Dimensione e densità delle cellule mucipare (goblet cell)

Per quanto riguarda la densità delle cellule mucipare Alcian blu positive (Tabella7), questa è stata di 486,2±351,74 μm2 per il gruppo di controllo, 711,5±365,53 μm2 _{per il gruppo IM17, 333,4±99,00 μm}2 _{per il gruppo IM33} e 499,5±361,14 μm2 _{per il gruppo IM50.}

Tabella 7: Effetto delle diete su densità e dimensione delle cellule mucipare

Nota: lettere differenti in ciascuna riga, indicano differenze statisticamente significative per p<0,05

Nel valutare la dimensione delle goblet cell Alcian blue positive (Tabella 7), si è visto che nel gruppo di controllo la loro superficie (m±ds) era di 54,2 ± 16,84 μm2 _{mentre nel gruppo IM17 di 70,1±19,54 μm}2_{, nel gruppo IM33} 62,5±0,84 μm2_{, nel gruppo IM50 51,8±9,51 μm}2_{; anche in questo caso, le} differenze tra gruppi non sono risultate essere statisticamente significative (P>0,05).

Per quanto riguarda la densità delle goblet cell PAS positive (Tabella 7), queste erano 598,0±280,86 cellule/μm2 _{nel gruppo di controllo e} 514,4±136,43, 236,5±147,94 603,9±291,87 nei gruppi di trattamento IM17, IM33 e IM50. Anche in questo caso, analogamente a quanto osservato per la

Parametro Chi2 P

n m ds n m ds n m ds n m ds

Densità cellule mucipare Alcian

positive 10 486,2 351,74 5 711,5 365,53 3 333,4 99,00 10 499,5 361,14 3,61 0,307 Dimensione cellule mucipare

Alcian positive 10 54,2 16,84 5 70,1 19,54 3 62,5 0,84 10 51,8 9,51 4,64 0,200 Densità cellule mucipare Pas

positive 9 598,0 280,86 4 514,4 136,43 4 236,5 147,94 9 603,9 291,87 6,25 0,100 Dimensione cellule mucipare

Pas positive 9 41,3 8,51 B 4 53,6 16,81 AB 4 63,3 6,19 A 9 36,8 10,58 B 11,29 0,010

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densità delle goblet cell Alcian positive, nessuna differenza statisticamente significativa è stata riscontrata tra i trattamenti considerati (P>0,05).

Infine, in relazione alla valutazione dell’area (dimensione) delle goblet cell PAS positive, sono state osservate differenze statisticamente significative (P<0,05) solo tra il gruppo di controllo e il gruppo IM33 (P<0,05); nel dettaglio, la dimensione delle goblet cell PAS positive è stata di 41,3±8,51 μm2 _{per il gruppo di controllo, di 53,6±16,81 μm}2_{, di 63,3±6,19, di} 36,8±10,6, rispettivamente per i gruppi IM17, IM33, IM50 (Tabella 7).

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4. Discussioni

I risultati osservati nell’ambito del presente lavoro, non hanno evidenziato alcuna influenza, né positiva né negativa, dei diversi livelli di inclusione della farina di HI nelle diete per zebrafish e in relazione alla lunghezza dei villi. Ciononostante, l’analisi dei preparati istologici ha permesso di evidenziare un aspetto che, sebbene di difficile interpretazione, sembra essere piuttosto interessante in quanto ad oggi mai specificamente dalla letteratura scientifica disponibile. In particolare, è stato osservato che i villi posizionati ai due lati opposti del lume dell’intestino, presentavano una lunghezza diversa. Per questo motivo, come già accennato, si è deciso di procedere a misurazioni separate dei villi, a seconda della loro posizione. L’ipotesi emessa è stata che villi più corti potrebbero caratterizzare il lato ventrale del lume intestinale, mentre quelli più lunghi, il lato dorsale; questa difformità potrebbe essere dovuta alla “pressione” esercitata dal passaggio del contenuto intestinale soprattutto sul lato ventrale del lume intestinale (per gravità). Se questa ipotesi fosse confermata, si potrebbe affermare che i villi posizionati sul lato superiore del lume intestinale, presentavano una lunghezza significativamente maggiore rispetto ai rispettivi contrapposti (porzione ventrale della mucosa intestinale). Lo stesso risultato era stato segnalato da Fronte et al. (2017) al I Italian Zebrafish Meeting tenutosi a Padova lo scorso anno, sebbene in bibliografia non si riscontrino ulteriori conferme in tal senso. Il dato ottenuto è di significativa importanza anche per futuri studi al fine di consentire una comparazione con dati precedentemente pubblicati.

Quando però la posizione dei villi è stata messa in relazione al trattamento (dieta), tali differenze non sono state evidenziate in nessuno dei livelli di inclusione di farina di HI considerati; di conseguenza, sembra ragionevole

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affermare che questo effetto non possa essere dovuto all’inclusione di farina di HI nei mangimi, ma a qualcosa che prescinde da questo aspetto. Per tale ragione, si ritiene necessario effettuare ulteriori studi in merito al fine di investigare se questa non sia più una peculiarità anatomica dello zebrafish che piuttosto che un parametro legato a fattori di altra natura (dieta, età, condizioni di allevamento, ecc.).

A questo proposito quindi (lunghezza dei villi), l’assenza di differenze tra i vari trattamenti considerati, permette di affermare che le diete testate non abbiano influito, né negativamente, né positivamente e che pertanto, a prescindere dal livello di inclusione della farina di HI, questa sembra idonea alla sostituzione della farina di pesce.

Del resto, sono pochi gli studi che, contrariamente a quanto osservato nel presente studio, e per i livelli di inclusione inferiori al 50% (0, 6,6, 13,2 e 26,4%), hanno osservato un accorciamento dei villi dell'intestino anteriore, solo per il livello di inclusione maggiore (26,4%) e nei confronti del gruppo di controllo (0%) e di quello a più basso livello di inclusione (6,6%) di farine sgrassata di HI (Dumas et al., 2018). Effetti della dieta sulla lunghezza dei villi sono stati riportati anche da Li et al. (2017), a seguito dell’introduzione di solo l’8% di farina di HI, anche in questo caso sgrassata, in dieta per Carpa Jian (Cyprinus carpio Var. Jian). Da un esame delle condizioni sperimentali, si rileva che gli studi citati, oltre ad essere stati condotti su trota (Oncorhynchus mykiss) e Carpa (Cyprinus carpio Var. Jian), e impiegata farina sgrassata di HI; per contro, il presente studio, oltre ad essere stato condotto su zebrafish, è stata impiegata farina “integrale” (cioè non sgrassata) di HI, anche in percentuali superiori di quanto fatto nei lavori già citati; tali differenze, quindi, potrebbero essere dovute più che al modello animale utilizzato, alla sgrassatura o meno della farina di HI. In questo senso,

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quindi, sarebbe interessante studiare l’effetto dell’olio di HI, come componente integrante della farina di HI o come prodotto a se stante.

Per contro, sempre Dumas et al. (2018) e sempre in relazione allo studio citato poc’anzi, non ha osservato differenze nella lunghezza dei villi a livello dell’intestino posteriore così come non ha osservato differenze, sia a livello di intestino anteriore che di quello posteriore, quando nella dieta era incluso olio di HI; quest’ultimo aspetto, tra l’altro, sembra ulteriormente confermare quanto sopra accennato in merito al ruolo all’olio di HI e anche spiegare l’assenza di differenze osservate nell’ambito del presente studio. L’assenza di modifiche in relazione alla lunghezza dei villi, è comunque stata riportata anche da Renna et al. (2017); in questo caso, l’inclusione di farina, ancora una volta sgrassata, di HI, aveva raggiunto il 40% della dieta e lo studio condotto su trota arcobaleno (Oncorhynchus mykiss) come già fatto da Dumas et al. (2018).

Tra l’altro, l’assenza di modificazioni sull'istologia intestinale (inclusa la lunghezza dei villi), a seguito dell’introduzione di una nuova materia prima nei mangimi, indica che questi ingredienti sono privi di allergeni e/o altre sostanze nocive per gli enterociti (Dumas et al., 2018). Inoltre è da evidenziare che eventuali risultati discordanti, anche ottenuti da prove sperimentali simili, possono essere dovute a difformità nella preparazione del prodotto (troppo spesso ancora “artigianale”) e/o alle condizioni sperimentali adottate nell’ambito dei vari studi. Infatti, molti studi sono troppo spesso condotti in “condizioni di campo” e magari in paesi in via di sviluppo, dove la standardizzazione delle condizioni sperimentali è spesso difficile da ottenere (Sealey et al., 2011).

Anche per quanto riguarda le goblet cell, i risultati osservati in questo esperimento non hanno fatto evidenziare effetti indesiderati che potrebbero

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sconsigliare l’uso delle farine HI. Infatti, sia per quanto riguarda la densità delle goblet cell (Alcian o PAS positive), sia per quanto riguarda la dimensione delle goblet cell Alcian positive, non sono state evidenziate modificazione degne di nota. Solo nel caso del gruppo IM33 e in relazione alle goblet cell PAS positive, è stato evidenziato un aumento della loro dimensione media rispetto sia al gruppo di controllo (solo farina di pesce), sia al gruppo IM50 (solo farina di insetto).

A questo riguardo, è da ricordare che l’efficienza della barriera intestinale dipende dalla produzione di mucine, oltre che dalla presenza ed equilibrio dei batteri commensali (Kim and Khan 2013, Johansson et al. 2013; Feist 2009; Faure et al., 2006); come noto, la produzione delle mucine, da parte delle goblet cell, può essere seriamente alterata dalla dieta e dai suoi ingredienti (Schroers et al. 2009, Schroers et al. 2008). In uno studio condotto da Fronte et al. (dati non pubblicati) è stato valutato l’effetto tre diete, contenenti farina di pesce (FM; controllo), farina di pesce idrolizzata (HFM) e lievito autolisato (AY), sia sulla crescita dell’orata che sulla morfologia intestinale; in tale studio è emerso un significativo aumento della densità delle cellule caliciformi nelle due diete sperimentali (HFM e AY) rispetto a quella di controllo (FM); questo risultato, era anche accompagnato da un quadro infiammatorio piuttosto diversificato e da un aumento delle goblet cell di piccole dimensioni nel gruppo ricevente AY rispetto a quello di controllo (FM). Torrecillas et al. (2011), invece, ha valutato gli effetti della somministrazione alimentare dei mannano-oligosaccaridi (MOS), tra l’altro, sui parametri immunitari e la produzione di muco del tratto gastrointestinale, riscontrando una correlazione positiva tra il livello di inclusione di MOS e la quantità di cellule che secernono mucine a livello dell'intestino posteriore. Ancora, Lenzi et al. (2012) ha svolto uno studio istologico sul tratto

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intestinale della Sparus aurata utilizzando diete sperimentali destinate alla sostituzione precoce dell’artemia durante lo sviluppo larvale; anche questo studio, come altri già citati, ha evidenziato come la dieta possa modificare la densità delle goblet cell suggerendo indicazioni in merito alla efficacia delle diete stesse.

Quindi, fermo restando l’importante ruolo giocato dalla dieta sulla densità e o dimensione delle goblet cell, risulta comunque di difficile interpretazione l’aumento di dimensione delle goblet cell PAS positive osservato nell’ambito del presente studio.

Pertanto, la mancanza di rilevanti modificazioni per quanto riguarda densità e dimensione delle goblet cell, in funzione della percentuale di inclusione di farina di HM in sostituzione di FM, ancora una volta si ritiene di poter suggerire che la farina di HI può essere considerata una valida alternativa alla FM, quantomeno nell’alimentazione dello zebrafish.

Nel complesso, una valutazione esaustiva dei risultati osservati nel presente lavoro, non può prescindere dalla contemporanea valutazione anche dei risultati zootecnici (Consumo di mangime, accrescimenti, conversione alimentare); infatti, molto spesso la variazione di uno o più parametri biologici (ad esempio l’indice epato-somatico e/o gonado-somatico) può essere positivamente o negativamente correlata alla produttività dell’animale o al suo stato di benessere generale; un aumento o una diminuzione dell’indice epato-somatico, infatti, può essere correlato ad esempio a un aumento di riserve di glicogeno (caso positivo), come anche a infarcimento lipidico o connettivale (caso negativo). Pertanto, è sempre importante mettere in relazione eventuali variazioni di alcuni parametri biologici quali la densità e/o la dimensione delle goblet cell, ma anche la lunghezza dei villi, con le performance di accrescimento osservate dagli stessi soggetti. Per

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questa ragione, di seguito vengono riassunti i risultati salienti osservati nel presente studio e già descritti da Gentile (2017):

• i gruppi IM17, IM33 e IM50, hanno presentato un indice di conversione alimentare significativamente più favorevole rispetto al gruppo di controllo;

• i gruppi IM17 e IM50, hanno presentato delle performance di accrescimento significativamente superiori rispetto al gruppo di controllo ma non rispetto al gruppo IM33.

In quest’ottica, quindi, non avendo osservato differenze di rilievo tra i soggetti trattati e sotto il profilo istologico, le positive performance di accrescimento osservate per i soggetti alimentati con farina di HI e già descritti da Gentile (2017), forniscono una ulteriore conferma dell’idoneità dell’impiego della di farina di HI, quantomeno in diete per zebrafish.

Infine, avendo osservato un aumento della dimensione delle goblet cell PAS positive esclusivamente nel gruppo IM33, l’unico ad aver fatto osservare delle performance di accrescimento superiori a quelle del gruppo di controllo, ma non in maniera statisticamente significativa, si ritiene che ci possa essere una relazione tra questo parametro e la minore performance di accrescimento osservata per questo gruppo, rispetto agli altri due gruppi trattati (IM17 e IM50). Sebbene al momento non è possibile fare ipotesi in merito, nuove indicazioni potranno arrivare a seguito dell’esecuzione, già programmata, di altri parametri legati all’efficienza digestiva quali l’espressione del gene Pept1 (trasportatore intestinale di peptidi) e dell’attività enzimatica di alfa-amilasi, alcalino-fosfatasi e tripsina.

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5. Conclusioni

Come già accennato, l’imponente incremento demografico sta portando a una domanda di prodotti alimentare e, in particolare, di proteine animali, sempre più importante. Al fine di soddisfare queste esigenze, importanti istituzioni come la FAO e le sue agenzie, hanno indotto molti governi a dare sempre più spazio all’acquacoltura al fine di mantenere o migliorare i livelli di “sicurezza alimentare”, intesa come disponibilità di alimenti per l’intera popolazione mondiale. La scelta di promuovere lo sviluppo dell’acquacoltura come prima opzione strategica, è dovuta al fatto che questa presenta una “impronta ecologica” (Carbon footprint) assolutamente più vantaggiosa rispetto ad altre forme di allevamento e produzione di proteine animali.

Purtroppo, però, ancora oggi l’acquacoltura dipende dalla disponibilità di farine e oli di pesce che, essendo risorse “finite”, non permettono un adeguato sviluppo di questo settore. In quest’ottica, si rende quindi necessario la sostituzione della farina e degli oli di pesce nell’alimentazione delle specie ittiche carnivore con materie prime alternative.

Avendo registrato il parziale “fallimento” delle materie prime di origine vegetale, una valida alternativa sembra oggi essere rappresentata dalle farine di insetto e per questa ragione, nell’ambito del presente studio sono stati testati livelli di inclusione di farina di larve di Hermetia illucens pari allo 0%, 17%, 33% e 50% in diete per zebrafish, in sostituzione rispettivamente dello 0%, 33%, 66% e 100% della farina di pesce contenuta nel mangime di controllo. Nel dettaglio, essendo le performance zootecniche già state valutate in precedenza, nel presente lavoro sono stati descritti gli effetti delle

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diete su alcuni aspetti morfo-istologici dell’intestino di zebrafish, modello animale già ampiamente validato per questo tipo di studi.

Innanzitutto, e in tutti i soggetti analizzati, i risultati morfologici (lunghezza dei villi) hanno fatto evidenziare una difformità di lunghezza tra i villi presenti sui due lati opposti dei preparati istologici. Questa evidenza, in pratica conferma quanto già osservato in un precedente studio condotto dallo stesso gruppo di ricerca, mentre questo fenomeno non risulta essere ancora descritto in letteratura e pertanto merita ulteriori approfondimenti.

Per quanto invece riguarda l’esame morfo-istologico dei preparati, è stato possibile evidenziare come solo a carico dei soggetti che ricevevano il 33% di farina di larve di HI, si riscontrassero delle cellule mucipare PAS positive più grandi che nel gruppo di controllo. Questo dato, in particolare, risulta essere di difficile interpretazione e, in qualche modo, potrebbe anche essere messo in relazione alla ridotta (sebbene in maniera non statisticamente significativa) performance di crescita registrata per questo gruppo nei confronti degli altri due gruppi sperimentali (IM17 e IM50); c’è da dire comunque, che tale performance era stata comunque superiore a quella del gruppo di controllo, sebbene anche in questo caso non in maniera statisticamente significativa. In questo caso, in particolare, ulteriori indicazioni utili all’interpretazione del fenomeno osservato potrebbero venire dall’analisi, tutt’ora in corso, dell’espressione del gene Pept1 e dell’attività enzimatica.

Per quanto riguarda i restanti parametri studiati, e cioè la densità delle cellule mucipare (goblet cell) Alcian blu e PAS positive, come anche la dimensione delle cellule mucipare Alcian positive, nessuno dei trattamenti sperimentali ha determinato differenze rispetto al gruppo di controllo, come anche tra gli trattamenti. A tal riguardo, si ricorda che le cellule mucipare sono depositarie

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di importanti funzioni di protezione fisica dell’ospite, nei confronti di potenziali agenti patogeni esterni, mentre la lunghezza dei villi è indice di capacità di assorbimento dei principi nutritivi. Di conseguenza, i risultati osservati nel presente studio, sembrano suggerire che l’inclusione prima e la sostituzione della farina di pesce poi, con farina di larve di Hermetia illucens, non comporti una modifica, né in positivo, né in negativo, delle caratteristiche morfo-istologiche dell’intestino dei soggetti.

Pertanto, riteniamo di poter concludere che la farina integrale (non sgrassata) di larve di Hermetia illucens rappresenti una valida alternativa alla farina di pesce, sia in sostituzione parziale che totale, nell’alimentazione dello zebrafish. Nel caso di impiego in diete per altre specie ittiche carnivore, pur non aspettandosi risultati molto diversi, si suggerisce un suo impiego a parziale sostituzione della farina di pesce.

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