Le SIRTs, in particolare SIRT 1, hanno guadagnato nel tempo una notevole attenzione in campo medico grazie al loro ruolo di sensori metabolici e di mediatori della sopravvivenza cellulare in condizioni di stress, quali ad esempio la restrizione calorica e l’esercizio fisico, nelle quali la loro trascrizione risulta attivata.
Questi enzimi, infatti, hanno un ruolo chiave nella regolazione di molti aspetti del metabolismo cellulare, da quello energetico a quello di sintesi, modulano la trascrivibilità genica della cromatina e regolano l’attività di diversi fattori trascrizionali.
In letteratura, molti studi hanno messo in evidenza il ruolo di SIRT 1, la quale risulta essere coinvolta nei processi metabolici che ritardano l’invecchiamento e aumentano la durata della vita, nella regolazione del ciclo cellulare, nell’inibizione dell’apoptosi, nell’omeostasi del glucosio e nella secrezione dell’insulina. Come conseguenza di ciò, la caratterizzazione dei meccanismi molecolari, biochimici e fisiologici coinvolti negli effetti di SIRT 1 è importante non solo per meglio definire il suo ruolo fisiologico e/o fisiopatologico ma anche per l’identificazione di nuovi potenziali target farmacologici nei disordini metabolici come l’insulino-resistenza, il diabete mellito di tipo 2 e l’obesità, in cui i livelli di questa proteina risultano essere ridotti.
Sulla base di queste premesse, questo progetto sperimentale si pone come scopo generale la valutazione dell’effetto di sostanze attivatrici di SIRT 1 su modelli in vitro ed in vivo di diabete mellito di tipo 2. In particolare, è stato valutato l’effetto di modulatori nutraceutici di SIRT 1, precisamente Acido Ferulico e Tirosolo, in seguito a somministrazione singola o sinergica, sul pathway di SIRT 1 e AMPK e sui livelli di insulina.
STUDIO IN VITRO: è stato suddiviso in tre fasi sperimentali (Fasi I-III).
Nella I fase è stata valutata la vitalità cellulare in condizioni basali (5.5mM Glu) e in condizione di elevati livelli di glucosio (30 mM) in seguito a somministrazione singola e associata di Acido Ferulico e Tirosolo. Le sostanze sono state testate per valutare la loro eventuale citotossicità, a diverse concentrazioni e per un tempo di incubazione di 24 h, utilizzando il metodo fluorimetrico Cell Titer- Blue Viability Assay. L’analisi dei dati ha messo in evidenza come per le cellule incubate a concentrazioni basali di glucosio 5.5 mM e trattate con Acido Ferulico e Tirosolo in seguito somministrazione singola e associata, non è stata ottenuta nessuna diminuzione statisticamente significativa del numero di cellule vitali dei campioni trattati rispetto al controllo, ovvero rispetto alle cellule senza trattamento, dimostrando in questo modo la non tossicità delle sostanze. Al contrario, ad elevate concentrazioni di glucosio (30mM), è stata ottenuta una diminuzione statisticamente significativa del numero di cellule vitali rispetto al controllo basale a tutte le concentrazioni testate,
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ma il trattamento con AF e TY alle diverse concentrazioni, ha comportato un aumento della vitalità cellulare contrastando l’azione tossica del glucosio.
Nella II fase sono stati valutati gli effetti di Acido Ferulico e Tirosolo sull’espressione di SIRT 1 e sull’attivazione di AMPK in seguito a somministrazione singola e associata e in condizioni basali (5.5mM Glu) e di elevati livelli di glucosio (30 mM). In aggiunta è stata valutata l’eventuale presenza di un effetto sinergico. I risultati dei nostri esperimenti evidenziano che, in condizioni basali (5.5mM Glu), l’espressione/attivazione di SIRT 1 e di AMPK sia significativamente aumentata in tutti i gruppi sperimentali rispetto al gruppo controllo, sia quando le cellule sono state trattate con le sostanze singole (***p<0.001) sia in associazione confrontate con la somma delle singole somministrazioni (#p<0.05). D’altra parte, invece, ad elevate concentrazioni di glucosio (30mM), è stata ottenuta una diminuzione statisticamente significativa dell’espressione/attivazione di SIRT 1 e di AMPK (***p<0.001) rispetto al controllo basale quando le cellule sono state pre-incubate con alte concentrazioni di glucosio in assenza di trattamento con i due polifenoli testati.
Diversa è invece la situazione per quanto riguarda le cellule trattate con AF e TY in condizioni di elevate concentrazioni di glucosio. Infatti, il trattamento con TY e AF alle diverse concentrazioni, comporta un aumento dell’espressione/attivazione di SIRT 1 e di AMPK rispetto al controllo basale (**p<0.01), contrastando l’azione inibitrice del glucosio sull’espressione/attivazione di SIRT 1 e di AMPK. In dettaglio, l’analisi dei risultati delle associazioni tra le sostanze (Acido Ferulico+Tirosolo) ha messo in evidenza come la loro somministrazione associata comporti un aumento dell’espressione/attivazione di SIRT 1 e di AMPK maggiore e statisticamente significativo rispetto a quello ottenuto sommando gli effetti delle singole somministrazioni, evidenziando quindi la presenza di un effetto sinergico tra le sostanze sull’espressione/attivazione di SIRT 1 e di AMPK, sia in condizioni basali di glucosio (5.5mM Glu) per SIRT 1 e AMPK (#p<0.05), sia in condizioni di elevati livelli di glucosio (30 mM) solo per SIRT 1 (#p<0.05); mentre non si osservava un’azione sinergica delle sostanze sull’attivazione di AMPK in condizioni di 30 mM di glucosio (p=N.S).
Infine, nella III fase sono stati valutati i livelli di insulina mediante quantificazione con kit ELISA su cellule INS-1E in condizioni basali (5.5mM) e di elevati livelli di glucosio (30mM) in seguito a somministrazione singola e associata con i due polifenoli in esame.
In dettaglio, in condizioni di concentrazioni basali di glucosio 5.5 mM e in seguito a somministrazione singola di Acido ferulico e Tirosolo, non è stata osservata una variazione nel rilascio basale di insulina alle concentrazioni di AF 25 M e TY 10M rispetto al controllo. Invece, è stato osservato un aumento del rilascio di insulina statisticamente significativo rispetto al controllo alle concentrazioni di AF 50M e TY 20M (*p<0.05).
D’altra parte, invece, ad elevate concentrazioni di glucosio (30mM) e in seguito a somministrazione singola di AF e TY, è stato ottenuto un aumento del rilascio di insulina statisticamente significativo
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(***p<0.001) rispetto al controllo basale in tutti i gruppi sperimentali trattati con le sostanze testate. Sebbene, quando le cellule sono state pre-incubate con elevate concentrazioni di glucosio in assenza di trattamento con i due polifenoli testati si possa comunque rilevare un aumento del rilascio di insulina rispetto al controllo, nei gruppi trattati con AF e TY l’aumento del rilascio è maggiore e statisticamente significativo, non solo verso il controllo (***p<0.001), ma soprattutto verso i gruppi pre-incubati con 30 mM di glucosio senza polifenoli (#p<0.05). Inoltre, l’analisi dei risultati delle associazioni tra le sostanze [Acido Ferulico + Tirosolo] confrontata con la somma delle singole somministrazioni [AF]+[TY], in condizioni di concentrazioni basali di glucosio 5.5 mM, ha messo in evidenza un aumento del rilascio di insulina, statisticamente significativo per tutti i gruppi sperimentali rispetto al controllo (*p<0.05; **p<0.01) tranne che per il gruppo trattato con AF [25µM] + TY [20µM]. Inoltre, per quanto riguarda le somministrazioni associate, è stato osservato un incremento del rilascio di insulina rispetto alla somma delle singole somministrazioni ma non un effetto sinergico statisticamente significativo (p=N.S) D’altra parte, invece, ad elevate
concentrazioni di glucosio (30mM) è stato ottenuto un aumento del rilascio di insulina
statisticamente significativo (***p<0.001) rispetto al controllo basale in tutti i gruppi sperimentali trattati con le sostanze testate come è stato detto precedentemente. Per quanto riguarda invece le somministrazioni associate è stato osservato un incremento statisticamente significativo del rilascio di insulina rispetto alla somma delle singole somministrazioni, indicando un aumento sinergico statisticamente significativo (#p<0.05).
Questi dati confermano che il Tirosolo e l’Acido Ferulico somministrati sia singolarmente che in associazione sono stati in grado di stimolare un aumento del rilascio di insulina, da parte delle cellule INS1-E in maniera SIRT-1 dipendente.
STUDIO IN VIVO: l’analisi dei dati ottenuti mediante Western Blot conferma quanto osservato in vitro, evidenziando l’azione positiva di Tirosolo e Acido Ferulico sull’espressione di SIRT 1, dati avvalorati ancora di più dall’aumento statisticamente significativo di SIRT 1 rispetto al controllo nel plasma analizzato (***p<0.001). La presenza di un effetto sinergico è stata evidenziata in tutti gli organi, ad eccezione del rene, nel quale i valori ottenuti dalla somministrazione associata e dalla somma delle due somministrazioni singole si equivalgono.
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14. CONCLUSIONI
L’attività enzimatica di SIRT 1 come già detto in precedenza, dipende dalla presenza del cofattore NAD+, da ciò risulta chiaro che l’attività di questa proteina è direttamente legata alla regolazione del metabolismo lipidico e glucidico.
In letteratura, molti studi hanno messo in evidenza il potenziale ruolo di SIRT 1 nel metabolismo lipidico e glucidico. Nel primo caso è in grado di inibire la lipogenesi e la colesterologenesi, di aumentare la lipolisi, l’ossidazione degli acidi grassi e la biogenesi mitocondriale. Oltre a ciò, studi recenti hanno sottolineato l’importante ruolo di SIRT 1 anche nel metabolismo degli acidi biliari. Nel caso del metabolismo glucidico, stimola la gluconeogenesi, inibisce la glicolisi e agisce come un sensore dei livelli di insulina, modulando la produzione glucosio-sensibile di ATP e la conseguente secrezione di insulina dalle cellule beta-pancreatiche.
Prendendo in considerazione queste funzioni di SIRT 1, quello che si evince dai dati ottenuti in questo lavoro di tesi è come i due polifenoli testati, Acido Ferulico e Tirosolo, non solo sono in grado di modulare l’espressione di SIRT 1, ma possono interferire anche con l’attivazione di AMPK. In aggiunta, la loro azione risulta fortemente positiva sia quando le cellule sono state incubate in condizioni basali di glucosio (5.5 mM), sia quando le cellule sono state incubate in condizioni di elevati livelli di glucosio (30mM) e soprattutto in quest’ultima e particolare condizione, i due polifenoli sono stati in grado di contrastare la tossicità del glucosio inducendo un aumento della vitalità cellulare e un aumento dei livelli di espressione/attivazione di SIRT 1 e AMPK, che nelle medesime condizioni e senza trattamento con AF e TY sarebbero ridotti. Infine, sono stati in grado di indurre un aumento della secrezione di insulina stimolata dal glucosio mediante un meccanismo SIRT 1-dipendente.
Pertanto, questi risultati indicano come dei prodotti naturali e non tossici, interagendo con il signaling di SIRT 1 e dell’AMPK possano trovare applicazione preventiva o curativa, in molti disturbi metabolici come l’insulino-resistenza, il diabete mellito di tipo 2 e l’obesità ma anche, l’iperglicemia plasmatica, la sindrome metabolica, le sindromi epatiche, la steatosi epatica, l’ipertrigliceridemia e l’ipercolesterolemia.
Questa fase della sperimentazione in vitro è stata necessaria e importante per capire la fisiologia, le condizioni di coltura e la risposta delle cellule nei confronti delle sostanze utilizzate, ottenendo nel complesso dei risultati “incoraggianti”.
Infatti, successivamente la sperimentazione è stata traslata in vivo condotto su ratti wistar maschi sani. Uno studio pilota in vivo di questo tipo è stato necessario come conseguenza del fatto che, non sono presenti in letteratura altri studi in vivo che abbiano testato le nostre solite sostanze in associazione,
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per valutare i reali effetti di Acido Ferulico e Tirosolo sugli animali e per escludere eventuali effetti avversi o collaterali potenzialmente dannosi per gli stessi.
Questo studio pilota è una fase essenziale e fondamentale per poi procedere a quello che sarà la seconda fase dello studio in vivo condotto su un modello di “fat-fed streptozotocin rat”. Un modello di diabete di tipo 2 ottenuto somministrando moderate dosi di streptozotocina all’animale, reso già insulino- resistente attraverso il consumo di una “high-fat-diet”, permettendo così di ottenere un modello di iperglicemia associata a iperinsulinemia ed insulino-resistenza.
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