Capitolo 5
Negli ultimi anni l’interesse per le ricerche farmacogenetiche ha subito un importante incremento grazie alle sempre maggiori possibilità di valutare la correlazione tra polimorfismi genici ed efficacia e/o tollerabilità ai farmaci. Infatti, applicando tali conoscenze in ambito terapeutico, sarebbe possibile definire la probabilità del paziente di rispondere in maniera adeguata ad un farmaco ad una certa dose, o di incorrere nel rischio di un evento avverso. E sulla base di queste conoscenze sarebbe possibile anche stabilire a priori la scelta della terapia farmacologica prevedendo rischi e benefici per il singolo paziente.
Questo lavoro di tesi aveva un duplice obiettivo, il primo dei quali era quello di valutare la fattibilità di impiegare saliva come matrice per l’isolamento di DNA genomico, e stabilire se la qualità dell’estratto fosse sufficientemente elevata da permettere analisi di genotipi mediate real-time PCR con piattaforma Taqman. I risultati hanno con successo confermato l’ipotesi iniziale, permettendo di raggiungere l’obiettivo prefissato. Infatti, nonostante la quantità di DNA estratta mediante il kit impiegato sia risultata inferiore a quella per un campione di sangue intero di pari volume, tutte le reazioni di genotipizzazione sono state eseguite con successo. Tale risultato dipende in parte anche dalla tecnica di biologia molecolare impiegata per la genotipizzazione, dato che l’uso di sonde marcate con fluorofori permette la discriminazione allelica anche quando la quantità di DNA non è elevata.
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Infatti, questa tecnica è stata inizialmente applicata per la quantificazione dell’espressione genica, attraverso l’amplificazione di cDNA retrotrascritto dall’mRNA. Inoltre, il vantaggio di impiegare la saliva come matrice per l’isolamento di DNA genomica risiede nella assoluta sicurezza per il paziente, dato che non sono necessarie tecniche cruenti o che portino a lesioni cutanee, rischi di emorragie o infezioni per l’inserzioni di aghi e altri strumenti, nella facilità di raccolta, non essendo necessario alcuno strumento o dispositivo medico appunto, e nella economicità, anche rispetto agli swab buccali.
Il secondo obiettivo del presente lavoro di tesi era quello di poter genotipizzare un numero di pazienti sufficientemente elevato da poter eseguire analisi statistiche di associazione tra polimorfismi del gene codificante il recettore beta1 adrenergico ed eventi cardiovascolari. Anche questo obiettivo è stato raggiunto, grazie all’arruolamento di un numero sufficientemente elevato di pazienti. Infatti, l’analisi dei genotipi ha mostrato che dei due polimorfismi, quello Arg389Gly era significativamente associato alla presenza di eventi cardiovascolari, con una maggiore frequenza nei pazienti omozigoti Arg/Arg. Al contrario, il polimorfismo Ser49Gly ha mostrato una ridotta frequenza dell’allele polimorfico, non permettendo di condurre una stima del rischio cardiovascolare anche in riferimento a questo SNP.
Nello svolgimento del presente lavoro di studio, l’influenza di altri fattori di rischio è stata presa in considerazione. Infatti, gli eventi cardiovascolari possono essere associati a condizioni fisiopatologiche, quali l’età, il peso, l’indice di massa corporea, le dislipidemie, o ambientali e comportamentali, quali il tabagismo e l’attività fisica. Da una prima analisi esplorativa è stato dimostrato che solo il peso e l’età erano statisticamente diversi tra i gruppi di pazienti con e senza eventi cardiovascolari, mentre per altri tale differenza non era significativa e quindi tali
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variabili non state prese in considerazione. In realtà, le successive analisi, come ad esempio l’analisi ROC ed il test di Wald nel modello multivariato, hanno mostrato che il peso e l’età non rappresentano variabili ad elevato livello di predizione del rischio cardiovascolare. Era corretto inserirle nel modello multivariato, dato che esse erano significativamente associate agli eventi cardiovascolari, ma i risultati hanno dimostrato che esse non sono variabili indipendenti nel modello di rischio finale che le prendeva in esame insieme al genotipo. Solo quest’ultimo è risultato una variabile indipendente anche nel modello multivariato, sottolineando ancor di più l’importanza di tale analisi.
Una riflessione che deve essere fatta intorno ai risultati del presente lavoro di tesi è basata sull’importanza dei recettori beta1 adrenergici nella regolazione delle funzioni dell’apparato cardiovascolare. Infatti, oltre ad avere un ruolo a livello cardiaco, stimolando tutte le funzioni cardiache, dalla gittata, alla frequenza cardiaca e alla velocità di conduzione dell’impulso elettrico di depolarizzazione, il recettore beta1 riveste una importante funzione nella regolazione del tono della tunica muscolare dei vasi sanguigni, attraverso la modulazione della secrezione di renina da parte del rene. Come è noto, la renina permette l’inizio del processo di trasformazione/attivazione dell’angiotensinogeno al prodotto finale angiotensina II che è il più potente mediatore endogeno della vasocostrizione. Se i polimorfismi dei recettori beta1 adrenergici analizzati sono in grado di modificare la reattività/attivazione dello stesso recettore al legame con i ligandi catecolaminergici endogeni, allora la presenza di tali polimorfismi può avere numerosi effetti cardiovascolari diretti, centrali (es., alterazioni del ritmo cardiaco) e periferici (es., ipertensione), ma anche indiretti (es., aumentata suscettibilità a numerosi e diversi fattori, quali potrebbe essere, ad esempio, gli ormoni tiroidei). Inoltre, anche la
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risposta ad agonisti/antagonisti farmacologici può essere alterata in presenza di tali polimorfismi.
Pertanto, data la complessità di questo argomento è auspicabile che dai risultati di questo lavoro di tesi possa prendere inizio un lavoro che sia in grado di eseguire le indagini necessarie su una popolazione numericamente più ampia rispetto alla presente.
In conclusione è possibile affermare che i risultati del presente studio dimostrano che la saliva può essere considerata una buona matrice per l’isolamento del DNA genomico, e che il polimorfismo Arg389 è risultato significativamente associato al rischio di eventi cardiovascolari in un modello multifattoriale. Alla luce di tali risultati, però è necessario considerare questo uno studio pilota, dato che sarà necessario aumentare la numerosità del campione per confermare i risultati ottenuti.
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