considerazione l’impianto di Trebbo di Reno (BO) ed un ipotetico impianto per la produzione industriale di PHA con una capacità di produzione di 3000 tonnellate all’anno. Un impianto di questo tipo potrebbe utilizzare dei bioreattori con un volume stimato di 222m3. La concentrazione cellulare utilizzata per questi processi a livello industriale è dell’ordine di 100g/L, quindi si avrebbe una massa cellulare di 2,22x107g. Tali impianti posseggono normalmente una vasca di raccolta che consente il recupero del brodo fermentativo in caso di sversamento o problemi nel corso della fermentazione.
Nell’ipotesi di lavoro progettuale è stato simulato l’accidentale rilascio del brodo fermentativo in un impianto di trattamento acque reflue.
L’impianto modello considerato presenta una vasca aerobica con volume di 10.000 m3. La concentrazione cellulare rilevata risulta essere di 6g/L, quindi la massa cellulare è di 6x107g. Per riprodurre tale situazione in scala da laboratorio, è stato preso come riferimento il rapporto tra le cellule di fanghi attivi presenti nell’impianto di trattamento acque e le cellule del MOGM, risultato pari a 2,5 g fango/g di P. putida.
L’impianto è quindi stato inoculato con il MOGM secondo questo rapporto; il MOGM è stato direttamente aggiunto alla vasca aerobica come segue: 2,4g di pellet di biomassa con PHA è stata risospesa in terreno minerale, in modo da ottenere una concentrazione di 100g/L. La biomassa risospesa è stata inoculata nella camera anossica ad impianto fermo e vasca isolata dal resto dell’impianto. La vasca è stata miscelata per 10min prima di far ripartire il processo, in modo da omogenizzare al meglio l’inoculo con i fanghi residenti. L’andamento nel tempo dei principali parametri chimici di processo nelle diverse sezioni d’impianto è mostrato in Figura 31.
Figura 31 - Profili di concentrazione nel tempo (ore) di TN; N-NH4+; N-NO3-; P-PO43- (mg/L); COD (mgO2/L) nelle diverse sezioni dell'impianto
Al momento dell’inoculo, nel reattore anossico è stato osservato un incremento nella concentrazione dei fosfati e dell’azoto ammoniacale. Questo è dovuto alla presenza ad alte concentrazioni di ammonio e fosfati nel terreno utilizzato per la crescita del MOGM. Nel reattore aerobico, invece, è stato rilevato un netto incremento nella concentrazione dei nitrati e una diminuzione di azoto ammoniacale. Ciò è dovuto al fatto che, al momento dell’inoculo, l’impianto è stato fermato, e non arrivando nuova alimentazione si sono accumulati i nitrati generati dalla reazione di nitrificazione.
Nell’outlet sono state riscontrate alterazioni meno significative.
In ogni caso, dopo 7h dal momento dell’inoculo, il sistema è tornato stabile.
Per quanto concerne il destino del materiale genetico del MGOM inoculato, le analisi qPCR mostrano che il numero di copie del gene deleto ∆fadB∆fadA nell’impianto rimane compreso nell’intervallo 107-109 copie/ml dal momento dell’inoculo alla settima ora di esercizio. Diversamente, il gene target diventa rilevabile nell’effluente acquoso dopo 20min di marcia. Dopo 40min di esercizio la sua concentrazione nell’effluente aumenta a circa 107 copie/ml e rimane successivamente
VASCA ANOSSICA
VASCA AEROBICA
EFFL
compresa nell’intervallo 107-108 copie/ml fino alla settima ora di marcia (Figura 32). Tuttavia, a partire dal giorno successivo di esercizio (29h), la concentrazione di gene target nell’impianto e nell’effluente si riduce drasticamente, raggiungendo nel primo concentrazioni di circa un ordine di grandezza maggiori del segnale di fondo misurato nell’impianto prima dell’inoculo, ma comunque di quattro ordini di grandezza minori di quella iniziale, e nel secondo concentrazioni di solo 104 copie/ml dopo 53h di marcia.
Figura 32 - Concentrazione (numero di copie/ml) di gene deleto ∆fadB∆fadA di KTOY06 nell'impianto e nel suo effluente durante la marcia.
Considerando la quantità di gene target cumulativamente uscita dall’impianto con l’effluente durante le prime 7h di esercizio (3.35E+10 copie totali), risulta che circa il 7% dell’inoculo viene rilasciato con l’effluente dall’impianto. Questo implica un limitato ma significativo wash-out della biomassa inoculata durante le prime ore di esercizio. Poiché la quantificazione del gene target con saggi di tipo molecolare non distingue fra materiale genetico proveniente da cellule morte e da cellule vive che possono proliferare nell’ambiente (queste ultime, eventualmente quantificabili con metodi microbiologici classici), detta frazione rilevata nell’effluente potrebbe comunque non esser vitale o essere completamente inattivata mediante un successivo stadio di disinfezione che tipicamente si trova a valle dell’impianto. Questi dati suggeriscono pertanto che l’eventualità che un MOGM possa essere rilasciato nell’ambiente in forma vitale da questi sistemi sia limitata.
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CAPITOLO 4 - Downstream del bioprocesso a coltura mista per la produzione di polimeri