L’incremento della nNOS potrebbe avere un doppio ruolo nel nostro sistema cellulare: l’NO prodotto potrebbe contribuire a mantenere l’equilibrio tra le forze pro e anti-apoptotiche, funzionando da soppressore dell’apoptosi a vari livelli, oppure, potrebbe svolgere un ruolo protettivo per la cellula spostando l’equilibrio verso il processo apoptotico (Li e Wogan 2005). Per chiarire il ruolo giocato dall’nNOS in risposta alla citotossicità indotta dal DADS, sono stati effettuati dei trattamenti con 50 µmol/L DADS
Nella figura 6 sono riportati i dati ottenuti dal doppio trattamento con DADS e 1 mmol/L NPA a 24h. E’ possibile notare che l’inibizione dell’attività della nNOS provoca un aumento della citotossicità del DADS, incrementando così la percentuale di cellule apoptotiche. Lo stesso risultato è stato ottenuto utilizzando un altro specifico inibitore della nNOS, il 7-nitroindazolo (7-Ni) (dati non mostrati).
Figura 6. Analisi dell’apoptosi in seguito ad inibizione della nNOS in cellule SH-SY5Y.
Le cellule SH-SY5Y sono state trattate con 50 µmol/L DADS per 24h, lavate con PBS e marcate con ioduro di propidio. L’inibitore della nNOS NG-propil-L-arginina (NPA) è stato aggiunto alla concentrazione di 1 mmol/L prima del trattamento con il DADS e mantenuto per tutto l’esperimento. L’analisi dell’apoptosi è stata compiuta con il FAC-Scalibur e la percentuale di cellule è stata calcolata utilizzando il software WinMDI versione 2.8 (the Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Il grafico riportato è rappresentativo di quattro esperimenti che hanno dato risultati simili I dati sono espressi come medie ± S.D.;
*p<0.01, n=4.
Inoltre, per testare la specificità dell’aumento dell’nNOS ai derivati dell’aglio, sono stati effettuati dei trattamenti con il DADS su una differente linea cellulare, le NSC34, un ibridoma ottenuto dalla fusione di un neuroblastoma murino N18TG2 con motoneuroni (Cashman et al., 1992). Essi mostrano un fenotipo neuronale multipolare e sono ampiamente utilizzati come modello di cellula moto-neuronale. Come per le SH-SY5Y, il trattamento con 50 µmol/L di DADS promuove la morte cellulare per
apoptosi e il pre-trattamento con NPA incrementa la percentuale di cellule apoptotiche (figura 7).
Figura 7. Analisi dell’apoptosi in seguito ad inibizione della nNOS in cellule NSC34.
Le cellule NSC34 sono state trattate con 50 µmol/L DADS per 24h, lavate con PBS e marcate con ioduro di propidio. L’inibitore della nNOS NG-propil-L-arginina (NPA) è stato aggiunto alla concentrazione di 1 mmol/L prima del trattamento con il DADS e mantenuto per tutto l’esperimento. L’analisi dell’apoptosi è stata effettuata con il FAC-Scalibur e la percentuale di cellule è stata calcolata utilizzando il software WinMDI versione 2.8 (the Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Il grafico riportato è rappresentativo di cinque esperimenti che hanno dato risultati simili I dati sono espressi come medie ± S.D.;
*p<0.01, n=5.
Il nostro secondo obiettivo è stato quello di verificare se il contenuto di nNOS fosse variato in queste cellule come per le SH-SY5Y. La figura 8 mostra che dopo aggiunta di DADS anche in questa linea cellulare si osserva un incremento dei livelli proteici della nNOS già ad 1h di trattamento. Questi risultati dimostrano, in parte, come l’NO prodotto dall’nNOS protegge entrambe le linee cellulari dallo stress ossidativo indotto dai derivati dell’aglio.
Figura 8. Analisi del contenuto proteico della nNOS nelle cellule NSC34.
Le cellule NSC34 sono state trattate con 50 µmol/L DADS per 24h. 20 µg di estratti proteici totali sono stati separati su gel di poliacrilammide e il contenuto di nNOS è stato determinato mediante Western blot utilizzando un anticorpo anti-nNOS. L’α-tubulina è stata utilizzata come controllo di caricamento. L’immunoblot riportato è rappresentativo di tre esperimenti che hanno dato risultati simili. Le densità delle bande immunoreattive (riportate sopra l’immunoblot) sono state calcolate utilizzando il software Quantity one (Bio-Rad), normalizzate per α-tubulina e riportate come unità arbitrarie (a.u.). I dati sono espressi come medie ± S.D.; *p<0.01, n=3.
In conformità a questi risultati abbiamo analizzato se l’aumento della nNOS, indotto dai derivati dell’aglio, fosse effettivo anche dopo differenziamento delle cellule. Per indurre il differenziamento, è stato quindi impiegato l’acido retinoico (RA) alla concentrazione di 30 µmol/L. I risultati
di quest’esperimento sono riportati in figura 9a e dimostrano che il trattamento con l’RA protegge completamente le NSC34 dalla citotossicità indotta dal DADS, allo stesso tempo si osserva una maggiore up-regolazione della nNOS già ad 1h di trattamento (figura 9b). Inoltre, l’inibizione della nNOS con l’inibitore NPA, abolisce completamente la protezione delle NSC34 differenziate dal trattamento con DADS (figura 9a). Gli stessi risultati sono stati ottenuti anche sulle SH-SY5Y differenziate (dati non mostrati).
Figura 10. Analisi dell’apoptosi e del contenuto di nNOS dopo differenziamento delle cellule NSC34.
A) Le cellule NSC34 sono state differenziate con 30 µmol/L di RA, trattate con 50
µmol/L DADS per 24h, lavate e marcate con ioduro di propidio. L’NPA è stato aggiunto alla concentrazione di 1 mmol/L prima del trattamento con il DADS e mantenuto per tutto l’esperimento. L’analisi dell’apoptosi è stata effettuata con il FAC-Scalibur e la percentuale di cellule è stata calcolata utilizzando il software WinMDI versione 2.8 (the Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Il grafico riportato è rappresentativo di quattro esperimenti che hanno dato risultati simili I dati sono espressi come medie ± S.D.; *p<0.01, n=4.
B) Le cellule NSC34 sono state differenziate con 30 µmol/L di RA e trattate con 50
µmol/L DADS per 3h. 20 µg di estratti proteici totali sono stati separati su gel di poliacrilammide e il contenuto di nNOS è stato determinato mediante Western blot utilizzando un anticorpo anti-nNOS. L’α-tubulina è stata utilizzata come controllo di caricamento. L’immunoblot riportato è rappresentativo di tre esperimenti che hanno dato risultati simili. Le densità delle bande immunoreattive (riportate sopra l’immunoblot) sono state calcolate utilizzando il software Quantity one (Bio-Rad), normalizzate per α-tubulina e riportate come unità arbitrarie (a.u.). I dati sono espressi come medie ± S.D.; *p<0.01, n=3.