Le specie radicaliche non sono solitamente di facile analisi, spesso sono specie instabili di breve permanenza nei cicli metabolici e anche qualora fossero presenti stabilmente nei tessuti, le tecniche di rivelazione diretta non sono sempre di semplice applicazione, vedi tecniche EPR, quindi nella valutazione dello stress ossidativo è utile individuare dei marker di facile analisi. . Un marker è definito come una sostanza quantificabile, stabile e quindi resistente alla degradazione, utilizzabile come indicatore di un particolare stato fisiologico. Stante questa definizione sono definibili come marker tutte quelle molecole più o meno facilmente analizzabili, derivanti dai processi di ossidazione a carico delle principali biomolecole, lipidi, DNA e proteine. Il marker ideale dovrebbe avere determinate caratteristiche:
- dovrebbe essere chimicamente stabile, ossia non soggetto ad alterazioni durante la manipolazione e lo stoccaggio del campione
- dovrebbe avere un ruolo nella patogenesi di una malattia e nel migliore dei casi dovrebbe essere predittivo del suo decorso
- essere presente nel tessuto d’indagine o ad esso correlabile
- le sue tecniche di analisi devono essere sufficientemente precise e riproducibili, ed il più semplici possibile
- non deve essere influenzato da fattori dietetici - avere una bassa variabilità biologica
- devono esistere dati sull’intera popolazione
Come è facile immaginare difficilmente un singolo marker potrà avere tutte le caratteristiche necessarie e per questo motivo si utilizzano i marker più disparati anche compatibilmente con il fine delle analisi.
Marker individuato o nome delle tecnica Ref.
Sostanze reattive all’acido tiobarbiturico (TBARS) [1] [2] [3]
Malondialdeide (MDA) [1] [4] [5] [6]
4-idrossinonenale (HNE) [7] [8] [9] [10]
Idrocarburi respiratori [11] [12]
Isoprostani [13] [14] [15] [16]
DNA ossidato (8OHdG) [17] [18]
Proteine carbonilate [19] [20] [21]
Tra i primi markers di stress ossidativo ad essere studiato, e tuttora molto analizzato, vi è la malondialdeide (MDA). Tale molecola è prodotta durante i processi di perossidazione degli acidi grassi polinsaturi con due o più doppi legami separati da un solo carbonio. Le modalità di produzione della MDA non sono ancora del tutto note.
Tra le ipotesi proposte abbiamo quella di Stanley [22] secondo cui la MDA deriverebbe da un precursore non volatile con struttura contenente un perossido biciclico simile a quello presente nella biosintesi delle prostaglandine. Da questo precursore si formerebbe MDA in condizioni di stress ossidativo.
Figura 1: Biosintesi di MDA, illustrazione da Del Rio et al. [1]
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Due meccanismi di sintesi alternativi sono stati proposti in tempi più recenti da Esterbauer [23]. Essi si basano sulla formazione idroperossido a partire dagli acidi grassi e successive β-scissioni della catena degli acidi grassi, come illustrato in figura 1. I primi (1970-1995) e tuttora più diffusi saggi per la determinazione della MDA sono stati sviluppati sulla base della derivatizzazione con acido tiobarbiturico (TBA). La condensazione di queste due molecole dà luogo ad un addotto ad elevata assorbività facilmente valutabile con uno spettrofotometro. Purtroppo, la specificità di questi saggi è bassa, TBA può reagire anche con composti diversi da MDA, seppur derivati dai processi ossidativi. Inoltre, il trattamento dei campioni biologici per ottenere la condensazione del prodotto viene generalmente effettuato ad alta temperatura (tra gli 80 e i 100°C per 1 ora circa a seconda della metodica) e questo può generare un ulteriore ossidazione della matrice con evidente sovrastima dei risultati. Per ridurre al minimo l'ossidazione della matrice la maggior parte di questi metodi comportano la precipitazione delle proteine del campione biologico prima della reazione con TBA. Nonostante la laboriosità dei test e la loro aspecificità i saggi basati sull’addotto MDA-TBA vengono spesso utilizzati con apparente successo in studi clinici. Tuttavia viste le condizioni chimiche del test sembra che tali saggi diano un misura dell’ossidabilità del campione e non del suo stato di ossidazione [1].Spesso queste metodiche sono denominate TBARS. In tempi recenti grazie allo sviluppo della chimica strumentale è stato possibile sviluppare metodiche alternative ai saggi appena descritti. In particolare la determinazione della MDA senza derivatizzazione è possibile mediante tecniche separative quali HPLC (high pressure liquid chromatography) accoppiate con rivelatori di assorbanza nel UV [4] o mediante GC-MS (gas-chromatography-mass-spectrometry) con rivelatore quadrupolare. [5]
Quest’ultime metodiche potrebbero essere facilmente automatizzabili e quindi utilizzabili per analisi routinarie, ma visto l’alto costo iniziale dei macchinari e la necessità di personale altamente specializzato non si sono mai realmente diffuse al di fuori dei laboratori di ricerca. È stato fatto anche qualche tentativo di determinare la MDA mediante reattivo di Shiff, reattivo aspecifico sensibile alle aldeidi, ma con scarsi risultati. [6] Un'altra tipologia storica di marker dei processi di lipoperossidazione sono gli idrocarburi respiratori, in particolare pentano ed esano derivanti da acidi grassi polinsaturi n-3 o n-6 [24] . Già dagli anni ’70 del secolo scorso è nota la correlazione tra lipoperossidazione e tali idrocarburi presenti nell’esalato respiratorio[25], e già negli anni ’80 si iniziato ad applicare tecniche strumentali atte alla loro misurazione come la gas-cromatografia[12].La misura degli idrocarburi nell’esalato respiratorio, essendo non una tecnica invasiva, potrebbe essere particolarmente adatta per l'uso di routine nella ricerca e nella clinica, tuttavia, la mancanza di metodi standardizzati per la raccolta, l’elaborazione e l’analisi dell'aria espirata ha comportato l'uso di una grande varietà di tecniche diverse che hanno dato risultati anche molto discordanti tra loro. La principale fonte di errore deriva dalla contaminazione del campione con l’aria dell’ambiente di campionamento presente nei polmoni del soggetto, in cui di solito le concentrazioni di idrocarburi sono molto più grandi e più variabili rispetto a all'aria espirata. [11]
Un altro marker derivante da processi di lipoperossidazione, di più recente utilizzo è il 4-idrossinonenale (HNE). Quest’aldeide deriva da acidi grassi polinsaturi (PUFA) aventi un doppio legame C=C in posizione 6 come l’acido arachidonico, il più efficiente precursore di HNE, o l'acido linoleico. Il meccanismo di formazione di HNE dai PUFA non è ancora pienamente noto ma sembra essere di natura radicalica non enzimatica il cui primo step potrebbe essere la formazione di un lipoperossido. HDE può essere analizzato come tal quale o mediante analisi dei suoi numerosi addotti, derivanti dalla sua straordinaria reattività nei confronti di vari substrati [7]. Le metodologie di analisi dell’ HDE sono piuttosto varie e solitamente di natura strumentale, vanno da tecniche di gascromatografia a tecniche di spettrometria di massa accoppiata con eletron-spary [7]. Esistono tecniche basate su HPLC con rivelazione in assorbimento UV [8].
La tecnica strumentale più semplice, e forse l’unica applicabile alla pratica clinica quotidiana è la derivatizzazione di HNE con 1-metil-2-fenilindolo e quantificazione mediante analisi colorimetrica dell’addotto, ma questa tecnica tende a sovrastimare il dato non essendo altamente specifica e rivelando tutte le aldeidi a 9 carboni [9]. Molto diffuse sono anche tecniche di immunofissazione denominate Western blot [10] Questa tipologia di metodica biologica è generalmente basata su di una separazione elettroforetica delle proteine su poliacrilamide, trasferimento delle stesse su membrana di nitrocellulosa mediante capillarità, spesso coadiuvata da tecniche di electroblotting. La rivelazione qualitativa e quantitativa avviene mediante tecniche di assorbimento UV-visibile o chemioluminescenza associate a tecniche ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)o ELIspot.
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Figura 2: Panoramica delle reazioni del HNE con vari substrati, illustrazione da Poli et al. [7]
Altra classe di marker dei processi di ossidazione lipidica molto nota e utilizzata specialmente in ambito di ricerca è quella degli isoprostani. La classe di isprostani più utilizzata come marker è denominata F2-IsoPs dalla presenza di una anello di tipo F2 analogo alla prostaglandina 2α. Un possibile meccanismo di formazione di tali molecole si basa sulla generazione di formazione di perossido biciclico per addizione di ossigeno all’acido arachidonico radicalizzato per perdita di un elettrone da un suo doppio legame, formazione di perossido radicale per ulteriore addizione di ossigeno e stabilizzazione dei gruppi perossidici a idrossilici per addizione di idrogeno. Sulla base di questo meccanismo di formazione, si formano quattro regioisomeri indicati come 5-, 12-, 8 o 15-serie a seconda dell’atomo di carbonio a cui è collegato l'ossidrile catena laterale. La principale tecnica di analisi degli isoprostani è la spettroscopia di massa accoppiata alla gascromatografia o alla cromatografia liquida ad alte pressioni. Gli isoprostani vengono solitamente determinati nelle urine [13], ma anche nel plasma sanguineo [14], e più raramente nell’esalato [15].
Altra tipologia di macromolecola facilmente suscettibile di attacco da parte dei radicali liberi è il DNA, tale fenomeno viene indicato come danno ossidativo al DNA. Le possibili reazioni sono molteplici ma i principali prodotti dell’ossidazione radicalica del DNA sono addotti di natura radicalica composti da base azotate e radicale H• o OH•, più raramente questi addotti comprendono la molecola di zucchero. Esistono varie
Figura 3: struttura delle 4 serie di isoprostani. Modificato da Schwedhelm et al.[16]
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tecniche analitiche per la misura del danno ossidativo al DNA. Le tecniche di GC (gas-chromatography) o di LC (liquid-chromatography) o MS (mass-spectrometry) possono misurare simultaneamente numerosi prodotti diversi, e fornire un’analisi accurata del danno ossidativo. La misurazione di più prodotti evita conclusioni fuorvianti che potrebbero essere tratte dalla misurazione di un singolo prodotto, in quanto i livelli di prodotto variano in funzione delle condizioni di reazione e dello stato redox delle cellule. In passato, GC-MS è stato utilizzata per la misurazione del glucosio e delle basi modificate oltre che di addotti DNA-proteina, mentre più recentemente si è utilizzato LC –MS/Ms (liquid-chromatography-mass spectrometry tandem) per la misurazione dei nucleosidi modificati. Con l'uso di queste tecniche di misurazione potrebbero però crearsi artificialmente degli addotti non originariamente presenti nel campione . L'uso di condizioni sperimentali adeguate può evitare la formazione di addotti artificiali [17].Il principale marcatore di stress ossidativo del DNA è l’addotto che si forma dalla reazione di addizione di un radicale idrossile al C8 della base azotata guanina denominato 8-deossiguanosina (8OHdG)[26] . Esso può essere rilevato e quantificato con metodologia LC-MS o con metodologie ELISA. Sebbene sia possibile, la sua analisi a livello cellulare, la metodologia stessa comporta la parziale ossidazione del DNA e comunque quand’anche ciò non avvenga normalmente non si conoscono i livelli basali di 8OHdG per un opportuno confronto. Più utile è la determinazione del livello di stress del DNA sistemico mediante la misura del 8OHdG nelle urine.[18]
Un diffuso biomarker di stress ossidativo a livello sistemico è costituito dai gruppi carbonilici, aldeidici o chetonici presenti sulle catene laterali delle proteine, specialmente sui residui di prolina, arginina, lisina e tirosina. I gruppi carbonilici hanno il vantaggio di essere chimicamente stabili, il che è utile sia per quanto riguarda l’analisi che lo stoccaggio dei campioni. La generazione dei gruppi carbonilici può avvenire sia come conseguenza di diretta ossidazione delle proteine, principalmente via α-amidazione o via ossidazione della catena laterale glutaminica, con formazione di un peptide in cui l’azoto terminale è bloccato da α-chetoacido. Inoltre i gruppi carbonili possono essere introdotti nelle proteine per reazione del nucleofili presente nelle catene laterali di principalmente cisteina, istidina, o lisina, con aldeidi, tipicamente 4-idrossi-2-nonenale, malondialdeide o 2-propanale, derivanti dalla prossidazione lipidica. Altri addotti sono formati con derivati carbonilici derivanti dalla reazione di zuccheri riducenti, o dei loro prodotti di ossidazione con i residui lisinici delle proteine (reazione di glicazione). [19].
Figura 4: Strutture dei derivati carbonilici derivanti dall’ossidazione diretta della catena laterale, illustrazione da Dalle-Donne et al.
2003 [19]
Le moderne metodologie di analisi dei derivati carbolici sono basate sulla derivatizzazione del gruppo carbonile con dinitrofenilidrazina (DNPH) con conseguente formazione di addotti stabili 2,4-dinitrofenilidrazone[20]. Gli addotti così prodotti si possono facilmente analizzare con sensibilità anche significative mediante spetrofotometria di assorbimente nell’UV, eventualmente accoppiata con HPLC per la separazione dei vari residui proteici, ma anche tecniche ELISA o eletroforetiche.[19]
[1] Del Rio D, Stewart AJ, Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases 2005;15:316-328
[2] Schimke I, Kahl PE, Romaniuk P, Papies B. Concentration of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) in serum after myocardial infarction Klin Wochenschr. 1986;64(23):1237-9.
[3] Glantzounis GK, Tselepis AD, Tambaki AP, Trikalinos TA, Manataki AD, Galaris DA, Tsimoyiannis EC, Kappas AM. Laparoscopic surgery-induced changes in oxidative stress markers in human plasma. Surg Endosc 2001;15: 1315–1319
[4] Karatas F, Karatepe M, Baysar A. Determination of free malondialdehyde in human serum by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry 2002;311:76–79
[5] Liu J, Yeo HC, Doniger SJ, Ames BN. Assay of Aldehydes from Lipid Peroxidation: Gas Chromatography–Mass Spectrometry Compared to Thiobarbituric Acid. Anal biochem 1997;245: 161-166
37
[6] Suha A , Kılın A, Cöbek B. Evaluation of a simple colorimetric analysis for urinary malondialdehyde determination. Pathology and Laboratory Medicine International 2010;2:23–26
[7] Poli G, Schaur RJ. 4-Hydroxynonenal in the Pathomechanisms of Oxidative Stress. IUBMB Life 2000; 50: 315–321
[8] Lang J, Celotto C, Esterbauer H. Quantitative determination of the lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry 1985;150: 369-378
[9] Gèrard-Monnier D, Erdelmeier I, Règnard K, Moze-Henry N, Yadan JC, Chaudière J. Reactions of 1-Methyl-2-phenylindole with Malondialdehyde and 4-Hydroxyalkenals. Analytical Applications to a Colorimetric Assay of Lipid Peroxidation. Chem. Res. Toxicol 1998;11:1176-1183.
[10] Kruman I, Bruce-Keller AJ, Bredesen D, Waeg G, Mattson MP. Evidence that 4-Hydroxynonenal Mediates Oxidative Stress-Induced Neuronal Apoptosis. The Journal of Neuroscience 1997;17(13):5089–5100
[11] Knutson MD, Handelman GJ, Viteri FE. Methods for measuring ethane and pentane in expired air from rats and humans. Free Radical Biology and Medicine 2000;28(4):514–519
[12] Zarllng EJ, Clapper M. Technique for Gas-Chromatographic Measurement of Volatile Alkanes from Single-Breath Samples. CLIN.
CHEM. 1987;33/1:140-141
[13] Milne JL, Yin H, Morrow JD. Human Biochemistry of the Isoprostane Pathway. the journal of biological chemistry 2008;283:15533–15537,
[14] Hozawa A, Ebihara S, Ohmori K, et al. Increased Plasma 8-Isoprostane Levels in Hypertensive Subjects: the Tsurugaya Project.
Hypertension Research 2004;27:557-561
[15] Montuschi P, Corradi M, Ciabattoni G, et al. Increased 8-Isoprostane, a Marker of Oxidative Stress, in Exhaled Condensate of Asthma Patients. Am J Respir Crit Care Med 1999;160:216–220,
[16] Schwedhelm E, Benndorf RA, Böger RH, Tsikas D. Mass Spectrometric Analysis of F2-Isoprostanes: Markers and Mediators in Human Disease. Current Pharmaceutical Analysis 2007;3:39-51
[17] Dizdaroglu M, Jaruga P, Birincioglu M, Rodriguez H. Free radical-induced damage to DNA: mechanisms and measurement. Free Radical Biology and Medicine 2002;32:1102–1115
[18] Halliwell H, Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? British Journal of Pharmacology 2004; 142: 231–255
[19] Dalle-Donne I, Rossib R, Giustarini D, Milzania A, Colombo R. Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clinica Chimica Acta 2003;329:23–38
[20] Levine RL, Garland D, Oliver CN et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods in Enzymology 1990;186:464–478
[21] Chevion M , Berenshtein E , Stadtman ER. Human studies related to protein oxidation: protein carbonyl content as a marker of damage. Free Radical Research 2000;33: S99-108]
[22] Pryor WA, Stanley JP. A suggested mechanism for the production of malonaldehyde during the autoxidation of polyunsaturated fatty acids. Nonenzymatic production of prostaglandin endoperoxides during autoxidation. J Org Chem 1975;40:3615-7.
[23] Esterbauer H, Schaur RJ, Zollner H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes.
Free Radic Biol Med 1991;11:81 - 128.
[24] Kneepkens CMF, Lepage G, Roy CC. The potential of the hydrocarbon breath test as a measure of lipid peroxidation. Free Radical Biology and Medicine 1994;17(2):127-160
[25] Litov RE, Irving DH, Downey JE, Tappel AL. Lipid peroxidation: a mechanism involved in acute ethanol toxicity as demonstrated by in vivo pentane production in the rat. Lipids 1978;13:305-7.
[26] Zdaroglu Md, Jaruga P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radical Research 2012; 46(4): 382–419
38