Discussione - Caratterizzazione di due modelli cellulari NG108-15 e U-87MG e analisi dell'espre

Recenti studi hanno dimostrato che la somministrazione i.c.v. di T1AM in topi è in grado di incrementare le capacità di apprendimento e memoria[68]. Esistono due distinti tipi di memoria, a breve e a lungo termine. Mentre la memoria a breve termine dipende da proteine preesistenti nella cellula, quella a lungo termine richiede l’attivazione di geni e la sintesi di nuove proteine. A tal proposito la T1AM sta emergendo come possibile modulatore di circuiti quali il sistema noradrenergico, dopaminergico, istaminergico e glutammatergico [27]. Essendo il glutammato il principale neurotrasmettitore eccitatorio del sistema nervoso centrale, i primi studi sul ruolo di T1AM sono stati condotti sul sistema glutammatergico.

Lo scopo di questa tesi è stato quello di caratterizzare due linee neuronali differenti per studiare gli effetti di T1AM sull’espressione di alcune delle principali proteine coinvolte nel sistema glutammatergico.

Come modello sperimentale sono state utilizzate due linee cellulari neuronali, una linea ibrida di neuroblastoma di topo e glioma di ratto (NG108-15) e una linea di glioblastoma umano (U-87MG). L’utilizzo delle linee neurali ha permesso di ricreare un modello dove fosse possibile studiare gli effetti di T1AM e resveratrolo sul sistema glutammatergico. L’azione di T1AM e resveratrolo è stata inoltre valutata in associazione al peptide β- amiloide 25-35, che ha azioni simili al frammento Aβ(1-42), costituente delle placche amiloidi caratteristiche di patologie neurodegenerative come l’Alzheimer.

Inizialmente le due linee neuronali NG108-15 e U-87MG sono state caratterizzate mediante Real Time PCR. In particolare è stata valutata l’espressione dei principali recettori del sistema glutammatergico (Nmdar1, Nmdar2b, Glur2, Ephb2, Taar1) e di alcune proteine (Pkcα, Pkcγ, Sirt1, Erk1) facenti parte della via di segnalazione ad essi associata. I risultati ottenuti dall’analisi con Real time PCR indicano che entrambe le linee cellulari esprimono i principali recettori della via glutammatergica, eccetto Nmdar2b e che solamente la linea umana U-87MG esprime Taar1, il principale recettore della T1AM. Tra tutti i recettori TAARs è stata valutata l’espressione solo di TAAR1 poiché risulta

espresso in maniera specifica in aree serotoninergiche e dopaminergiche quali l'ipotalamo o la regione paraippocampale e fra i suoi ligandi sono state ritrovate le iodotironamine[16]. Inoltre nel 2006 è stato dimostrato indirettamente il legame di T1AM al recettore TAAR1[19]. La linea NG che non esprime il gene TAAR1 può essere considerata come una sorta di controllo negativo per le U87 che invece lo esprimono; inoltre l’utilizzo di questa linea potrebbe permettere di valutare la presenza di meccanismi di trasporto e d’azione intracellulari della T1AM, che non coinvolgono il legame con il TAAR1. L’assenza del recettore NMDAR2B nei due modelli neuronali può essere spiegata dal fatto che la subunità NR1 si trova in maniera ubiquitaria in tutte le regioni cerebrali mentre la subunità NR2B è presente preferenzialmente nell’isocorteccia, nell’ippocampo e nel cervelletto[69]. Inoltre tramite Real time PCR è stato visto che sia la linea cellulare umana che la linea ibrida esprimono Sirt1, Erk1, Pkcα ma non sembrano esprimere PKCγ. Le chinasi PKCα e PKCγ sono membri della famiglia delle PKC attivate da Ca2+_e diacilglicerolo (DAG) e, mentre il primo risulta espresso in quasi tutte le aree cerebrali e in altri tipi di tessuti, l’espressione di Pkcγ è esclusiva del cervello e del midollo spinale in particolare si ritrova nel cervelletto, nell’ippocampo e nella corteccia cerebrale[70]. Da

questa caratterizzazione si evince che le linee neuronali NG108-15 e U-87MG esprimono varie proteine associate al sistema di glutammatergico e possono essere considerate un modello per valutare le potenziali capacità delle iodotironamine di modificare l’espressione delle proteine in oggetto.

Successivamente è stato valutato l’uptake cellulare di T1AM sia nei mezzi di coltura che nei lisati cellulari, in entrambi i modelli neuronali, NG108-15 e U-87MG, trattate con T1AM e incubate in mezzo standard DMEM con e senza FBS. Con questo esperimento è stato possibile valutare la permanenza della T1AM come tale nel mezzo, la sua capacità di essere assorbita dalla cellula e il suo metabolismo attraverso la produzione di acido iodotiroacetico (TA1) considerato un catabolita della T1AM.

Nei mezzi con FBS, sia della linea ibrida che di quella umana, è stato osservato un calo drastico della concentrazione di T1AM entro un’ora e un notevole aumento di TA1. Al contrario nei mezzi senza FBS non è stato osservato questo calo drastico della concentrazione di T1AM ma una riduzione che raggiunge un plateau in 60 minuti. La produzione di TA1 tende ad aumentare nei mezzi senza FBS mentre nei lisati cellulari ha un andamento differente per ogni linea cellulare. Lo stesso andamento è stato osservato anche nella linea H9c2.

Dai risultati ottenuti si conferma quindi che (a) il nostro modello in vitro è in grado di assorbire e di metabolizzare per deamminazione la T1AM e (b) come tale fenomeno apparentemente dipenda da specifiche proteine presenti nel siero fetale bovino utilizzato nel mezzo di coltura. (c) Inoltre è stato dimostrato come questo fenomeno non sia esclusivo delle sole cellule neurali.

Un aspetto da chiarire sono le molteplici vie coinvolte nel catabolismo di T1AM, inclusa la deaminazione ossidativa ad acido 3-iodotiroacetico o TA1[66], osservata nel nostro modello e già riportata in letteratura[13].

Su entrambi i modelli cellulari, NG108-15 e U-87MG sono stati eseguiti test di vitalità cellulare, tramite la colorazione con crystal violet, a seguito di trattamenti di 24h con resveratrolo (10µM), il peptide β amiloide 25-35 (10µM) e T1AM (0,1µM, 1µM e 10µM) sia singolarmente che in combinazione tra loro. Analizzando i risultati ottenuti si può osservare che la T1AM, alle concentrazioni testate, non sembra svolgere un’azione citotossica sulle linee neuronali NG108-15 e U-87MG. Solamente nella linea ibrida è stata riscontrata una riduzione significativa della vitalità alle concentrazioni di T1AM di 1M e 10M in combinazione con resveratrolo e il peptide β amiloide 25-35, come se presentasse una differente sensibilità alla combinazione di composti. Queste osservazioni lasciano ipotizzare che T1AM agisca in maniera differente nei confronti delle due distinte linee cellulari, rispecchiando un pattern proteico potenzialmente diverso espresso dai due tipi di cellula, come ,ad esempio, la presenza del recettore TAAR1 nella linea umana e la sua assenza in quella ibrida (Fig.11).

Differenti studi hanno dimostrato come resveratrolo e T1AM siano composti con struttura chimica simile e in grado di agire sinergicamente nel modificare l’espressione di alcune proteine coinvolte nella via glutammatergica, migliorando l’apprendimento e la memoria[27][56] e svolgendo un ruolo neuroprotettivo[25].

A tal proposito, sono stati valutati gli effetti di resveratrolo e T1AM sulla trascrizione genica di alcune proteine coinvolte nel sistema glutammatergico mediante qPCR, utilizzando i due modelli cellulari NG108-15 e U-87MG. I trattamenti cellulari sono stati effettuati con solo resveratrolo o in associazione con T1AM. Come geni di riferimento sono stati utilizzati TATA box binding protein (Tbp) e hypoxanthine guanine

phosphoribosyl transferase (Hprt) rispettivamente per la linea ibrida e la linea umana,

essendo risultati i più stabili e adatti alla normalizzazione dei risultati. In particolare è stata valutata l’espressione di: Erk1, Pkcα, Sirt1 nella linea cellulare NG108-15 e Sirt1 nella linea U-87MG. L’analisi è stata rivolta verso queste proteine in presenza di questi trattamenti, in quanto solo l’associazione delle T1AM con il resveratrolo, ha indotto una variazione significativa dell’espressione proteica; al contrario il trattamento con solo T1AM ha indotto variazioni significative esclusivamente a livello post-traduzionale, come visto in preliminari esperimenti con Western Blot. Si può ipotizzare che le due molecole, T1AM e resveratrolo, abbiano un’azione sinergica ma ulteriori indagini sono comunque necessarie per verificare questa ipotesi.

Dall’analisi effettuata con Real Time PCR è emerso che i trattamenti cellulari nella linea ibrida NG108-15, sia con resveratrolo in singolo che in combinazione a T1AM, non sembrano indurre delle variazioni significative nell’espressione genica di Erk1, Pkcα,

Sirt1. Probabilmente questo è dovuto alla mancanza del recettore TAAR1 nella linea

ibrida, nonostante sia stato verificato l’uptake cellulare di T1AM nelle NG tramite LC- MS-MS, indice della presenza di un meccanismo di trasporto intracellulare per la tironamina.Al contrario nella linea umana U-87MG esprimente il recettore TAAR1, a seguito del trattamento con solo resveratrolo (10μM) e con resveratrolo in associazione a T1AM è stata osservata una significativa variazione dell’espressione di Sirt1 alla concentrazione di T1AM (1μM). La SIRT1 è una deacetilasi che ha un ruolo in numerosi processi cellulari tra cui l’omeostasi dei lipidi e del glucosio[52]. Inoltre è presente nel tessuto nervoso dove svolge un’azione neuroprotettiva[53] e risulta coinvolta nei fenomeni di plastictà sinaptica. Una delle molecole attivatorie di SIRT1 è il resveratrolo[54]. In topi trattati con iniezioni intracerebroventricolari di resveratrolo per una settimana è stato notato un incremento della memoria a lungo termine e dell’induzione dell’LTP. Invece in topi ko per SIRT1 questi effetti vengono a mancare[56]. Da studi su colture di ippocampo è emerso che il resveratrolo attiva SIRT1 e agisce tramite un pathway miR-CREB-BDNF aumentando la memoria e l’apprendimento.

Si può quindi ipotizzare che la variazione di espressione di SIRT1 sia implicata nel meccanismo d’azione della T1AM nel tessuto neuronale in sinergia al resveratrolo. Dai dati ottenuti in questi studio il trattamento con solo resveratrolo sembra indurre un calo dell’espressione genica, anche se non raggiunge la significatività statistica. Occorrono, di

conseguenza, ulteriori indagini per capire se c’è un’azione diretta della tironamina o indiretta tramite l’attivazione di altre proteine implicata nella sua regolazione. Inoltre dato che il modello sperimentale prevede linee tumorali occorre chiarire se il meccanismo è comune anche a linee non tumorali e/o ad altri tipi di tessuto.

Riassumendo, in questo progetto di tesi è stato valutato l’effetto di T1AM sull’espressione di alcune delle principali proteine coinvolte nel sistema glutammatergico, in due modelli cellulari tumorali di tessuto nervoso. Le linee utilizzate sono una linea ibrida di neuroblastoma di topo e glioma di ratto (NG108-15) e una linea di glioblastoma umano (U-87MG). È stato osservato che entrambe le linee neuronali esprimono i principali recettori della via glutammatergica. Inoltre sono in grado di assorbire rapidamente e metabolizzare la T1AM che non risulta citotossica come tale ma solo in associazione con resveratrolo e in presenza di β amiloide nelle cellule NG108-15, ma non nelle U-87 che, a differenza delle NG108-15, esprimono il recettore TAAR1. Infine, essendo noto che T1AM e resveratrolo agiscono in maniera sinergica alterando l’espressione genica di proteine della via glutammatergica, sono stati eseguiti trattamenti cellulari con resveratrolo in singolo e in associazione alla T1AM alle due linee neurali. Dall’analisi quantitativa dell’espressione genica ottenuta con qPCR, sembra che il trattamento con T1AM a differenti concentrazioni e RSV(10μM) non alteri l’espressione di Erk1, Pkcα e

Sirt1 nella linea ibrida NG108-15, ma induca una significativa variazione

dell’espressione di Sirt1 nella linea umana U-87MG.

In questo lavoro di tesi tutti i risultati ottenuti derivano da linee tumorali di tessuto nervoso. Un obiettivo futuro è quello di estendere tali indagini a colture cellulari primarie derivate da mesencefalo di topo, sia ad uno stadio embrionale che adulto.

Ci si prospetta di valutare mediante Western Blot la variazione dell’espressione e l’attivazione della fosforilazione delle principali proteine coinvolte nel sistema glutammatergico in seguito a trattamenti con T1AM.

Inoltre sarebbe interessante indagare il ruolo neuroprotettivo di T1AM e resveratrolo anche in vivo. L’utilizzo di modelli murini di Alzheimer permetterebbe di valutare gli effetti di T1AM non solo dal punto di vista biochimico ma anche a livello fisiologico.

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Nel documento Caratterizzazione di due modelli cellulari NG108-15 e U-87MG e analisi dell'espressione genica di proteine coinvolte nel sistema glutammatergico in seguito a trattamenti con 3-iodotironamina (T1AM). (pagine 56-66)