E’ ormai noto come molte patologie sono associate con differenti disfunzioni nel metabolismo dell’NO. Un’aumentata produzione di NO, infatti, è stata ritrovata in molti tipi di tumori (Jadeski et al. 2003), durante l’infiammazione (Liu et al. 2002) e in alcune malattie neurodegenerative (Calabrese et al. 2000; Kawanishi et al. 2006); mentre una diminuita quantità di NO è stata riscontrata in anomalie cardiovascolari e in taluni disordini gastrointestinali. Da qui nasce l’interesse nel manipolare le vie di segnalazione dell’NO al fine di limitare o addirittura risolvere tali patologie.
Negli ultimi anni, è notevolmente aumentato l’interesse nei confronti di molecole derivanti dalla dieta, nella cura di diverse malattie e di vari tipi di cancro. Di particolare interesse sono gli estratti d’aglio (GE) contenenti molecole organosulfuriche (DADS e trisolfuro di diallile, DATS) (figura 1). Tali molecole possiedono una grande quantità di effetti benefici, come la diminuzione dell’incidenza di alcuni tipi di tumore allo stomaco (You et al., 1989).
Figura 1. Struttura chimica del disolfuro di diallile (DADS) (A) e del trisolfuro di diallile (DATS) (B).
Le proprietà benefiche degli estratti d’aglio sono state dimostrate anche sul sistema cardiovascolare e immunitario, dove sono in grado di incrementare la sintesi dell’NO attraverso l’up-regolazione della eNOS (Kim
et al. 2001) e prevenire l’infiammazione inibendo il fattore di trascrizione
NF-kB (Kim et al. 2001; Ippoushi et al., 2002; Chang e Chen 2005) sia in cellule macrofagiche che endoteliali. Fino ad oggi non sono ancora stati riportati dati riguardanti la modulazione della nNOS da parte degli estratti d’aglio, ma è stata dimostrata una modulazione del contenuto proteico di questo enzima sotto flusso di ROS (Andoh et al. 2000; Aquilano et al., 2003). Oltre a tali proprietà, gli estratti d’aglio hanno, anche, la capacità di indurre un aumento di produzione dei ROS e un aumento dell’apoptosi (Filomeni et al., 2003) Per queste ragioni, abbiamo voluto esaminare la capacità di queste molecole di modulare l’attività e il contenuto proteico della nNOS. Infatti, nel nostro laboratorio è stato in precedenza dimostrato come il DADS o il DATS fossero in grado di incrementare la produzione di ROS e di NO in cellule di neuroblastoma umano, SH-SY5Y (Filomeni et al., 2003). L’incremento di questi radicali determinava danni a livello nucleare, ossidazione delle proteine e perossidazione lipidica, portando in ultima analisi alla morte per apoptosi. Le cellule SH-SY5Y esprimono costitutivamente la nNOS, quindi l’NO prodotto può rappresentare sia una molecola potenzialmente dannosa per le macromolecole biologiche, sia un modulatore delle vie di segnalazione cellulare e dell’apoptosi. Per testare se 50 µmol/L di DADS potesse alterare la produzione di NO e soprattutto il
contenuto proteico della nNOS, ne sono stati analizzati i livelli intracellulari attraverso Western blot. La figura 2 riporta il risultato dell’immunoelettroforesi condotta a parità di concentrazione proteica, utilizzando un anticorpo contro la nNOS: il trattamento con il DADS porta all’aumento dei livelli proteici dell’enzima, già ad 1h di trattamento, raggiungendo il picco massimo a 3h (1.13 ± 0.05 rispetto al valore del controllo, 0.40 ± 0.10) e rimanendo up-regolata fino alle 24h (1.20 ± 0.10), suggerendo che la nNOS rappresenta il primo sensore della tossicità mediata dal DADS.
Per capire se l’incremento della nNOS fosse causato solo dal DADS o anche ad altri derivati dell’aglio, le cellule SH-SY5Y sono state trattate con 1% v/v GE, concentrazione che è in grado di provocare un arresto della crescita e della vitalità delle cellule HepG2 (epatomi umani) (De Martino et
Figura 2. Analisi del contenuto proteico della nNOS dopo trattamento con il DADS.
Le cellule SH-SY5Y sono state trattate per 24h con 50 µmol/L di DADS. 20 µg di estratti proteici totali sono stati separati su gel di poliacrilammide e il contenuto di nNOS è stato determinato mediante Western blot utilizzando un anticorpo anti-nNOS. L’α-tubulina è stata utilizzata come controllo di caricamento. L’immunoblot riportato è rappresentativo di tre esperimenti che hanno dato risultati simili. Le densità delle bande immunoreattive (riportate sopra l’immunoblot) sono state calcolate utilizzando il software Quantity one (Bio-Rad), normalizzate per α-tubulina e riportate come unità arbitrarie (a.u.). I dati sono espressi come medie ± S.D.; *p<0.001, n=3.
La figura 3 mostra un incremento della percentuale di cellule arrestate nella fase G2/M, dopo trattamento con 1% v/v GE per 12h. Questo fenomeno è, inoltre, accompagnato da un concomitante aumento delle cellule apoptotiche a 12 e 24h di trattamento con GE.
Figura 3. Analisi dell’apoptosi dopo trattamento con GE.
Le cellule SH-SY5Y sono state trattate con 1% v/v GE per 24h, lavate con PBS e marcate con ioduro di propidio. L’analisi del ciclo cellulare e dell’apoptosi è stata effettuata con il FAC-Scalibur e la percentuale di cellule è stata calcolata utilizzando il software WinMDI versione 2.8 (the Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Il grafico riportato è rappresentativo di cinque esperimenti che hanno dato risultati simili I dati sono espressi come medie ± S.D.; *p<0.001, n=5.
Sulla base di questi risultati siamo andati a misurare il contenuto proteico della nNOS, dopo trattamento con GE. Come mostra la figura 4 il GE, è in grado di indurre un aumento del contenuto proteico della nNOS, la quale raggiunge il valore massimo a 3h di trattamento (0.92 ± 0.04 rispetto al valore di controllo, 0.38 ± 0.05), rimanendo up-regolata fino a 24h (0.78 ± 0.12).
Figura 4. Analisi del contenuto proteico della nNOS dopo trattamento con GE.
Le cellule SH-SY5Y sono state trattate con 1% v/v GE per 24h. 20 µg di estratti proteici totali sono stati separati su gel di poliacrilammide e il contenuto di nNOS è stato determinato mediante Western blot utilizzando un anticorpo anti-nNOS. L’α-tubulina è stata utilizzata come controllo di caricamento. L’immunoblot riportato è rappresentativo di quattro esperimenti che hanno dato risultati simili. Le densità delle bande immunoreattive (riportate sopra l’immunoblot) sono state calcolate utilizzando il software Quantity one (Bio-Rad), normalizzate per α-tubulina e riportate come unità arbitrarie (a.u.). I dati sono espressi come medie ± S.D.; *p<0.001, n=4.
Nonostante ciò, la produzione di NO non è aumentata. Infatti, la figura 5 mostra i livelli di NOx accumulati durante incubazione delle cellule in HBSS,
un mezzo che non produce grosse interferenze nel dosaggio e che è stato utilizzato allo scopo di rendere più sensibile la misura. Il dosaggio dell’attività dell’nNOS ha rilevato che la produzione di NO non subisce modulazioni in cellule SH-SY5Y trattate con DADS e GE rispetto ai controlli.
Figura 5. Effetti del trattamento con DADS e GE sulla produzione di NO.
Le cellule SH-SY5Y sono state trattate con 50 µmol/L DADS e con 1% v/v GE per 24h. La produzione di NO è stata valutata misurando i livelli di nitriti e nitrati (NOx) rilasciati nel mezzo di coltura, mediante il metodo di Griess. Il grafico riportato è rappresentativo di sei esperimenti che hanno dato risultati simili I dati sono espressi come medie ± S.D.; n=6.
Il medesimo risultato è stato ottenuto marcando le cellule con la sonda fluorescente DAF-2/DA e poi analizzate al citofluorimentro (dati non mostrati). Questi dati non sono discordanti tra loro in quanto, come accennato in precedenza, sotto flusso di ROS si osserva un aumento dei livelli di nNOS e l’NO prodotto potrebbe intercettare i ROS eliminandoli ed espletando così la sua funzione di scavenger.