FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
JUSTĖ KVIESULAITYTĖ
BENZODIAZEPINO DARINIŲ NUSTATYMAS CHROMATOGRAFINIAIS
METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. dr. Augusta Ževžikovienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
BENZODIAZEPINO DARINIŲ NUSTATYMAS CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Augusta Ževžikovienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Justė Kviesulaitytė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Bendra benzodiazepinų apžvalga ... 10
1.1.1. Benzodiazepinų fiziko-cheminės savybės ... 10
1.1.2. Benzodiazepinų klasifikacija ... 10
1.1.3. Benzodiazepinų struktūra ... 11
1.1.4. Benzodiazepinų veikimo mechanizmas ... 11
1.2. Benzodiazepinų klinikinis ir neklinikinis panaudojimas ... 12
1.2.1. Klinikinis panaudojimas ... 12
1.2.2. Neklinikinis panaudojimas ... 12
1.3. Benzodiazepinų vartojimo paplitimas ... 12
1.3.1. Benzodiazepinų vartojimas Lietuvoje ... 12
1.3.2. Benzodiazepinų vartojimas pasaulyje ... 13
1.4. Apsinuodijimas benzodiazepinais ... 14
1.5. Benzodiazepinų nustatymas ... 14
1.5.1. Chromatografiniai metodai taikomi benzodiazepinų analizei ... 15
1.5.2. Derivatizacija ... 16
1.5.3. DC- MS metodikų taikymas benzodiazepino darinių nustatymui ... 17
1.5.4. ESC metodikų taikymas benzodiazepino darinių nustatymui ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 22
2.1. Tyrimo planavimas ... 22
2.2. Tyrimo objektas ... 22
2.3. Medžiagos ir reagentai ... 22
2.4. Prietaisai ir priemonės ... 23
2.5. Kokybinis vertinimas DC-MS metodu ... 23
2.5.1. Įranga ... 23
2.5.2. Chromatografinės sąlygos ... 23
2.5.3. Tiriamųjų tirpalų paruošimas ... 24
2.5.4. Analizė ... 24
2.6. Kokybinis ir kiekybinis benzodiazepino darinių vertinimas ESC metodu ... 24
2.6.1. Įranga ... 24
2.6.3. Standartinių tirpalų paruošimas ... 25
2.6.4. Tiriamųjų tirpalų paruošimas ... 25
2.6.5. Analizė ... 26
2.7. Duomenų apdorojimas ... 26
2.8. Pasirinktų metodų validacija ... 26
2.8.1. Metodų specifiškumo vertinimas ... 26
2.8.2. Metodų rezultatų glaudumo vertinimas ... 27
2.8.3. Tiesiškumo vertinimas ... 27
2.8.4. Aptikimo ir nustatymo ribų vertinimas ... 27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1. DC-MS metodikos parinkimas ... 28
3.2. Benzodiazepino darinių identifikavimas DC-MS metodu ... 28
3.3. DC-MS metodo validacija ... 29
3.3.1. Metodo specifiškumas ... 29
3.3.2. Rezultatų glaudumas ... 32
3.4. ESC metodikos parinkimas ... 32
3.5. Benzodiazepino darinių nustatymas ESC metodu ... 33
3.6. ESC metodo validacija ... 33
3.6.1. Metodo specifiškumas ... 33
3.6.2. Rezultatų glaudumas ... 36
3.6.3. Tiesiškumas ... 36
3.6.4. Aptikimo ir nustatymo ribos ... 38
3.7. DC-MS ir ESC metodikų palyginimas ... 39
IŠVADOS ... 41
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43
SANTRAUKA
J. Kviesulaitytės magistro baigiamasis darbas „Benzodiazepino darinių nustatymas chromatografiniais metodais“/ mokslinė vadovė doc. dr. A. Ževžikovienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas: nustatyti dažniausiai Lietuvoje vartojamus benzodiazepino darinius: diazepamą, medazepamą, bromazepamą, klonazepamą, alprazolamą, lorazepamą mišinyje, taikant dujų chromatografijos-masių spektrometrijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti ir pritaikyti dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodiką, kuri būtų tinkama diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo mišinio kokybinei analizei.
2. Parinkti ir pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo mišinio kokybiniam įvertinimui.
3. Atlikti benzodiazepino darinių mišinio, sudaryto iš diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo, kiekybinę analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Tyrimo objektas: šešių dažniausiai Lietuvoje vartojamų benzodiazepino darinių: diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo, lorazepamo mišinys.
Tyrimo metodika: tiriamų benzodiazepino darinių atskyrimui naudota dujų chromatografo- masių spektrometro sistema „Shimadzu GCMS QP2010 Ultra system“, naudota kapiliarinė kolonėlė
Rxi-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). Kokybinei ir kiekybinei benzodiazepino darinių analizei atlikti
naudotas skysčių chromatografas „Waters Alliance 2695“ su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 996“, naudota kolonėlė ACE C18 (250 x 4,6 mm x 5 µm). Mobili fazė sudaryta iš 0,1 proc. trifluoracto rūgšties tirpalo ir acetonitrilo.
Rezultatai ir išvados: abu metodai buvo pritaikyti pasirinktų šešių benzodiazepino darinių nustatymui mišinyje. Taikant dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodą gautos junginių sulaikymo trukmės svyruoja nuo 8,923 min. iki 13,396 min. Taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą, gautos junginių sulaikymo trukmės – nuo 11,456 min. iki 15,024 min. Kiekybiniam įvertinimui sudarytos junginių kalibracijos kreivės: diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo - nuo 0,015 iki 0,05 mg/ml, lorazepamo – nuo 0,015 iki 0,025 mg/ml. Didžiausios aptikimo ir nustatymo ribos gautos alprazolamo (atitinkamai 6,02 µg/ml ir 11,03 µg/ml), mažiausios – medazepamo (atitinkamai 0,04 µg/ml ir 0,10 µg/ml).
Raktažodžiai: benzodiazepino dariniai, nustatymas, dujų chromatografija-masių spektrometrija, efektyvioji skysčių chromatografija
SUMMARY
Work title: Determination of benzodiazepine derivatives by chromatographic methods. Justė Kviesulaitytė master‘s thesis/ supervised by Doc. Dr. Augusta Ževžikovienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analitic and Toxicological chemistry – Kaunas, 2018.
Aim: To determinate the most commonly used benzodiazepine derivatives in Lithuania: diazepam, medazepam, bromazepam, clonazepam, alprazolam, lorazepam in mixture using gas chromatography – mass spectrometry and high performance liquid chromatography methods.
Objectives:
1. To choose and apply gas chromatography-mass spectrometry methodology which would be capable for qualitative analysis of diazepam, medazepam, bromazepam, clonazepam, alprazolam and lorazepam in mixture;
2. To choose and apply high performance liquid chromatography methodology for qualitative analysis of the mixture of diazepam, medazepam, bromazepam, clonazepam, alprazolam and lorazepam;
3. To assess a quantitative analysis of the mixture of diazepam, medazepam, bromazepam, clonazepam, alprazolam and lorazepam by high performance liquid chromatography.
Object: the mixture of six mostly used benzodiazepines derivatives: diazepam, medazepam, bromazepam, clonazepam, alprazolam and lorazepam in Lithuania.
Methods: The identification of six benzodiazepines was done using SHIMADZU GC-MS-QP2010 Ultra chromatography system with Rxi – 5ms capillary column (30m x 0,25 mm x 0,25 µm). Qualitative and quantitative analysis was carried out on Waters Alliance 2695 liquid chromatograph equipped with Waters 996 photodiode array detector and ACE C18 (250 x 4,6 mm x 5 μm) column. The mobile phase consisted of 0,1 % trifluoracetic acid and acetonitrile.
Results and conclusions: Both methods were used for determination of six benzodiazepines in the mixture. The retention time by gas chromatography – mass spectrometry of analytes was found to be from 8,923 to 13,396 min. The retention time by high performance liquid chromatography of analytes was found to be from 11,456 to 15,024 min. For qualitative analysis were made calibration curves of analytes: diazepam, medazepam, bromazepam, clonazepam, alprazolam – from 0,015 to 0,05 mg/ml, lorazepam – from 0,015 to 0,025 mg/ml. The highest detection and determination limits were obtained for alprazolam (6,02 μg/ml and 11,03 μg/ml, respectively) and medazepam (0,04 μg/ml and 0,10 μg/ml, respectively).
Keywords: benzodiazepine derivatives, determination, gas chromatography-mass spectrometry, high performance liquid chromatography
SANTRUMPOS
ATC/DDD – anatominė – terapinė – cheminė klasifikacija/ nustatyta paros dozė DAD – fotodiodų matricos detektorius
DC-MS – dujų chromatografija – masių spektrometrija ECD – elektronų gaudymo detektorius
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija FID – liepsnos jonizacijos detektorius GABA – gama amino sviesto rūgštis
INCB – Tarptautinė Narkotikų kontrolės valdyba
MEKC – micelinė elektrokinetinė kapiliarinė chromatografija MSC – micelinė skysčių chromatografija
m/z – molekulinių jonų masių ir jų krūvių santykis NPD – azoto – fosforo detektorius
PC – plonasluoksnė chromatografija PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija
SC-MS/MS – skysčių chromatografija su tandemine masių spektrometrija S-DDD – nustatyta paros dozė statistikos tikslais
UESC – ultraefektyvioji skysčių chromatografija
UNODC – Jungtinių Tautų Narkotikų ir nusikalstamumo biuras VVKT – Valstybinė vaistų kontrolės tarnyba
ĮVADAS
Pasaulyje yra žinoma daugiau kaip 50 skirtingų rūšių benzodiazepino darinių. Tai viena dažniausiai išrašomų vaistinių preparatų grupių [13]. Jie vartojami įvairiems psichologiniams sutrikimams gydyti: nemigai, nerimui, įtampai, traukuliams slopinti, alkoholizmo abstinencijos simptomams mažinti [14]. Benzodiazepinais dažnai piktnaudžiaujama, juos vartojant kartu su kitais vaistais ar nusikalstamojoje veikloje (pvz.: išprievartavimų, pagrobimų atvejais). Neatsakingas jų vartojimas gali sukelti apsinuodijimą ar net mirtį [29,52,53].
Nors benzodiazepino darinių įsigijimas yra kontroliuojamas, apsinuodijimų benzodiazepino dariniais skaičius nuolatos auga [12,52]. Lietuvoje didžiausią apsinuodijimų dalį sudaro būtent apsinuodijimai benzodiazepinais [1]. Todėl didėjant šiam skaičiui, reikalinga greita junginių analizė.
Benzodiazepino dariniai pasižymi panašia struktūra ir savybėmis, dauguma iš jų yra labai nepatvarūs ir greitai skylantys [21,31]. Tam reikalingos labai specifiškos ir jautrios metodikos tiriamųjų medžiagų atskyrimui ir identifikavimui. Literatūroje minima daug skirtingų chromatografinių metodų, naudojamų benzodiazepino darinių analizei, dažniausiai – dujų chromatografija ir efektyvioji skysčių chromatografija, kurios pasižymi dideliu jautrumu bei specifiškumu [45,46].
Lietuvoje ir pasaulyje atlikta nemažai tyrimų analizuojant benzodiazepino darinius, tačiau nagrinėtoje literatūroje neaptikta duomenų apie tiriamų benzodiazepino darinių mišinio analizę. Tad šio darbo tikslas – nustatyti dažniausiai Lietuvoje vartojamus benzodiazepino darinius: diazepamą, medazepamą, bromazepamą, klonazepamą, alprazolamą, lorazepamą mišinyje, taikant dujų chromatografijos-masių spektrometrijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus.
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: nustatyti dažniausiai Lietuvoje vartojamus benzodiazepino darinius – diazepamą, medazepamą, bromazepamą, klonazepamą, alprazolamą, lorazepamą mišinyje, taikant dujų chromatografijos-masių spektrometrijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti ir pritaikyti dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodiką, kuri būtų tinkama diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo mišinio kokybinei analizei.
2. Parinkti ir pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo mišinio kokybiniam įvertinimui.
3. Atlikti benzodiazepino darinių mišinio, sudaryto iš diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo, kiekybinę analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Bendra benzodiazepinų apžvalga
1.1.1. Benzodiazepinų fiziko-cheminės savybės
Benzodiazepinai yra silpnai baziniai junginiai. Dauguma jų yra balti ar gelsvi kristaliniai milteliai. Metaklazepamo hidrochloridas išsiskiria ryškiai oranžine spalva ir kartoku skoniu. Benzodiazepinų lydymosi temperatūra svyruoja nuo 95 iki 240°C. Kaip laisvos bazės benzodiazepinai praktiškai netirpsta vandenyje, tačiau yra tirpūs daugumoje organinių tirpiklių, tokių kaip dietilo eteris, etilacetatas, chloroformas, etanolis. Praktiškai visi benzodiazepinai tirpsta metanolyje. Klonazepamas ir chlordiazepoksidas pasižymi jautrumu šviesai [31].
1.1.2. Benzodiazepinų klasifikacija
Benzodiazepinai priskiriami nervų sistemą veikiančių vaistų grupei. Jie gali būti klasifikuojami pagal veikimo trukmę, eliminacijos pusperiodį ir cheminę struktūrą. Klasifikuojant pagal eliminacijos pusperiodį (t1/2), benzodiazepinai skirstomi į ultratrumpo (t1/2 mažiau nei 6 val.), trumpo – (t1/2 lygus 6 val.), vidutinio – (t1/2 nuo 6 iki 24 val.), ilgo – (t1/2 daugiau nei 24 val) eliminacijos pusperiodžio junginius. Pagal veikimo trukmę, benzodiazepinai skirstomi į: trumpo (veikimas trunka nuo 1 iki 12 valandų), vidutinio (12 – 40 valandų) ir ilgo (40 – 250 valandų) poveikio. Trumpai veikiantiems benzodiazepinams priskiriami triazolamas, midazolamas ir halazepamas, vidutiniškai veikiantiems – alprazolamas, klonazepamas, flunitrazepamas, nitrazepamas, lorazepamas, estazolamas ir temazepamas, ilgai veikiantiems – diazepamas, klorazepatas, chlordiazepoksidas, flurazepamas, prazepamas. Pagal cheminę struktūrą benzodiazepinai skirstomi į 5 pagrindines grupes: 1,4 – benzodiazepino darinius (chlordiazepoksidas, diazepamas, klonazepamas, lorazepamas, oksazepamas), 1,5 – benzodiazepino darinius (klobazamas, triflubazamas), triazolobenzodiazepinus (alprazolamas, adinazolamas, estazolamas, loprazolamas, triazolamas), tienodiazepino darinius (brotizolamas, klotiazepamas), imidazolbenzodiazepinus (midazolamas). Imidazolbenzodiazepinai taip pat dar vadinami diazolobenzodiazepinais. [21,29,58].
1.1.3. Benzodiazepinų struktūra
Dažniausiai vartojamų benzodiazepinų struktūros pagrindas yra 5-aril-1,4-benzodiazepinas, kuriame benzeno žiedas yra prijungtas prie 1,4 –diazepino 6-7 jungties. 5-toje padėtyje paprastai prijungtas fenilo ar 2 –halofenilo žiedas (pav.1) [21].
1 pav. 5-fenil-1,4-benzodiazepino struktūros pagrindas, kur R‘ – Cl ar F; R1 – H, CH3; R2 – H, OH
ar COOH; R3 – NO2, Cl [21]
Į struktūrą gali būti įtraukta ir ciklinių sistemų, tokių kaip triazolo žiedas (pvz.: alprazolamas), imidazolo žiedas (pvz.: midazolamas) ar oksazolo žiedas (pvz.: kloksazolamas). Benzeno žiedas gali būti pakeistas tiofeno ar piridino žiedais [21].
1.1.4. Benzodiazepinų veikimo mechanizmas
Benzodiazepinai stiprina gama amino sviesto rūgšties (GABA) poveikį, kuri dalyvauja informacijos iš neurono į neuroną perdavime. GABA prisijungia prie neuronų GABA receptorių, atidaromi Na+ jonų kanalai ir neigiamai įkrautoms dalelėms (Cl- jonams) padedama patekti į neuroną. Perkrautas neuronas jį dirginantiems neurotransmiteriams pasidaro mažiau jautrus. Taip yra sukeliamas raminamasis poveikis smegenims. Yra išskiriami benzodiazepinų receptorių subtipai, pasižymintys skirtingu poveikiu. Benzodiazepinų receptorių subtipas alfa-1 pasižymi raminamuoju, o alfa-2 – nerimą mažinančiu poveikiu. Kartu su alfa-5 receptoriais, alfa-1 ir alfa-2 receptoriai apsaugo nuo traukulių išsivystymo. Veikiant benzodiazepinams, dėl sustiprėjusio GABA veikimo sumažėja aktyvinančių neurotransmiterių (norepinefrino, serotonino, acetilcholino ir dopamino) veikimas [13,37].
1.2. Benzodiazepinų klinikinis ir neklinikinis panaudojimas
1.2.1. Klinikinis panaudojimas
Benzodiazepinai yra naudojami kaip raminamieji, migdomieji, antidepresiniai, prieštraukuliniai, raumenis atpalaiduojantys ir anestetiniai preparatai. Trumpo poveikio benzodiazepinai skiriami miego sutrikimų gydymui dėl jų sedacinio poveikio. Jie gali būti skiriami tik esant ūmiai nemigai, kuri lydima stipraus streso ir darbingumo sutrikimo. Tuo tarpu ilgiau veikiantys benzodiazepinai naudojami įvairių formų nerimo gydymui: generalizuotam nerimui, panikos, adaptacijos sutrikimams. Po traumos sukelto streso ir obsesinio uždegimo sutrikimams bei panikos priepuoliams, susijusiems su fobijomis, dažnai skiriami alprazolamas, klobazamas, klonazepamas ir etizolamas. Kai kurie ilgai veikiantys benzodiazepinai, tokie kaip diazepamas ir tetrazepamas, naudojami raumenų spazmams malšinti. Diazepamas taip pat skiriamas alkoholio abstinencijos simptomų mažinimui. Sergant epilepsija, benzodiazepinai skiriami pasireiškus ūminiams traukuliams. Anestezijai sukelti paprastai skiriami trumpo poveikio benzodiazepinai (paprastai midazolamas), atliekant nedideles invazines procedūras (pvz.: endoskopijas) [14,60].
1.2.2. Neklinikinis panaudojimas
Neklinikiniais tikslais benzodiazepinai yra vartojami narkotikų, tokių kaip heroinas ir kokainas, poveikio sustiprinimui ir siekiant sumažinti pasikartojančių simptomų (pvz.: hipereuforijos, veržlumo, stipraus sujaudinimo) poveikį, vartojant didesnes narkotikų dozes [23]. Taip pat benzodiazepino dariniai naudojami nusikaltimų (dažniausiai išprievartavimų) atvejais. Tam tikslui naudojami flunitrazepamas, midazolamas, temazepamas ir klonazepamas, nors yra tinkami beveik visi [53]. Žinoma ir atvejų, kada benzodiazepinai buvo vartojami tyčiniam apsinuodijimui suicidiniais tikslais [41].
1.3. Benzodiazepinų vartojimo paplitimas
1.3.1. Benzodiazepinų vartojimas Lietuvoje
Analizuojant vaistų vartojimą Lietuvoje, naudojama Pasaulinės Sveikatos Organizacijos (PSO) patvirtinta ATC/DDD metodika, padedanti palyginti suvartotų vaistų statistiką tarptautiniu lygmeniu [61].
Lietuvoje informacija apie vaistų vartojimą yra kaupiama ir analizuojama Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos (VVKT) duomenų bazėje. Suvartojimas išreikštas vaisto nustatyta paros doze (DDD), tenkančia 1000 gyventojų per dieną (DDD/1000 gyv. /d.). Remiantis 2016 metų statistika, Lietuvoje benzodiazepino darinių buvo suvartota 40,733 DDD/1000 gyv. /d. Iš šios grupės preparatų 2016 metais daugiausiai suvartota lorazepamo 18,687 DDD/1000 gyv./d., o tai sudaro 45,88 proc. visų vartojamų benzodiazepino darinių. Toliau pateiktas kitų daugiausiai suvartojamų benzodiazepinų suvartojamas kiekis mažėjančia tvarka: alprazolamas – 8,851 DDD/1000 gyv. /d, bromazepamas – 6,284 DDD/1000 gyv. /d., diazepamas – 5,072 DDD/1000 gyv. /d., triazolamas – 2,235 DDD/1000 gyv. /d., klonazepamas – 2,132 DDD/1000 gyv. /d., medazepamas – 0,884 DDD/1000 gyv. /d., klorazepato kalio druska – 0,704 DDD/1000 gyv. /d. [6].
1.3.2. Benzodiazepinų vartojimas pasaulyje
Kadangi įvairiose šalyse skiriasi benzodiazepinų dozės ir vartojimo praktika, sudėtinga labai tiksliai įvertinti vaistų vartojimą. Todėl Tarptautinė narkotikų kontrolės valdyba (INCB) vietoj DDD kaip techninį vartojimo vienetą naudoja S-DDD (nustatyta paros dozė statistinėms reikmėms). Vaistų suvartojamumas paprastai išreiškiamas vaisto nustatyta paros doze statistinėms reikmėms, tenkančia 1000 gyventojų per dieną (S-DDD/1000 gyv./d.) [51].
Remiantis 2016 metų statistika, pasaulyje bendras benzodiazepino darinių vartojimas sudarė 24 mlrd. S-DDD. 2016 m. 64 šalys pateikė nacionalinius bent vieno benzodiazepino tipo vaisto vartojimo duomenis. Remiantis šiais duomenimis, buvo pranešta, kad bendrai benzodiazepinų suvartota 14, 6 mlrd. S-DDD. Didžiausias vartojimas buvo pastebėtas (mažėjančia tvarka): Jungtinėse Amerikos Valstijose (JAV), Indijoje, Brazilijoje, Argentinoje, Kanadoje, Meksikoje, Kinijoje ir Serbijoje. Tačiau vertinant DDD/1000 gyv./d., didžiausias vartojimas buvo stebimas Airijoje (409 S-DDD/1000gyv./d.), Serbijoje (95,6 S-S-DDD/1000gyv./d.), Portugalijoje (93 S-DDD/1000gyv./d.) ir Kroatijoje (80 S-DDD/1000gyv./d.) [54].
Daugiausiai iš visų benzodiazepino darinių 2016 metais pasaulyje buvo suvartota diazepamo, alprazolamo ir lorazepamo. Pagal diazepamo vartojimo lygį pirmavo Brazilija (1 mlrd. S-DDD), po to sekė Indija (394 mln. DDD), JAV (284 mln. DDD), Kinija (126 mln. DDD), Serbija (87 mln. S-DDD), Meksika (84 mln. S-S-DDD), Jungtinė Karalystė (52 mln. S-S-DDD), Argentina (43 mln. S-DDD) ir Čilė (30 mln. S-DDD). Tačiau, vertinant S-DDD 1000 gyventojų per dieną, didžiausią suvartojimo rodiklį nurodė Serbija (25 S-DDD/1000 gyv. /d.), Bolivija (18 S-DDD/1000 gyv. /d.), Juodkalnija (16 S-DDD/1000 gyv. /d.), Brazilija (13 S-DDD/1000 gyv. /d.) ir Urugvajus (12 S-DDD/1000 gyv. /d.). Kalbant apie alprazolamą, didžiausias jo vartojimas buvo nustatytas Vengrijoje (58 S-DDD/1000
gyv./d.), JAV (44,3 S-DDD/1000 gyv./d.), Argentinoje (39,5 S-DDD/1000 gyv./d.), Urugvajuje (35,8 S-DDD/1000 gyv./d.), Juodkalnijoje (13,2 S-DDD/1000 gyv./d.), Islandijoje (8,8 S-DDD/1000 gyv./d.), Lietuvoje ir Afganistane (8 S-DDD/1000 gyv./d.). Lorazepamo didžiausias vartojimas buvo užfiksuotas Airijoje (441 S-DDD/1000 gyv./d.), Ispanijoje (27 S-DDD/1000 gyv./d.), Portugalijoje (23 S-DDD/1000 gyv./d.), Andoroje (16 S-DDD/1000 gyv./d.), Vokietijoje (16 S-DDD/1000 gyv./d.)., Italijoje (13 S-DDD/1000 gyv./d.) ir Graikijoje (12 S-DDD/1000 gyv./d.) [54].
1.4. Apsinuodijimas benzodiazepinais
Benzodiazepino dariniai užima svarbią vietą tiriant įvairius apsinuodijimus. Išanalizavus apsinuodijimų statistiką Lietuvoje, remiantis 2003-2010 metais atliktu tyrimu, matyti, kad dažniausiai atsitiktinai apsinuodijama benzodiazepinų grupės junginiais, ir tai sudarė net 41 proc. visų apsinuodijimų [1]. Nuo 2010 iki 2014 metų Klaipėdos apskrityje buvo atliktas tyrimas apie psichoaktyvių medžiagų vartojimą ir perdozavimą. Gauti rezultatai parodė, kad 30,8 proc. žmonių mirčių sudarė būtent apsinuodijimas benzodiazepino dariniais [3].
Analizuojant pasaulio mastu, literatūroje aprašyta nemažai klinikinių atvejų, susijusių su apsinuodijimu benzodiazepino dariniais. Pastebėta, kad per septynerius metus apsinuodijimų benzodiazepino dariniais skaičius išaugo labiausiai [12]. Remiantis Amerikos Ligų kontrolės ir prevencijos centrais (angl. „Centers for Disease Control and Prevention“) apsinuodijimų skaičius benzodiazepino dariniais nuolat auga. Nuo 2010 metų iki 2013 metų mirčių, tenkančių 100 tūkst. gyventojų, skaičius dėl benzodiazepinų perdozavimo išaugo nuo 0,58 proc. iki 3, 07 proc. [52].
1.5. Benzodiazepinų nustatymas
Siekiant atlikti benzodiazepinų analizę, atsižvelgiama į turimus laboratorinius išteklius ir įrangą. Paprastai, kai įmanoma, turėtų būti tiriami bent 2 parametrai ir naudojami skirtingi analizės metodai: spalviniai testai, chromatografiniai, spektroskopija ir kt. Naudojant sujungtą technologiją, pavyzdžiui, dujų chromatografija su masių spektrometrija, skaičiuojama kaip du parametrai, gaunant informaciją iš abiejų naudojamų technikų, šiuo atveju sulaikymo laiko ir masių spektro charakteristikų [49].
Literatūroje aprašoma daug skirtingų metodų benzodiazepino darinių nustatymui. Išskiriami šie metodai, naudojami benzodiazepino darinių analizei:
Chromatografiniai – skysčių chromatografija (efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), ultraefektyvioji skysčių chromatografija (UESC), micelinė skysčių chromatografija (MSC), dujų chromatografija (DC), plonasluoksnė chromatografija (PC);
Kapiliarinis elektrinis atskyrimas – micelinė elektrokinetinė kapiliarinė chromatografija (MEKC), kapiliarinė elektroforezė (CE);
Imunologiniai tyrimai;
Fotometrija – UV spektrometrija, Furjė transformacijos infraraudonųjų spindulių spektroskopija (FTIR);
Elektroanalitiniai – potenciometriniai, voltamperometriniai ir polarografiniai [56].
1.5.1. Chromatografiniai metodai taikomi benzodiazepinų analizei
Tai dažniausiai benzodiazepinų nustatymui taikomi metodai. Svarbią vietą iš chromatografinių technikų užima plonasluoksnė chromatografija, skysčių chromatografija ir dujų chromatografija [45].
Plonasluoksnė chromatografija – tai paprastas, pigus ir greitas metodas, naudojamas junginių atskyrimui. Paprastai daugelyje metodikų toksikologinei analizei benzodiazepino dariniai pirmiausia yra hidrolizuojami į atitinkamus benzofenonus, kurie vėliau identifikuojami plonasluoksnės chromatografijos būdu. Tačiau šis metodas turi minusų, nes skirtingi benzodiazepinai skilimo metu sudaro tokius pat benzofenonus, dėl ko neįmanoma jų atskirti. Taip pat hidrolizės taikymas nėra tinkamas visiems benzodiazepino dariniams, nes kai kurie benzodiazepinai, pavyzdžiui, tokie kaip triazolamas, alprazolamas ir klobazamas, nesudaro benzofenonų. Tad paskutiniu metu plonasluoksnė chromatografija vis rečiau taikoma benzodiazepino darinių analizei [42].
Visgi populiariausiais metodais benzodiazepino darinių atskyrimui išlieka dujų chromatografija ir efektyvioji skysčių chromatografija. Paprastai šie metodai yra kombinuojami su įvairiais detektoriais. Tokios metodikos yra labai jautrios ir specifiškos [45].
Dujų chromatografija pasižymi dideliu jautrumu, tačiau turi trūkumų: kadangi reikalinga aukšta temperatūra, kai kurie benzodiazepinai gali suskilti. Literatūroje aprašoma nemažai tyrimų, kai benzodiazepino darinių nustatymas atliekamas skirtingais detektoriais. Prie dujų chromatografo prijungtas elektronų gaudymo detektorius (ECD) rodo didelį jautrumą halogenams, esantiems benzodiazepinų struktūroje, o azoto-fosforo detektorius (NPD) yra tinkamas analizuoti benzodiazepinams, turintiems sudėtyje azotą. Liepsnos jonizacinis detektorius (FID) paprastai nesuteikia pakankamo jautrumo, tinkamo benzodiazepino darinių analizei, ir kai kuriems junginiams
duoda tuos pačius pikus. Tuo tarpu dujų chromatografija su masių spektrometrija (DC-MS) yra labai specifinis benzodiazepino darinių patvirtinimo metodas ir pasižymi dideliu jautrumu [36,46].
Lyginant su dujų chromatografijos metodu, efektyviosios skysčių chromatografijos metodui trūksta jautrumo, tačiau šis metodas yra svarbus nustatant polines, didelės masės molekules arba termiškai labiliuosius benzodiazepinus, kuriems DC metodas netaikomas. ESC bezodiazepino darinių nustatymui paprastai taikoma prijungiant MS, UV ar fotodiodų matricos (DAD) detektorius. UV detektorius naudojamas dėl jo paprastumo ir pakankamo jautrumo. ESC-DAD metodas pasižymi dideliu jautrumu, identifikuojant junginius su skirtingomis savybėmis vienoje chromatografinėje analizėje. Tuo tarpu ESC sujungta su masių spektrometru pasirodė esanti svarbi alternatyva įprastoms DC-MS sistemoms, identifikuojant naujus benzodiazepino darinių metabolitus [34,56].
Vis populiarėja ir daugėja tyrimų, kuriuose benzodiazepinų analizė atliekama skysčių chromatografijos su tandeminės masių spektrometrijos (SC-MS/MS) metodu, nes didėja aptikimo riba ir išvengiama derivatizacijos proceso [38]. Buvo sukurtas ir patvirtintas ultraefektyvios skysčių chromatografijos-tandeminės masės spektrometrijos (UESC-MS/MS) metodas, kuris labai jautrus nustatant benzodiazepino darinius žmogaus šlapime [30,44], kraujyje [40], serume [20], plazmoje [26] bei plaukuose [27].
1.5.2. Derivatizacija
Benzodiazepino darinių struktūroje esantys hidroksilo ir amino pakaitai gali apriboti dujų chromatografijos efektyvumą, todėl gali būti naudojama derivatizacija. Šio proceso metu junginiai yra chemiškai modifikuojami. Prie tiriamų junginių yra prijungiamos funkcinės grupės, padedančios juos identifikuoti. Gauti junginiai pasižymi naujomis savybėmis, kurios yra tinkamos atlikti analizei [36].
Yra išskiriami 3 pagrindiniai taikomi derivatizacijos metodai: acetilinimas, alkilinimas ir sililinimas. Jų metu formuojami sililo, acilo ir alkilo derivatai [36].
Sililinimas yra plačiausiai naudojamas derivatizacijos metodas. Jo metu naudojami mažai pavojingi reagentai, tačiau būtina juos saugoti nuo drėgmės poveikio. Šiuo metodu derivatizuoti junginiai pasižymi terminiu stabilumu. Taip pat gauti derivatai turi pranašumą tuo, kad jie duoda stabilius, aukštos molekulinės masės jonus masės spektrometrijai. Tačiau sililinti ekstraktai iš biologinių terpių linkę būti nešvarūs ir nėra tinkami analizei, naudojant azoto-fosforo detektorių. Taip pat sililinimas netinkamas ir naudojant elektronų gaudymo detektorių. Reagentai reaguoja su junginių komponentais, turinčiais OH, SH ir NH grupes [36,55].
Acetilinimo metu gaunami derivatai pasižymi mažesniu poliškumu, lyginant su gautais sililinimo metu. Taip pat gautiems derivatams gali būti atliekamos tolesnės valymo procedūros prieš
analizę. Acetilinimo reagentai reaguoja su didelio poliškumo funkcinėmis grupėmis - amino rūgštimis ir karbohidratais [36,55].
Alkilinimo metu taip pat sumažinamas junginio poliškumas, pakeičiant jo hidroksilo, karboksilo grupes alkilo grupėmis. Šio proceso metu suformuojami esteriai, eteriai. Plačiausiai taikomas – esterių formavimas, nes jie yra stabilūs, greitai suformuojami ir tinkami kiekybinei analizei. Kaip ir acetilinimo metodu gautiems derivatams, taip ir alkilinimo metodu susidariusiems derivatams galima taikyti valymo procedūras prieš atliekant analizę. [36,55]
Kai junginyje yra keletas skirtingų funkcinių grupių, galima taikyti ir skirtingus derivatizacijos metodus [36].
Paprastai benzodiazepino darinių didelės koncentracijos (1-2 µg) gali būti aptiktos ir be derivatizacijos. Tačiau jei junginys termiškai nestabilus, labai sunku ir praktiškai neįmanoma jį nustatyti be derivatizacijos proceso. Tad derivatizacija padeda išspręsti šią problemą [45].
1.5.3. DC- MS metodikų taikymas benzodiazepino darinių nustatymui
Dujų chromatografija su masių spektrometrija yra viena dažniausiai naudojamų technikų teismo ekspertizės vaistų mėginių nustatymui ir kiekybiniam įvertinimui. Tokia kombinuota technika pateikia labai specifinius spektrinius duomenis apie atskirus junginius sudėtingame junginių mišinyje [46].
Literatūros šaltiniuose pateikiama įvairių dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodikų, kurios gali būti naudojamos benzodiazepino darinių analizei vaistiniuose preparatuose ir biologinėse terpėse. Autoriai siūlo skirtingas metodikas pavienių benzodiazepino darinių ar benzodiazepino darinių mišinio analizei [33-36,45,46,49,50,57].
Lietuvoje buvo atliktas tyrimas, siekiant atskirti klonazepamą ir jo metabolitą 7-klonazepamą kraujyje. Naudota dujų chromatografija-masių spektrometrija su neigiama chemine jonizacija. Prieš analizę taikyta kietafazė ekstrakcija ir derivatizacija. Chromatografinės sąlygos: kapiliarinė kolonėlė DB-5-HT (30 m x 0,32 mm x 0,10 μm). Taikytas gradientinis temperatūros kitimas: pradinė temperatūra – 180°C, kuri keliama 40°C/min. iki 325°C ir laikoma 1 min. Nešančios dujos – helis, tekėjimo greitis – 3,5 ml/min. DC-MS jungties temperatūra – 300°C, jonų šaltinio temperatūra – 150°C. Masių spektro nuskaitymo diapazonas – nuo 30 iki 700 m/z [2].
Jungtinių Tautų Narkotikų ir nusikalstamumo biuras (UNODC) [49] benzodiazepino darinių analizei siūlo tokią DC-MS metodiką: kolonėlė – 10-15 m ilgio, 0,32 ar 0,53 mm išorinio diametro ir 1,5-3 μm skystos, nejudančios fazės storio (fazė – silikagelis, metilsilikonas). Gradientinis temperatūros kitimo režimas: 4 min. laikoma 135°C, keliama 13°C/min. iki 200°C, tada keliama 6°C/min. iki 312°C ir laikoma 6 min. Nešančios dujos – helis, tekėjimo greitis – 1ml/min. Injektoriaus
temperatūra – nuo 250 iki 300°C. DC-MS jungties temperatūra – 280°C, jonų šaltinio temperatūra – 230°C. Bendras jonų signalas registruojamas ir masių spektrai nuskaitomi iki 500 m/z.
SHIMADZU korporacija [57] pateikė metodiką, kuri tinkama benzodiazepinų: flunitrazepamo, flutoprazepamo, flurazepamo, fludiazepamo, diazepamo, estazolamo, etizolamo, medazepamo ir midazolamo atskyrimui. Junginių skirstymui buvo naudojama Rxi-5Sil MS kolonėlė (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). Nešančios dujos – helis, tekėjimo greitis – 3 ml/min. Injekavimo modelis – nepertraukiamas (ang. splitless). Taikytas gradientinis temperatūros kitimas: pirminė temperatūra – 60°C, laikoma 2 min., toliau keliama 10°C/min. iki 320°C ir laikoma 10 minučių. DC-MS jungties temperatūra – 280°C, jonų šaltinio temperatūra – 200°C, masių spektro nuskaitymo diapazonas – nuo 35 iki 600 m/z.
Autorius A. de Bairros ir kt. [9] tyrė benzodiazepinus šlapime. Buvo sėkmingai atskirti šie benzodiazepino dariniai: medazepamas, diazepamas, nordiazepamas, flunitrazepamas, chlordiazepoksidas, oksazepamas, nitrazepamas, 7- aminoflunitrazepamas, lorazepamas, klonazepamas ir 7-aminoklonazepamas. Pirmiausiai buvo atlikta vaistų skystafazė ekstrakcija iš biologinės terpės. Po ekstrakcijos atlikta dviguba derivatizacija ir toliau buvo taikyta ši DC-MS metodika: naudota HP-5MS kapiliarinė kolonėlė (30 m x 0,25 mm x 0,1 µm), nešančios dujos – helis, tekėjimo greitis – 1 ml/min. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas: 150°C temperatūroje laikoma 1 minutę, tada keliama 30°C/min. iki 220°C ir laikoma 1 minutę, galiausiai keliama 20°C/min. iki 300°C ir
laikoma 3 min. DC-MS jungties temperatūra – 260°C, jonų šaltinio temperatūra – 280°C.
Autorių M. Acikkol ir kt. [7] bei G. Famiglini ir kt. [17] atliktuose tyrimuose buvo naudojama tokia pati HP-5MS kapiliarinė kolonėlė (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) benzodiazepinų nustatymui alkoholiniuose ir nealkoholiniuose gėrimuose. Pirmame tyrime buvo nustatyti šie benzodiazepinai: diazepamas, flunitrazepamas, klonazepamas ir alprazolamas, o antrame tyrime be minėtųjų (išskyrus alprazolamą) dar buvo nustatytas chlordiazepoksidas, klobazamas, bromazepamas, flurazepamas ir nitrazepamas. Injektoriaus temperatūra – 250°C. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas: pradinė temperatūra – 150°C, keliama 20°C/ min iki 280°C ir laikoma galiausiai 15min., o kitame tyrime – 5 min. DC-MS jungties temperatūra – 300°C, jonų šaltinio temperatūra – atitinkamai 230°C ir 280°C. Masių spektro nuskaitymo diapazonas – nuo 50 iki 600 m/z.
L.Gutam ir kitų tyrėjų [19] moksliniame darbe buvo atskirti 3 benzodiazepinai: diazepamas, flunitrazepamas ir temazepamas. Kaip ir prieš tai aprašytuose tyrimuose buvo taikytas toks pat gradientinis temperatūros kitimas, injektoriaus temperatūra ir masių jonų šaltinio temperatūra. Nešančios dujos – helis, tėkmės greitis – 1,3 ml/min. Tyrimui buvo naudojama ZB1 kapiliarinė kolonėlė (30 m x 0,25mm x 0,25 µm).
Dar viename analizuotame E. Perez ir kt. [33] moksliniame straipsnyje buvo sėkmingai atskirti 5 benzodiazepinai šlapime: alprazolamas, lorazepamas, klonazepamas, diazepamas ir
temazepamas. Analizei naudota kapiliarinė kolonėlė HP-ULTRA 1 (15 m x 0,20 mm x 0,33 μm). Nešančios dujos – helis, tekėjimo greitis – 0,9 ml/min. Injektoriaus temperatūra – 295°C. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas: 190°C laikoma 3 minutes, tada keliama 35 °C/min. iki 295°C ir laikoma 1,2 min., toliau keliama 35°C/min. iki 310°C ir laikoma 2 min.
M. Pujado ir kitų mokslininkų [35] atliktame tyrime buvo atskirti 6 benzodiazepinai seilėse: flunitrazepamas, alprazolamas, diazepamas, oksazepamas, klonazepamas, dikalio klorazepatas. Prieš analizę taikyta derivatizacija. Analizei atlikti naudota Ultra 1 kolonėlė (16,5 m x 0,20 mm x 0,11 μm). Nešančios dujos – helis, tekėjimo greitis – 0,8 ml/min. Injektoriaus temperatūra – 280°C. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas: pradinė temperatūra – 70°C, kurioje laikoma 2 min., keliama 30°C/min. iki 160°C, toliau keliama 5°C/min. iki 170°C, tada 20°C/min. keliama iki 200°C, 10°C/min. – iki 220°C ir galiausiai keliama 30°C/min. iki 300°C. DC-MS jungties temperatūra – 280°C. Masių spektro nustatymo diapazonas – nuo 40 iki 550 m/z.
L. Wang kartu su kitais mokslininkais [50] nustatinėjo benzodiazepinus mėsoje. Buvo sėkmingai nustatyti 4 benzodiazepino dariniai: diazepamas, estazolamas, alprazolamas, triazolamas. Pirmiausiai buvo atlikta vaistų kietafazė ekstrakcija. Po ekstrakcijos toliau benzodiazepino darinių nustatymui buvo taikyta ši DC-MS metodika: naudota DB-5MS kapiliarinė kolonėlė (30m x 0,25 mm x 0,25 μm). Nešančios dujos – helis, tekėjimo greitis – 1,1 ml/min. Injektoriaus temperatūra - 300°C. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas: pradinė temperatūra - 100°C, kuri laikoma 1 min., toliau keliama 25°C/min. iki 310°C ir laikoma 4 min. DC-MS jungties temperatūra – 280°C, jonų šaltinio temperatūra – 230 °C, masių spektro nuskaitymo diapazonas – nuo 40 iki 400 m/z.
Literatūroje taip pat yra siūloma metodikų ir pavienių benzodiazepinų nustatymui. Naudojama
kapiliarinė kolonėlė HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). Nešančios dujos – helis, tėkmės greitis –
1,5 ml/min. Taikomas skirtingas gradientinis temperatūros kitimas. Masių spektro nuskaitymo diapazonas – nuo 100 iki 560 m/z [11,24].
1.5.4. ESC metodikų taikymas benzodiazepino darinių nustatymui
Efektyvioji skysčių chromatografija iki šiol užima svarbią vietą benzodiazepino darinių analizėje. Efektyvioji skysčių chromatografija su ultravioletinio-regimojo spektro absorbcijos (UV/VIS) ir fotodiodų matricos (DAD) detektoriais dažniausiai naudojamos technikos benzodiazepino darinių nustatymui farmacinėse vaistų formose ir biologinėse terpėse. Tokios kombinuotos metodikos labai padidina analizės jautrumą ir efektyvumą [34].
Literatūros šaltiniuose yra siūloma daug įvairių efektyviosios skysčių chromatografijos, sujungtos su UV ar DAD detektoriais, metodikų, kurios gali būti naudojamos benzodiazepino darinių analizei vaistiniuose preparatuose ir biologiniuose objektuose. Mokslininkai siūlo skirtingas metodikas
benzodiazepino darinių mišinio ar pavienių benzodiazepino darinių aptikimui ir nustatymui [25,31,32, 36,47-49].
Lietuvoje buvo atliktas tyrimas, analizuojant 3 benzodiazepino darinius mišinyje: alprazolamą, medazepamą, chlordiazepoksidą. Buvo išbandytos skirtingos mobilios fazės, siekiant atskirti visus junginius. Tyrimo metu buvo nustatytos šios tinkamiausios sąlygos mišinyje esančių junginių nustatymui: kolonėlė „SinChropak RP-P (C18)“ (250 mm x 4,6 mm x 3,5 μm), mobili fazė sudaryta iš fosfatinio buferio ir etannitrilo (55:45), tėkmės greitis – 1-2 ml/min. Detektorius – UV/VIS, junginių nustatymo bangos ilgis – 254 nm [5]. Tais pačiais metais, naudojant tokias pat chromatografines sąlygas pavyko sėkmingai atskirti ir 5 benzodiazepino darinius [4].
Jungtinių Tautų Narkotikų ir nusikalstamumo biuras [49] benzodiazepinų nustatymui siūlo tokią metodiką: ODS-Hypersil kolonėlė (250 mm x 5 mm x 5μm). Mobili fazė siūloma dviejų rūšių – metanolis : vanduo : 0,1M fosfatinis buferis (55:25:20), pH = 7,25 arba metanolis: vanduo: 0.1 M fosfatinis buferis (70:10:20), pH = 7,67. Tėkmės greitis – 1,5 ml/min. Detektorius – UV arba DAD, medžiagų aptikimui siūlomas bangos ilgis – 240 nm.
A.El Mahjoub ir kitų mokslininkų [28] atliktame tyrime buvo nustatyti 5 benzodiazepinai kraujyje. Pirmiausiai atskirti 2 benzodiazepinai – oksazepamas ir diazepamas, tada kiti 3 benzodiazepinai – klonazepamas, flunitrazepamas, midazolamas. Analizei atlikti buvo naudojama C8 atvirkštinių fazių kolonėlė (125 mm x 3 mm x 5µm), tekėjimo greitis – 0,3 ml/min, analizės temperatūra – 25 °C. Kaip mobili fazė buvo naudojamas fosfatinis buferis (pH = 2,1) ir acetonitrilas (65:35). Detektorius – DAD, bangos ilgis – 220 nm.
Taip pat yra ir kitų autorių, kurie naudojo tą pačią mobilią fazę ir detektorių benzodiazepinų nustatymui mišinyje [10,18]. Skyrėsi tyrimuose naudotos kolonėlės bei nustatomų benzodiazepino darinių kiekis. P. Fernandez ir kt. mokslininkų [18] atliktame tyrime buvo naudojama RP8 kolonėlė (250 mm x 4,6 mm x 5µm), tekėjimo greitis – 0,8 ml/min. Benzodiazepino darinių išskyrimui iš kraujo plazmos buvo taikyta kietafazė ekstrakcija. Šio tyrimo metu sėkmingai buvo nustatyti 6 benzodiazepinai – bromazepamas, alprazolamas, lorazepamas, lormetazepamas, diazepamas, tetrazepamas. Junginių nustatymo bangos ilgis – 230 nm. Tuo tarpu A. Bugey ir kt. [10] atliktame tyrime buvo naudojama „Chromolith Performance RP-18e“ kolonėlė (100 mm x 4,6 mm), tekėjimo greitis – 2 ml/min. Tyrimo metu buvo nustatyti 8 benzodiazepinai kraujyje, atskirai po 4 grupėse: klonazepamas, diazepamas, flunitrazepamas, oksazepamas, kita grupė – lorazepamas, desalkilflurazepamas, midazolamas ir nordazepamas. Junginių aptikimo bangos ilgis – 220 nm.
Tačiau literatūroje aprašomos ir kitokios analizės sąlygos, tinkamos benzodiazepinų nustatymui. Keli autoriai [22,39,47,48] benzodiazepinams nustatyti naudojo mobilią fazę, sudarytą iš metanolio, 0,05 M amonio acetato ir acetonitrilo (skirtingais santykiais), nustatymo bangos ilgis – 240 nm. Skyrėsi tyrimuose naudotos kolonėlės ir nustatytų benzodiazepinų skaičius. H. al Hawasli ir kitų
kartu dirbusių mokslininkų [22] tyrime buvo naudota RP-C18 kolonėlė (250 mm x 4,6 mm x 3 µm), tekėjimo greitis – 1,3 ml/min. Buvo nustatyti 3 benzodiazepinai mišinyje: bromazepamas, midazolamas, medazepamas. Junginių aptikimui naudotas UV detektorius. Tuo tarpu V. F. Samanidou ir kt. [39] atliktame tyrime buvo naudojama „Inertsil C8” kolonėlė (250 mm x 4 mm x 5 µm), tekėjimo greitis – 1 ml/min. Benzodiazepino darinių išskyrimui iš biologinių skysčių (šlapimo ir plazmos) buvo taikyta kietafazė ektrakcija. Tyrimo metu buvo nustatyti 4 benzodiazepinai: alprazolamas, bromazepamas, diazepamas ir flunitrazepamas.
M.N. Uddin ir kt. [47,48] išvystė paprastą, greitą ir patikimą ESC metodą benzodiazepino darinių nustatymui, taikant kietafazę ekstrakciją iš plazmos, šlapimo ir seilių. Tyrime buvo naudojama „Kromasil C8” kolonėlė (250 mm x 4 mm x 5 µm), tekėjimo greitis – 1 ml/min. Naudota tokia pati mobili fazė kaip anksčiau minėtuose tyrimuose. Viename tyrime buvo nustatyti 6 benzodiazepinai mišinyje: alprazolamas, bromazepamas, klonazepamas, flunitrazepamas, diazepamas ir lorazepamas. Junginių aptikimui naudotas UV detektorius, aptikimo bangos ilgis – 240 nm. Metais vėliau atliktame moksliniame tyrime buvo nustatyti 6 benzodiazepinai ir 3 tricikliai antidepresantai mišinyje. Tyrimas taip pat buvo atliktas ir su farmacinėmis vaistų formomis. Junginių aptikimui naudotas fotodiodų matricos detektorius, aptikimo bangos ilgis – 240 nm.
Dar vienas jautrus metodas buvo pateiktas autoriaus S. Thangadurai ir kitų mokslininkų [43] atliktame tyrime, kurio metu sėkmingai buvo atskirti 4 benzodiazepinai farmacinėse formose: klobazamas, klonazepamas, flurazepamas, midazolamas, naudojant 4 skirtingas mobilias fazes: metanolis: vanduo (60:40), metanolis: acetonitrilas: vanduo (45:40:15), metanolis: acetonitrilas: vanduo (70:25:5) ir metanolis: acetonitrilas (60:40). Naudota atvirkštinių fazių kolonėlė „Flexar Quartenary C18” (250 mm x 4,6 mm x 5 µm), tekėjimo greitis – 1 ml/min. Detektorius – UV, bangos ilgis – 254 nm.
G. Kazemifard kartu su kitais mokslininkais [27] pasiūlė jautrų, tikslų benzodiazepino darinių nustatymui skirtą metodą, kuriuo buvo sėkmingai atskirti 7 benzodiazepinai farmacinėse formose: alprazolamas, chlordiazepoksidas, diazepamas, flurazepamas, lorazepamas, nitrazepamas ir nordiazepamas. Analizei atlikti naudota „Perfectsil Target ODS-3” kolonėlė (125 mm x 4 mm x 5 µm), tekėjimo greitis – 1,6 ml/min. Tyrimui naudota mobili fazė, sudaryta iš metanolio ir 0,05 M fosfatinio buferio (50:50). Junginiams aptikti naudotas UV detektorius, bangos ilgis – 254 nm.
Literatūroje galima rasti ir metodikų, skirtų pavienių benzodiazepino darinių nustatymui. Keli autoriai aprašė tik po vieno benzodiazepino atskyrimą [15,16,32]. Jiems atskirti dažniausiai naudojama mobili fazė, sudaryta iš acetonitrilo, metanolio ir vandens (skirtingais santykiais) ar acetonitrilo ir fosfatinio buferio. Naudojamos analitinės kolonėlės: „C18 MZ” (250 mm x 4,6 mm x 5 µm), „Nukleosil C18” (150 mm x 4,6 mm x 5 µm), „Hypersil ODS” (200 mm x 4,6 mm x 5 µm). Detektorius – DAD ar UV, junginių nustatymo bangos ilgis svyruoja nuo 200 iki 260 nm.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo planavimas
Siekiant nuodugniai ir tinkamai atlikti tyrimą, buvo sudarytas darbų planas:
1. Atskirų benzodiazepinų (diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo, lorazepamo) išskyrimas iš tablečių.
2. Diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo mišinio kokybinė analizė, taikant dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodą.
3. Minėtų benzodiazepino darinių standartinių tirpalų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
4. Diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo vaistų mišinio kokybinė ir kiekybinė analizė, taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. Tyrimas buvo atliekamas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Medicinos akademijoje, Farmacijos fakultete, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedroje.
2.2. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – Lietuvoje dažniausiai vartojamų šešių skirtingų benzodiazepino darinių: diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo mišinys.
2.3. Medžiagos ir reagentai
Tyrimui atlikti buvo naudojamos šios medžiagos ir reagentai:
Diazepamo „Relanium“ 5 mg tabletės, medazepamo „Rudotel“ 10 mg tabletės, bromazepamo „Bromazepam Lannacher“ 3 mg tabletės, klonazepamo „Clonazepam TC“ 2 mg tabletės, alprazolamo „Xanax“ 1 mg tabletės, lorazepamo „Lorafen“ 2,5 mg tabletės, įsigytos Lietuvos vaistinėse;
Diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo, lorazepamo standartai („Sigma Aldrich“, Steinheim, Vokietija);
Metanolis ( ≥ 99,9 proc., „Sigma Aldrich“, Vokietija);
Acetonitrilas ir 0,1 proc. trifluoracto rūgšties (TFA) tirpalas („Sigma-Aldrich“, Vokietija);
2.4. Prietaisai ir priemonės
Tyrimui atlikti buvo naudojamos šios priemonės:
Termostatinė ultragarsinė vonelė („Heidolph“, Vokietija);
Automatinės pipetės („Eppendorf Research“, Vokietija);
Q-Max membraniniai filtrai (25 mm; 0,45 μm dydžio poros, „Frisenette“, Vokietija);
Analitinės svarstyklės „Shimadzu Auw 120 D“ (Vokietija);
Vandens gryninimo sistema MILIPORE (Vokietija).
2.5. Kokybinis vertinimas DC-MS metodu
2.5.1. Įranga
Benzodiazepino darinių analizei naudotas dujų chromatografas „Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra system“ („Shimadzu Corporation“, Japonija) su masių spektrometrijos detektoriumi. Junginių atskyrimui naudota kapiliarinė kolonėlė Rxi-5 („Restek Corporation“, JAV), kurios ilgis – 30 m, vidinis diametras – 0,25 mm, sorbento dalelių dydis – 0,25 µm.
2.5.2. Chromatografinės sąlygos
Benzodiazepino darinių identifikavimui dujų chromatografo, sujungto su masių spektrometru, taikytos sąlygos: nešančios dujos – helis, tėkmės greitis – 1 ml/min. Injekcijos kiekis - 1 µl, susidariusios dujos pertraukiamai (angl. Split) perduodamos į kolonėlę, toliau dujų nešiklių srautą dalinant 1:5 santykiu. Slėgis – 89,5 kPa. Injektoriaus temperatūra - 260°C. DC-MS jungties temperatūra – 280°C, jonų šaltinio temperatūra – 200°C. Registruojamas bendras jonų signalas ir masių spektrai skenuojami tarp 40-400 m/z. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas (1 lentelė).
1 lentelė. Gradientinis temperatūros kitimas
Temperatūros kėlimo greitis, °C/min Temperatūra, °C Sulaikymo laikas, min
- 110 3,0
40 255 0,0
8 300 1,0
2.5.3. Tiriamųjų tirpalų paruošimas
Analizei atlikti buvo ruošiami tiriamieji benzodiazepino darinių tirpalai iš Lietuvoje registruotų vaistinių preparatų.
Buvo paimtas atitinkamas kiekvieno preparato tablečių kiekis, pasvertas ir sutrintas iki miltelių atskirose grūstuvėse. Milteliai perkelti į 10 ml kolbutes ir užpilti atititinkamu kiekiu 50 proc. šviežiai paruošto metanolio, kad tirpalo koncentracija gautųsi 1 mg/ml. Kolbutės užkimštos kamšteliais, sudėtos į ultragarso vonelę ir sonifikuotos 15-20 min. Tuomet tirpalai centrifuguoti 5 min., kad neištirpusios dalelės atsiskirtų nuo tirpalo. Tirpalai perfiltruoti pro 0,45 µm porų dydžio membraninį filtrą. Iš atskirų šešių metanolių tirpalų (D1, M1, B1, K1, A1, L1) paimta po 1 ml ir sumaišyta. Galutinė gauto mišinio (DMBKAL1) koncentracija – 1 mg/ml.
2.5.4. Analizė
Tirtų benzodiazepino darinių identifikavimas buvo atliktas iš gautų chromatogramų, naudojantis masių spektroskopijos bibliotekos duomenų baze „Lab Solution GCMS solution 2.71“ versijos „Shimadzu“ programa.
2.6. Kokybinis ir kiekybinis benzodiazepino darinių vertinimas ESC metodu
2.6.1. Įranga
Benzodiazepino darinių kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti naudotas skysčių chromatografas „Waters Alliance 2695“ („Waters Corporation“, JAV) su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 996“ („Waters Corporation“, JAV). Junginių atskyrimui naudota chromatografavimo kolonėlė ACE C18, kurios ilgis – 250 mm, vidinis diametras – 4,6 mm, sorbento dalelių dydis – 5 μm.
2.6.2. Chromatografinės sąlygos
Tyrimui naudota mobili fazė, sudaryta iš eliuento A – 0,1 proc. trifluoracto rūgšties (TFA) tirpalo ir eliuento B – acetonitrilo. Taikytas gradientinis eliuavimo būdas (2 lentelė). Kolonėlės
temperatūra – 25 ºC, tekėjimo greitis – 1 ml/min, injekcijos tūris – 1μl. Junginių aptikimas – ties 220 – 250 nm bangos ilgiu.
2 lentelė. Mobilios fazės sąlygos
Laikas (min) Eliuento tėkmės greitis (ml/min) A: 0,1 proc. TFA (proc.) B: Acetonitrilas (proc.) - 1,00 98,0 2,0 01:00 1,00 98,0 2,0 20:00 1,00 2,0 98,0 23:00 1,00 2,0 98,0 24:00 1,00 98,0 2,0
2.6.3. Standartinių tirpalų paruošimas
Standartiniai tirpalai ruošiami tirpinant kiekvienos veikliosios medžiagos (diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo, lorazepamo) standartą 50 proc. šviežiai ruoštame metanolyje. Pagaminti 1 mg/ml koncentracijos diazepamo (DS2), medazepamo (MS2), bromazepamo (BS2), klonazepamo (KS2), alprazolamo (AS2), lorazepamo (LS2) standartiniai tirpalai. Gauti tirpalai filtruojami pro 0,45 µm membraninį filtrą. Imama po 1 ml visų standartinių tirpalų ir sumaišoma. Galutinė gauto standartinių medžiagų mišinio (DMBKALS2) koncentracija – 1 mg/ml.
2.6.4. Tiriamųjų tirpalų paruošimas
Analizei atlikti buvo ruošiami tiriamieji benzodiazepino darinių tirpalai iš Lietuvoje registruotų vaistinių preparatų.
Kiekvieno vaistinio preparato (diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo) tabletės buvo pasvertos ir sutrintos iki miltelių atskirose grūstuvėse. Milteliai perkelti į 10 ml kolbutes ir užpilti atitinkamu kiekiu 50 proc. šviežiai paruošto metanolio, kad tirpalo koncentracija gautųsi 1 mg/ml. Užkimštos kamšteliais kolbutės, sudėtos į ultragarso vonelę ir sonifikuotos 15-20 min. Gauti tirpalai centrifuguoti 5 min. ir perfiltruoti pro 0,45 µm porų dydžio membraninį filtrą. Iš atskirų šešių metanolių tirpalų (D2, M2, B2, K2, A2, L2) paimta po 1 ml ir sumaišyta. Galutinė gauto mišinio (DMBKAL2) koncentracija – 1 mg/ml.
2.6.5. Analizė
Tirtų benzodiazepino darinių analizė atlikta lyginant tiriamųjų ir standartinių tirpalų chromatogramas. Kiekybinės analizės įvertinimui buvo paruošti 5 skirtingų koncentracijų standartiniai tirpalai: diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo – 0,05; 0,25; 0,125; 0,0625 ir 0,03125 mg/ml, lorazepamo – 0,25; 0,125; 0,0625; 0,03125; 0,015625 mg/ml.
2.7. Duomenų apdorojimas
Po atlikto tyrimo pagal gautas chromatogramas buvo vertinami junginių sulaikymo laikai. Surinkti duomenys apdoroti, naudojant SigmaPlot 12.5, Empower 3, winCATS 1.4.9 ir Microsoft
Office Excel 2013 programas.
2.8. Pasirinktų metodų validacija
Siekiant įvertinti pasirinkto metodo tinkamumą analizei, reikalinga jį validuoti. DC-MS metodas buvo taikytas tik kokybinei analizei, todėl buvo įvertintas junginių specifiškumas ir rezultatų glaudumas, kurį apima rezultatų pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas. ESC metodas buvo pritaikytas ir kiekybinei analizei, dėl to be minėtų procedūrų vertinamas tiesiškumas bei junginių aptikimo ir nustatymo ribos [59].
2.8.1. Metodų specifiškumo vertinimas
Specifiškumas apibrėžiamas kaip gebėjimas nustatyti tiriamojo junginio buvimą mėginyje [59].
Identifikuojant junginius dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu, pirmiausia įvertinta, ar junginiai vienas nuo kito aiškiai atsiskiria. Taikant masių spektrometriją, tie patys junginiai identifikuojami pagal tam tikros medžiagos masių spektrui būdingus jonus arba lyginant gautus spektrus su žinomų junginių masių spektrais. Identifikuojant junginius, naudojama kompiuterinė biblioteka, kurioje yra išmatuoti standartinių junginių masių spektrai.
Siekiant įvertinti pasirinkto efektyviosios skysčių chromatografijos metodo specifiškumą, tiriama, ar junginiai vienas nuo kito atsiskiria. Pirmiausiai atlikta analizė su benzodiazepino darinių standartinių tirpalų mišiniu (DMBKALS1), vėliau – su tiriamųjų tirpalų mišiniu (DMBKAL2).
2.8.2. Metodų rezultatų glaudumo vertinimas
Glaudumas parodo, kaip glaudžiai išsidėsčiusios reikšmės viena kitos atžvilgiu. Rezultatų glaudumo įvertinimui naudojami 2 parametrai: pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas [59].
Pakartojamumui įvertinti buvo atliekama mėginio analizė tą pačią dieną, leidžiant 6 mėginio injekcijas, esant toms pačioms sąlygoms. Rezultatų pakartojamumo ribos turi būti mažesnės nei 5 proc. [59].
Tarpinio preciziškumo įvertinimui tiriamasis mėginys buvo analizuojamas dvi dienas iš eilės, leidžiant 6 mėginio injekcijas tomis pačiomis sąlygomis. Tarpinio preciziškumo ribos turi būti mažesnės nei 10 proc. [59].
2.8.3. Tiesiškumo vertinimas
Tiesiškumas parodo smailės ploto tiesinę priklausomybę nuo medžiagos koncentracijos. Tiesiškumo įvertinimui naudotas kalibracinės kreivės metodas [59].
2.8.4. Aptikimo ir nustatymo ribų vertinimas
Aptikimo riba apibūdinama kaip mažiausias tiriamosios medžiagos kiekis mėginyje, kuris gali būti aptinkamas, bet nebūtinai nustatomas tiksliai kiekybiškai. Nustatymo riba apibūdinama kaip mažiausias tiriamosios medžiagos kiekis mėginyje, kuris gali būti tiksliai ir teisingai įvertinamas kiekybiškai. Benzodiazepino darinių aptikimo ir nustatymo ribos vertintos, lyginant medžiagos smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu. Kai smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo santykis 3:1, nustatyta tiriamųjų junginių aptikimo riba. Kai smailės aukščio ir bazinės linijos santykis 10:1 – nustatymo riba [59].
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. DC-MS metodikos parinkimas
Siekiant parinkti tinkamą metodiką tiriamų benzodiazepino darinių atskyrimui ir identifikavimui mišinyje, atlikta mokslinės literatūros šaltinių analizė. Analizuojamo mišinio analizei atlikti pasirinkta SHIMADZU [57] metodika. Kokybiniam junginių vertinimui naudotas masių spektrometrijos detektorius, nustatantis tiriamųjų medžiagų masių spektrus, pagal kuriuos sužinoma molekulinė junginio masė. Tyrimui naudota Rxi-5 kapiliarinė kolonėlė (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). Pakoreguotas gradientinis temperatūros kitimas: pirminė temperatūra - 110 °C, laikoma 3 min., toliau keliama 40°C/min. iki 255°C, tada keliama 8°C/min. iki 300°C ir laikoma 1 min., vėl keliama 40°C/min. iki 320°C ir laikoma 5 min. Sumažintas tėkmės greitis nuo 3 ml/min. iki 1 ml/min.
3.2. Benzodiazepino darinių identifikavimas DC-MS metodu
Atlikus mėginių chromatografinę analizę, benzodiazepino dariniai identifikuoti, naudojantis masių spektroskopijos bibliotekos duomenų baze. Remiantis gautais chromatogramos rezultatais, nustatyti tiriamų benzodiazepino darinių sulaikymo laikai (2 pav.). Gautos junginių sulaikymo trukmės: medazepamo – 8,923 min., lorazepamo – 9,801 min., diazepamo – 9,956 min., bromazepamo – 11,108 min., klonazepamo – 12,610 min., alprazolamo – 13,392 min.
2 pav. Tiriamų benzodiazepino darinių mišinio (DMBKAL1) chromatograma
Tyrimo metu įvertinti tiriamųjų junginių masių spektrai, kurie dar tiksliau padėjo identifikuoti benzodiazepino darinius (1 priedas).
3.3. DC-MS metodo validacija
3.3.1. Metodo specifiškumas
Specifiškumo įvertinimui nustatyti atskirų junginių jonų masių ir krūvių santykiai tiriamajame tirpale ir palyginti su standartiniais benzodiazepino darinių masių spektrais (3-8 pav.), pateiktais „Clarke's analysis of drugs and poisons. 4th edition” knygoje [31].
3 pav. Diazepamo masių spektras: a) tiriamojo tirpalo (D1); b) standarto iš „Clarke‘s drugs and poisons. 4th edition“ [31]
Palyginus gautus diazepamo ir literatūroje [31] pateiktus masių spektrus nustatyta, kad spektruose sutampa principinių jonų reikšmės ties 256, 283 m/z.
4 pav. Medazepamo masių spektras: a)tiriamojo tirpalo (M1); b) standarto iš „Clarke‘s drugs and poisons. 4th edition“ [31]
b)
b) a)
Palyginus gautus medazepamo ir literatūroje [31] pateiktus masių spektrus nustatyta, kad spektruose sutampa principinių jonų reikšmės ties 242, 207, 270 m/z;
a)
5 pav. Bromazepamo masių spektras: a) tiriamojo tirpalo (B1); b) standarto iš „Clarke‘s drugs and poisons. 4th edition“ [31]
Palyginus gautus bromazepamo ir literatūroje [31] pateiktus masių spektrus nustatyta, kad spektruose sutampa principinių jonų reikšmės ties 236, 315, 208, 78 m/z.
6 pav. Klonazepamo masių spektras: a) tiriamojo tirpalo (K1); b) standarto iš „Clarke‘s drugs and poisons. 4th edition“ [31]
Palyginus gautus klonazepamo ir literatūroje [31] pateiktus masių spektrus nustatyta, kad spektruose sutampa principinių jonų reikšmės ties 280, 314, 234 m/z.
b) b)
7 pav. Alprazolamo masių spektras: a)tiriamojo tirpalo (A1); b) standarto iš „Clarke‘s drugs and poisons. 4th edition“ [31]
Palyginus alprazolamo gautus ir literatūroje [31] pateiktus masių spektrus nustatyta, kad spektruose sutampa principinių jonų reikšmės ties 308, 204, 77, 307 m/z.
8 pav. Lorazepamo masių spektras: a)tiriamojo tirpalo (L1); b) standarto iš „Clarke‘s drugs and poisons. 4th edition“ [31]
Palyginus lorazepamo gautus ir literatūroje pateiktus masių spektrus nustatyta, kad spektruose sutampa principinių jonų reikšmės ties 75, 138, 177, 239, 274 m/z.
Apibendrinus specifiškumo vertinimui naudotus parametrus, galima teigti, kad pasirinktas DC- MS metodas yra specifiškas, todėl yra tinkamas junginių atskyrimui.
b) b)
a)
3.3.2. Rezultatų glaudumas
Pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas išreikšti santykiniu standartiniu nuokrypiu (SSN) sulaikymo laikui, kur pakartojamumas turėtų būti ne didesnis kaip 5 proc., o tarpinis preciziškumas – ne didesnis kaip 10 proc. Gautų rezultatų duomenys pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. DC-MS taikytos metodikos rezultatų glaudumo įvertinimas
Junginys Pakartojamumas Tarpinis preciziškumas
SSN sulaikymo laikui (proc.) SSN sulaikymo laikui (proc.)
Diazepamas 0,008 0,012 Medazepamas 0,005 0,009 Bromazepamas 0,008 0,010 Klonazepamas 0,01 0,013 Alprazolamas 0,005 0,010 Lorazepamas 0,01 0,015
Remiantis gautais rezultatais, įvertintas rezultatų glaudumas atitiko keliamus rekalavimus: pakartojamumas – mažiau nei 5 proc., tarpinis preciziškumas – mažiau nei 10 proc. Tad metodas yra tinkamas pasirinktų junginių nustatymui.
Atlikus pasirinkto metodo validaciją ir bendrai įvertinus visus tirtus parametrus, galima teigti, kad pasirinkta DC-MS metodika yra tinkama diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo mišinio kokybiniam vertinimui.
3.4. ESC metodikos parinkimas
Išanalizavus mokslinę literatūrą, nerasta duomenų apie tiriamų benzodiazepino darinių mišinio analizę. Analizei pasirinkta „Clarke‘s drugs and poisons. 4th edition“ knygoje [31] pateikta metodika ir pritaikyta kokybiniam ir kiekybiniam analizuojamo mišinio vertinimui. Siekiant atskirti ir identifikuoti junginius mišinyje, standartinių tirpalų mišinys chromatografuotas, naudojant skirtingas eliuentų sistemas. Tirpiklių sistemos vertintos pagal junginių sulaikymo laiką, smailių simetriškumą ir bazinės linijos stabilumą. Diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo, alprazolamo ir lorazepamo mišinio atskyrimas pasiektas, kaip eliuentą naudojant tirpiklių sistemą, sudarytą iš 0,1 proc. trifluoracto rūgšties tirpalo ir acetonitrilo. Junginių išskirstymas atliktas, naudojant ACE C18
kolonėlę (250 x 4,6 mm x 5 µm). Efektyviam tiriamųjų benzodiazepino darinių atskyrimui naudotas fotodiodų matricos detektorius, optimalus junginių aptikimo bangos ilgis – 230 nm.
3.5. Benzodiazepino darinių nustatymas ESC metodu
Pirmiausiai atlikta chromatografinė analizė su standartiniais benzodiazepino darinių tirpalais, vėliau – su benzodiazepino darinių tiriamaisiais tirpalais. Tiriamieji benzodiazepino dariniai identifikuoti pagal sulaikymo laikus. Pateikiama tiriamųjų benzodiazepino darinių mišinio chromatograma (5 pav.). Gautos atskirų benzodiazepino darinių sulaikymo trukmės: bromazepamo – 11,456 min., medazepamo – 13,791 min., alprazolamo – 14,398 min., diazepamo – 14,625 min., lorazepamo – 14,861 min., klonazepamo – 15,024 min.
5 pav. Benzodiazepino darinių mišinio chromatograma
3.6. ESC metodo validacija
3.6.1. Metodo specifiškumas
Tiriamųjų benzodiazepino darinių specifiškumas įrodytas, lyginant stadartinių benzodiazepino darinių tirpalų mišinio ir tiriamųjų benzodiazepino darinių tirpalų mišinio chromatogramas bei UV spektrų panašumus.
6 pav. Benzodiazepino darinių standartų mišinio (DMBKALS2) chromatograma
7 pav. Benzodiazepino darinių tiriamųjų tirpalų mišinio (DMBKAL2) chromatograma
Palyginus standartinių tirpalų mišinio (6 pav.) ir tiriamųjų tirpalų mišinio (7 pav.) chromatogramų smailes pagal sulaikymo laikus, matyti, kad jos sutampa.
Taip pat buvo užregistruoti tiriamųjų benzodiazepino darinių smailių UV absorbcijos spektrai ir palyginti su „Clarke‘s drugs and poisons. 4th edition“ knygoje [31] pateiktais standartinių junginių UV šviesos sugerties spektrais.
Palyginus literatūroje [31] pateiktus spektrus su išmatuotais tiriamųjų benzodiazepino darinių spektrais, matoma, kad jie sutampa (4 lentelė).
4 lentelė. Tiriamųjų benzodiazepino darinių gauti UV spektrai ir „Clarke‘s drugs and poisons. 4th edition“ knygoje pateikti UV spektrai
Jungi nys
Gauti benzodiazepino darinių UV spektrai
Benzodiazepino darinių UV spektrai pateikti literatūroje [31] Dia ze p amas Me da ze p amas B roma ze pa m as Klona ze p amas Alpra zolama s Lor az epa mas
Apibendrinus specifiškumo vertinimui naudotus kriterijus, galima teigti, kad pasirinktas ESC metodas yra specifiškas, todėl tinkamas junginių nustatymui.
3.6.2. Rezultatų glaudumas
Pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas išreikšti SSN sulaikymo laikui. Gauti rezultatai pateikti 5 lentelėje.
5 lentelė. Tiriamų benzodiazepino darinių rezultatų glaudumo įvertinimas
Junginys Pakartojamumas Tarpinis preciziškumas
SSN sulaikymo laikui (proc.) SSN sulaikymo laikui (proc.)
Diazepamas 0,01 0,05 Medazepamas 0,05 0,10 Bromazepamas 0,01 0,07 Klonazepamas 0,02 0,06 Alprazolamas 0,03 0,06 Lorazepamas 0,02 0,05
Remiantis gautais rezultatais, įvertintas pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas neviršijo leidžiamų normos ribų: pakartojamumas – mažiau nei 5 proc., tarpinis preciziškumas – mažiau nei 10 proc. Tad galima teigti, kad pasirinktas metodas benzodiazepino darinių analizei yra tinkamas.
3.6.3. Tiesiškumas
Tiesiškumo įvertinimui tirtos 5 skirtingos tiriamų junginių standartinių tirpalų koncentracijos. Diazepamo, medazepamo, bromazepamo, klonazepamo ir alprazolamo kalibraciniai grafikai sudaryti 0,015 – 0,5 mg/ml ribose, o lorazepamo kalibracinis grafikas sudarytas 0,015 – 0,25 mg/ml ribose. Taip pat buvo nustatytas koreliacijos koeficientas (R2), kurio reikšmė turi būti ne mažesnė kaip 0,99 ir artima 1. Tiesiškumo vertinimo rezultatai pateikti 6 lentelėje.
6 lentelė. Tiriamų benzodiazepino darinių kalibracinių kreivių charakteristikos
Junginys Koreliacijos
koeficientas R2 Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos, mg/ml
Diazepamas 0,9998 Y=8,60*106x+4,66*104 0,015 – 0,5 Bromazepamas 0,9995 Y=6,45*106x+4,31*104 0,015 – 0,5 Klonazepamas 0,9996 Y=8,99*105x-2,97*103 0,015 – 0,5 Alprazolamas 0,9998 Y=5,25*106x-1,54*104 0,015 – 0,5 Lorazepamas 0,9967 Y=7,82*106x+3,53*104 0,015 – 0,25 Medazepamas 0,9997 Y=7,84*106x+1,42*104 0,015 – 0,5
Gauti tirtų benzodiazepino darinių kalibraciniai grafikai įrodo, kad analizuotame koncentracijų intervale smailės ploto priklausomybė nuo medžiagos koncentracijos yra tiesiška (8 – 13 pav).
9 pav. Medazepamo kalibracinė kreivė
10 pav. Bromazepamo kalibracinė kreivė 11 pav. Klonazepamo kalibracinė kreivė
