Determinazioni e metodiche analitiche

Per tutti i soggetti della popolazione in esame e del gruppo di controllo sono stati eseguiti: - un esame emocromocitometrico, comprendente Ematocrito (Hct %), Emoglobina (Hb gr%), Eritrociti (RBC/mm3), volume corpuscolare medio (MCV fL), Emoglobina corpuscolare media (MCH %), concentrazione corpuscolare media di Emoglobina (MCHC %), ampiezza della distribuzione degli Eritrociti (RDW %), Reticolociti (per mm3), Piastrine (PLT/mm3), volume piastrinico medio (MPV fL), Leucociti totali (WBC/mm3) e conta differenziale (Neutrofili, Linfociti, Monociti e Basofili per mm3), Delta Neutrophil

index (DNI %) e indici piastrinici: ampiezza della distribuzione dei volumi piastrinici

(PDW %), densità piastrinica media (MPC gr%), ampiezza della distribuzione della densità piastrinica (PCDW %), massa piastrinica media (MPM pg), ampiezza di distribuzione della massa piastrinica (PMDW %), numero di macropiastrine (LP/mm3) e di aggregati (PLT- clumps/mm3).

- un profilo biochimico di base comprendente: Aspartato-Aminotrasferasi (AST U/l), Alanina-Aminotrasferasi (ALT U/l), Fosfatasi Alcalina (AP U/l), Creatinina (mg/dl), Urea (mg/dl), Glucosio (mg/dl), Bilirubina totale (mg/dl), Colesterolo (mg/dl), Gammaglutamiltraferasi (GGT U/l), proteine totali (g/dl), Albumina (g/dl), rapporto Albumina/Globuline (A/G), Calcio totale (Ca mg/dl), Fosforo (P mg/dl), Sodio (Na mEq/l), Potassio (K mEq/l) e Cloro (Cl mEq/l).

- un profilo coagulativo ristretto, comprendente il Tempo di Protrombina (PT) e il tempo di Tromboplastina Parziale attivata (aPTT).

Sono inoltre stati determinati i seguenti parametri: sideremia (su siero), comprendente Ferro totale (Fe µg/dl), Transferrina (capacità totale di legare il Ferro, TIBC µg/dl), capacità di riserva della Transferrina (UIBC µg/dl), Saturazione della Transferrina (%); Proteina C-reattiva (CRP mg/dl) (su siero); Procalcitonina (PCT) (su plasma-EDTA); Fibrinogeno (g/l) e attività dell’Antitrombina (ATIII %) (su plasma-citrato).

L’esame emocromocitometrico è stato eseguito utilizzando il sistema per ematologia automatizzato Automated Hematology System ADVIA® 2120, (Siemens, USA), oltre alla lettura al microscopio di strisci ematici allestiti a fresco e colorati con colorazioni apposite per ematologia.

Le determinazioni su siero e plasma-citrato sono state eseguite grazie all’applicazione metodiche installate sull’analizzatore automatico OLYMPUS 400.

Tutte le determinazioni (ad eccezione della Procalcitonina, valutata presso un laboratorio esterno) sono state eseguite presso il Laboratorio del Servizio di Patologia Clinica (CLINLAB) del Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie dellʼAlma Mater Studiorum - Università di Bologna.

Calcio Totale:

La determinazione quantitativa di calcio totale nel siero è stata eseguita mediante l’uso di un test colorimetrico fotometrico (Calcium Arsenazo OSR60117).

Principio del test: il test si basa sulla reazione degli ioni Calcio con Arsenazo III, che forma un composto di colore viola intenso. L’assorbanza del complesso Calcio-Arsenazo III, a pH 6,9, viene misurata bicromaticamente a 660/700 nm; l’aumento dell’assorbanza nella miscela di reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione di calcio nel campione. Reagenti: Imidazolo (pH 6,9) Arsenazo III (0,1-0,2%) Conservante Conservazione:

Il reagente rimane stabile in confezione integra a 2-8°C fino alla data di scadenza indicata. Una volta aperto resta stabile per 90 giorni.

Linearità: il test è lineare all’interno di un intervallo di concentrazione pari a 4-20 mg/dl (1-5mmol/l) per il siero. Il test è lineare all’interno di un range di concentrazione di 0-40 mg/dl (0-10 mmol/l) per l’urina.

Interferenze:

Ittero - interferenza inferiore al 3% fino a 40mg/dl di bilirubina; Emolisi - interferenza inferiore al 3% fino a 5g/l di emoglobina; Lipemia - interferenza inferiore al 10% fino a 1000 mg/l di Intralipid; Magnesio - interferenza inferiore al 10% fino a 4 mmol/l di magnesio. Albumina:

L’albumina è stata misurata con metodica Olympus (Olympus System Reagent – Albumin, OSR 6102). Tale metodica è di utilizzo in routine da diversi anni in medicina umana e veterinaria ed è nota come metodo al verde di bromo-cresolo.

Principio del test:

Quando il verde di bromo cresolo reagisce con l’albumina, si forma un complesso colorato. L’assorbanza del complesso albumina-verde di bromo cresolo (di colore verde) viene misurata bicromaticamente (600-800nm) ed è proporzionale alla concentrazione di Albumina nel campione.

Reagenti, controllo di qualità e calibrazione:

Reagente

R1 Soluz. Tampone succinato (pH 4,2) 100 mmol/l

Conservazione:

2-25° a confezione integra fino a data di scadenza; aperto 90 giorni Reagente R2 Verde di bromocresolo 0,2mmol/l conservante Conservazione:

2-25° a confezione integra fino a data di scadenza; aperto 90 giorni Calibratore OLYMPUS SYSTEM CALIBRATOR

Cat.N°.66300

Conservazione: 2-8°C fino a 7 gg

Reagente R1

Soluz. Tampone succinato (pH 4,2) 100 mmol/l

Conservazione:

2-25° a confezione integra fino a data di scadenza; aperto 90 giorni Controllo Controlli Olympus Cat.-N° ODC0003, ODC0004 Conservazione: 2-8°C fino a 7 gg 15-25°C a 2 gg

Tabella 6.2. Reagenti, Controllo di qualità e Calibrazioni per la determinazione dell’Albumina.

Linearità e sensibilità analitica:

Il metodo è lineare per concentrazioni comprese tra 1,5-6,0 g/dl; il livello minimo rilevabile si stima essere 0,07g/l

Interferenze:

Bilirubina- interferenze inferiori al 10% fino a 40mg/dl o 684 µmol/l di bilirubina Emolisi- interferenze inferiori al 10% fino a 4,5 g/l di emoglobina

Lipemia- interferenze inferiori al 10% fino a 8000 mg/dl di Intralipid CRP:

La concentrazione della CRP è stata valutata mediante una metodica immunoturbidimetrica (Olympus System Reagent C-REACTIVE PROTEIN OSR 6147), in uso in medicina umana e validata nel nostro laboratorio per il cane.

Reagenti, Calibrazione:

Reagente R1

Tampone Tris (Idrossimetil) aminometano (pH 7,5) 80 mmol/l Conservazione: 2-8°C fino a 7 gg 15-25°C a 2 gg Reagente R2

Sodio cloruro 125 mmol/l Polietilenglicole 6000 1,5 %

w/v Anticorpo Anti-CRP umana da capra Conservante (sodio azide)

Conservazione: 2-8°C fino a 7 gg

15-25°C a 2 gg

Multicalibratore

Siero Proteine 1 OLYMPUS Cat.No. ODR3021

Conservazione: 2-8°C fino a 7 gg

Controllo

Controllo Olympus per Immunoturbidimetria Cat.-No ODC0014, ODC0015 e ODC0016 Conservazione: 2-8°C fino a 7 gg 15-25°C a 2 gg

Tabella 6.3. Reagenti, Controllo di qualità e Calibrazioni per la CRP.

Principio del metodo: il campione di siero viene miscelato con la soluzione tampone R1 e la soluzione anti-siero R2. La CRP reagisce e forma aggregati insolubili con il siero anti- CRP: l’assorbanza di tali aggregati è proporzionale alla concentrazione di CRP nel campione.

Linearità: il metodo è lineare per concentrazioni comprese nell’intervallo di 0,01-10 mg/dl. Interferenze:

Bilirubina - nessuna interferenza significativa fino a 40 mg/dl di bilirubina aggiunta; Emolisi - concentrazioni di emolisato aggiunto di 500 mg/dl portano ad un’interferenza significativa del 10%;

Lipidi - concentrazioni di lipidi aggiunti di 1000 mg/dl portano ad un’interferenza significativa del 20%.

Transferrina:

La Transferrina sierica è stata misurata attraverso la metodica indiretta della capacità totale di legare il ferro del siero (Total Iron Binding Capacity, TIBC). Tale metodica prevede il calcolo della TIBC ottenuta dalla somma del Ferro totale e della UIBC (Unsatured Iron

Binding Capacity): TIBC=UIBC + Ferro.

Ferro totale:

Il ferro totale del campione di siero è stato misurato attraverso la metodica colorimetrica di Olympus (Olympus System Reagent – IRON, EO50SR61235). Il metodo quantitativo si avvale di un substrato cromogeno (TPTZ) che reagisce con lo ione ferroso per formare un complesso di colore blu con massima assorbanza a 600/800 nm.

Reagenti, controllo di qualità e calibrazione:

Reagenti

Soluzione di glicina 215 mmol/l

Acido L ascorbico 4,7 mmol/l TPTZ 0,5 mmol/l Conservazione 2-6°C Calibratore Multicalibratore OLYMPUS SYSTEM CALIBRATOR Cat. N°.66300 Conservazione 2-8°C fino a 7 gg 15- 25° C a 2 gg Controllo controlli Olympus Multicontrollo Cat.-N° ODC003, ODC004 Conservazione: 2-8°C fino a 7 gg 15- 25°C a 2 gg

Tabella 6.4. Reagenti, Controllo di qualità e Calibrazioni per la determinazione del Ferro.

Principio del test:

Transferrina 2(Fe3+)  2(Fe3+) + Apotransferrina

2(Fe³+) + Acido ascorbico + 2H2 O→ 2(Fe²+) + Acido deidroascorbico + 2H3 O+

Fe2+ + TPTZ  Complesso di Ferro di colore Blu Linearità e sensibilità analitica:

il metodo risulta lineare tra concentrazioni di ferro comprese tra 10 e 1000 µg/dl. La sensibilità analitica ovvero la concentrazione minima rilevabile diversa da zero è di 0,3 µmol/l.

Interferenze:

Bilirubina- interferenza inferiore al 3% fino a 40 mg/dl di bilirubina aggiunta.

Emolisi- concentrazioni di emolisato aggiunto di 1000 mg/dl portano ad un’interferenza inferiore al 10%.

Lipidi- concentrazioni di lipidi aggiunti di 100 mg/dl (Intralipid®) portano ad un’interferenza inferiore al 10%.

UIBC:

La “capacità ferro- legante insaturata” o UIBC è stata valutata mediante un test colorimetrico di tipo quantitativo (Olympus System Reagent – UIBC, OSR 61205).

UIBC Reagente

Soluz. Tampone Tris 180 mmol/l Ferro 6,9 µmol/l Nitroso-PSAP 176 µmol/l Cloruro di idrossilammonio 36 mmol/l Tiourea 175 mmol/l Conservazione 2- 6°C Calibratore Multicalibratore OLYMPUS SYSTEM CALIBRATOR Cat.N°.66300 Conservazione: 2-8°C fino a 7 gg 15-25°C a 2 gg

Controllo Multicontrollo Cat.-N° Controlli Olympus ODC003, ODC004

Conservazione: 2-8°C fino a 7 gg

15-25°C a 2 gg

Tabella 6.5. Reagenti, Controllo di qualità e Calibrazioni per la determinazione dell’UIBC.

Principio del test:

La reazione alla base del test è che il Ferro del reagente R1 reagisca con il Nitroso-PSAP del reagente R2 per formare un complesso di colore verde. All’aggiunta del campione, una parte o tutti gli ioni Ferro del reagente R1, invece, si legano specificamente con la transferrina e pertanto non sono disponibili per la reazione colorata con il Nitroso-PSAP. La differenza delle assorbanze misurate con o senza l’aggiunta di campione rappresenta il valore di UIBC del campione in esame.

Linearità e sensibilità analitica:

il metodo risulta lineare tra concentrazioni di ferro comprese tra 55 e 450 µg/dl. La sensibilità analitica ovvero la concentrazione minima rilevabile diversa da zero è di 1,46 µmol/l.

Interferenze.

Emolisi: concentrazioni di emolisato aggiunto di 5 g/l portano ad un’interferenza inferiore al 10%.

Lipidi: concentrazioni di lipidi aggiunti di 1000 mg/dl (Intralipid®) portano ad un’interferenza inferiore al 10%.

Fibrinogeno:

Per la determinazione del Fibrinogeno è stata utilizzata una metodica di tipo turbidimetrico, validata nel nostro laboratorio per il cane.

Reagenti, Controllo di Qualità e Calibrazione:

Fibrinogeno Reagente R1 Solfato d’ammonio 0,42 mmol/l k3EDTA 39,6 mmol/l Guanidina HCl 26,2 mmol/l pH 4,9 Conservazione: 2-6° Fibrinogeno Reagente R2 Solfato d’ammonio 1,57 mmol/l k3EDTA 39,6 mmol/l Guanidina HCl 26,2 mmol/l pH 4,9 Conservazione: 2-6° Fibrinogeno Stamdard Fibrinogeno umano liofilizzato 2 g/l Conservazione: 2-6°C Stabilità 7 gg Fibrinogeno Diluente Citrato 15 µmol7/l Eparina 800 U/l A. AminoCaproico 0,1 mmol/l Albumina bovina 40 g/l Tampone fosfato pH 7,4 Conservazione: 2-6°C Stabilità 7 gg

Fibrinogeno Controllo, livello basso

Fibrinogeno umano liofilizzato 1 g/l Conservazione: 2-6°C Stabilità 7 gg

Tabella 6.6. Reagenti, Controllo di qualità e Calibrazioni per la determinazione del Fibrinogeno.

Principio del test: l’aggiunta di Ammoniofosfato, EDTA e Guanidina cloridrato determina la precipitazione del Fibrinogeno presente all’interno del campione di plasma citrato. L’analizzatore misura tale variazione turbidimetrica dopo aver valutato il cosiddetto bianco campione al fine di evitare le interferenze da bilirubina, emoglobina o chilomicroni.

Linearità: la metodica è lineare da 0 a 9,0 g/l. I campioni contenenti valori superiori devono essere diluiti (1+2) con il Diluente Fibrinogeno e rivalutati.

Altri dati: Temperatura 25°C, Lunghezza d’onda 340 nm. Antitrombina:

La determinazione quantitativa dell’attività di AT nel plasma citrato è stata ottenuta mediante un test colorimetrico (Antitrombin III, Cobas), impiegando analizzatori automatici di chimica clinica di Roche (11930028 216 Roche/Hitachi).

Reagenti, Conservazione e Stabilità:

Reagente R1

Reattivi di trombina Tampone TRIS/HCl: 100

mmol/L, pH8,1; eparina (mucosa porcina):

2U/mL;

aprotinina (polmone bovino): 6,5U/mL;

NaCl: 270 mmol/L; trombina (plasma bovino):

0,38 U/mL

Conservazione: integro a 2-8°C fino alla data

di scadenza indicata; 28 giorni aperto e refrigerato

Reagente R2 MeOCO-gli-pro-arg-pNA . Substrato (reattivo starter) AcOH: 1,8mmol/L

Conservazione: integro a 2-8°C fino alla data

di scadenza indicata; 28 giorni aperto e refrigerato

sull’analizzatore

Tabella 6.7. Reagenti, Controllo di qualità e Calibrazioni per la determinazione dell’Antitrombina.

Principio del metodo: al campione si aggiungono eparina e una quantità predefinita di trombina in eccesso. Tutta l’AT presente viene legata e forma un complesso inattivo. La trombina non inibita rilascia p-nitroanilina dal substrato cromogeno MeOCO-gli-pro-arg- pNA. Poichè la quota residua di trombina è inversamente proporzionale all’attività dell’AT nel campione, l’aumento dell’estinzione ad una lunghezza d’onda di 405 nm ci consente di calcolare tale parametro.

Interferenze:

Ittero - nessuna interferenza significativa fino a concentrazioni di bilirubina coniugata e non coniugata di 29mg/dl;

Emolisi - nessuna interferenza significativa fino ad una concentrazione di emoglobina di circa 1000mg/dl;

Lipemia - nessuna interferenza significativa fino ad una concentrazione di trigliceridi di circa 2500 mg/dl.

L’irudina, un potente inibitore della trombina, interferisce nei test per la ricerca di AT che impiegano trombina. Concentrazioni di irudina di 1microg/ml provocano valori di AT falsamente alti.

Procalcitonina:

La Procalcitonina è stata determinata attraverso un test in elettrochemioluminescenza (ECLIA) disponibile per gli analizzatori automatici Roche Elecsys, Cobas e Roche Modular E170,