Bosman I, Verschraagen M, Lusthof K. Toxicological Findings in Cases of Sexual Assault in the Netherlands [Internet]. 2011 Aug 9 [cited 2017 Oct 16]. Available from: http://www.onlinelibrary.wiley.com. DOI: 10.1111/j.1556-4029.2011.01888.x

54. International Narcotics Control Board. Psychotropic Substances - Substances psychotropes - Sustancias sicotrópicas 2017 [Internet]. New York: United Nations; 2017: 49 – 61. [cited 2018 Jan

20]. Available from:

https://www.incb.org/documents/Psychotropics/technicalpublications/2017/Technical_Publication _2017_English.pdf

55. Derivatization reagents. For selective Response and Detection in Complex Matrices [Internet]. sigmaaldrich.com. 2017 [cited 2017 Sep 12]. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/migrationresource4/Derivatization%20R gts%20brochure.pdf

56. Samanidou VF, Uddin MN, Papadoyannis IN. Benzodiazepines: sample preparation and HPLC methods for their determination in biological sample [Internet] 2009 Aug 7 [cited 2017 Nov 15] Available from: https://www.future-science.com DOI: 10.4155/bio.09.43

57. Shimadzu. Analysis of a Benzodiazepine – Based Drug Using GC-MS [Internet]. shimadzu.com

[cited 2017 August 10]. Available from:

https://applicationstation.ssi.shimadzu.com/sites/default/files/analysis-benzodiazepine-based-drug-using-gcms.pdf

58. Szatkowska P., Koba M., Koslinski P., Wandas J., Bączek T. Analytical Methods for Determination of Benzodiazepines. A short review [Internet]. 2015 Nov 30 [cited 2017 Nov 10]. Available from: https://www.scribd.com/document/291701002. DOI: 10.2478/s11532-014-0551-1

59. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2 (R1) [Internet]. Ich.org.2017

[cited 21 January 2018]. Available from:

https://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/ Q2_R1__Guideline.pdf

60. WHO. Rational Use of Benzodiazepines [Internet] [cited 2017 Sep 14]. Available from: http://apps.who.int/medicinedocs/documents/s19181en/s19181en.pdf

61. WHOCC - Use of ATC/DDD [Internet]. Whocc.no. 2017 [cited 2017 Aug 12]. Available from: https://www.whocc.no/use_of_atc_ddd

PRIEDAI

1 priedas. Tiriamų benzodiazepino darinių masių spektrai

Diazepamo masių spektras

Medazepamo masių spektras

Bromazepamo masių spektras

Klonazepamo masių spektras

Alprazolamo masių spektras

2 priedas. Magistro baigiamojo darbo tema paskelbta pranešimo tezė

J. Kviesulaitytė, M. Marksa, A. Ževžikovienė. Identification of benzodiazepines in mixture using high performance liquid chromatography and gass chromatography-mass spectrometry methods. The 8th International Conference on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy Practice: Book of abstracts. Kaunas: Lithuanian University of Health Sciences. 2017, p.79 (3 priedas).