Poiché è nota un’azione neuroprotettiva associata sia alla 3-iodotironamina o T1AM sia
al resveratrolo o RSV, e visti i risultati osservati da Manni e collaboratori nel 2013, circa il ruolo di T1AM nella plasticità sinaptica, lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di
verificare quale potesse essere l’effetto di tali molecole sia singolarmente che in associazione tra loro, utilizzando come modello sperimentale due differenti linee cellulari: NG108-15 e U87MG. È stato inoltre valutato l’effetto di entrambi questi composti in associazione con il peptide Aβ, noto per causare effetti neurotossici legati all’insorgenza dell’Alzheimer.
Per quanto riguarda le NG108-15, queste sono molte utilizzate come modello neurale in vitro in quanto, essendo una linea mista di neuroblastoma murino e glioma di ratto, sono rappresentative di entrambe le componenti presenti in un tessuto nervoso. Le U87MG invece, rappresentano una linea cellulare pura derivata da glioblastoma umano. Inizialmente sono stati eseguiti test di vitalità cellulare a seguito di trattamenti per 24h con RSV, il peptide Aβ e T1AM sia singolarmente che in combinazione tra loro.
Analizzando i risultati ottenuti si può osservare che T1AM risulta svolgere un’azione
citotossica sulle NG108-15 a partire da concentrazioni di 1 µM, mentre nelle U87 non si osserva una riduzione significativa della vitalità neanche alle più alte concentrazioni di T1AM utilizzate. Si potrebbe quindi ipotizzare che T1AM agisca in maniera differente sulle
due distinte linee cellulari.
Si è inoltre testata sulle NG108-15, la capacità citotossica di due differenti forme di peptide Aβ : Aβ(1-42) e Aβ (25-35) entrambe in grado di formare aggregati β-amiloidi. Dai risultati si evince che entrambe inducono un effetto analogo, riducendo in maniera significativa la vitalità cellulare entro 24h.
Per quanto riguarda il RSV, mentre nelle NG108-15, questo esplica attività citotossica a concentrazioni elevate di 50-100 µM, nelle U87 tale effetto non viene osservato. Anche in presenza di concentrazioni molto alte di RSV, infatti, i livelli di vitalità cellulare delle U87 sono paragonabili al controllo.
Stesso risultato si può osservare nelle U87 trattate con RSV e T1AM in cui, mentre il RSV
10 µM da solo porta ad un aumento della vitalità, in associazione con T1AM non si
osservano variazioni rispetto al controllo. Nel caso delle NG108-15 invece, si osserva una riduzione significativa della vitalità soltanto in presenza di RSV associato a concentrazioni di T1AM di 500 nM- 20 µM.
Aβ(25-35) in associazione con T1AM sembra causare elevati livelli di tossicità riscontrabili
in entrambe le linee. Si può quindi dedurre che T1AM non sembra in grado di ridurre il
60 Infine, in presenza di Aβ(25-35) 10 µM e RSV 10 µM, si osservano nelle NG108-15 ridotti livelli di vitalità che vengono mantenuti anche in presenza di T1AM. Di conseguenza,
anche in questo caso, T1AM non si rivela in grado di controbilanciare tale effetto.
In base a questi risultati si sono scelte tre differenti concentrazioni rappresentative di T1AM : 0,1 /1 /10 µM, da utilizzare nei trattamenti successivi.
Gli esperimenti sono quindi proseguiti con l’analisi mediante Western Blot della variazione di espressione delle principali proteine coinvolte nel meccanismo del potenziamento a lungo termine o LTP, che risulta compromesso nella patologia di Alzheimer. Nonostante si tratti di un fenomeno elettrofisiologico complesso, lo scopo è stato quello di verificare, a livello cellulare e in una condizione basale, quale potesse essere l’effetto di tali molecole sull’espressione delle proteine che hanno un ruolo chiave nell’LTP.
Innanzitutto, per poter caratterizzare le due linee cellulari, si è valutata l’effettiva espressione delle proteine che svolgono un ruolo chiave in questo processo.
Si è cosi evidenziato che le NG108-15 risultano in gradi di esprimere: AMPA, EphB2, CaMKII,PKC,ERK1-2,CREB e pCREB. I loro livelli di espressione non risultano alterati da T1AM.
Si è inoltre riscontrato, in questa linea cellulare, un aumento di espressione della chinasi PKC, soltanto in presenza sia di RSV 10 µM che di T1AM ,alle due concentrazioni di 0,1
µM e 1 µM, mentre non si osserva tale aumento in presenza di Aβ(25-35) 10 µM da solo o in associazione con RSV 10 µM, con T1AM o con entrambi. Si potrebbe quindi
ipotizzare un possibile ruolo sinergico di T1AM e del RSV.
Infine, si è osservato un aumento significativo delle proteine ERK1-2 nelle NG108-15 preincubate con Aβ(25-35) 10 µM associata a RSV 10 µM e T1AM alle due
concentrazioni di 1 µM e 10 µM.
La letteratura riporta vari studi che dimostrano che i polifenoli possiedono effetti neuroprotettivi sia in vivo sia in vitro. Il resveratrolo e suoi derivati, in particolare, hanno guadagnato un ruolo di primo piano rispetto ad altri polifenoli per le loro proprietà neuroprotettive (85) (96).
Il resveratrolo è uno stilbene idrossilato con azione protettiva contro lo stress ossidativo, l’infiammazione, lo sviluppo di malattie cardiovascolari e i tumori. Gioca, inoltre, un ruolo chiave nella prevenzione di patologie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la corea di Huntington’s grazie alla sua capacità di attraversare la barriera ematoencefalica (97) (98) (99). I suoi effetti neuroprotettivi si esplicano in un range di concentrazione tra 10 e 100 M (100) e in vitro il resveratrolo agisce da modulatore positivo della SIRT1, promuovendo la sopravvivenza dei neuroni (101) (102) (103).
61 La T1AM presenta una struttura chimica simile al resveratrolo, con anelli aromatici
idrossilati. Gli effetti neuroprotettivi della T1AM sono già noti, in letteratura, coinvolgere
pathways che includono l’attivazione di chinasi tipo ERK (2). Gli effetti finali indotti dalle ERK, però, possono essere molteplici a seconda della condizione cellulare: dall’attivazione del meccanismo del LTP (71) alla disfunzione sinaptica indotta dall’accumulo di beta-amiloide (104), all’aumento di espressione di proteine coinvolte nella crescita cellulare fino alla proliferazione cellulare nelle cellule tumorali. Anche il resveratrolo, secondo recenti studi, potrebbe svolgere i suoi effetti neuroprotettivi e antidepressivi attraverso unmeccanismo che porta l’attivazione delle chinasi ERK (105) (90). Al contrario i suoi effetti antitumorali sembrano mediati da una soppressione della via di segnalazione delle ERK (91).
Altre chinasi potrebbero essere coinvolte nel meccanismo neuroprotettivo. Menard e collaboratori nel 2013 (89), con i loro studi in neuroni ippocampali, hanno osservato che la proteina chinasi C e in particolare l‘isoforma gamma giochi un ruolo chiave nell’azione protettiva del resveratrolo e suoi analoghi per garantire l’integrità neuronale. Nella linea NG 108-15, RSV e T1AM in combinazione inducono un aumento della PKC, mentre
in presenza di Aβ(25-35) l’effetto si annulla indicando che i due composti non riescono a contrastare l’azione della beta-amiloide. Inoltre tale effetto non si rileva nella linea cellulare U87MG.
Nel caso delle U87MG, si è evidenziato che queste risultano in grado di esprimere il recettore AMPA, che svolge un ruolo cruciale nella fase di induzione dell’LTP, e la sua espressione si mantiene inalterata anche in presenza di T1AM.
Si sono inoltre riscontrate delle differenze tra le due linee cellulari nell’espressione della SIRT1 e di pCREB.
La SIRT1 infatti, a differenza che nelle NG108-15, risulta aumentare significativamente in presenza di RSV 10 µM e di T1AM ,alle due concentrazioni di 0,1 µM e 1 µM. In più,
mentre nelle NG108-15 si osserva una doppia banda, nelle U87MG la presenza di un'unica banda potrebbe essere indicativa di un differente profilo di espressione o di regolazione di tale proteina nelle due linee.
Infine si è osservato un aumento della forma fosforilata della proteina CREB nelle U87MG trattate con T1AM 1 µM, che rappresenta un importante step nella via di
trasduzione dell’LTP.
ERK, una volta attivo, promuove indirettamente l’attivazione di CREB tramite l’azione di chinasi che reclutano la CREB binding protein (CBP). A CREB è stato associato un ruolo importante come fattore di trascrizione coinvolto nella formazione della memoria. La proteina CREB può essere vista come un punto di convergenza per diverse proteine chinasi attivate nella fase di induzione dell’LTP (106). Può essere attivata, mediante fosforilazione reversibile su diversi residui di serina, da molte chinasi come la PKA, la PKC, la PKB/AKT o la CaMKII.
62 Oltre all’ LTP, la proteina CREB regola numerosi altri processi fisiologici, inclusi il ciclo e la proliferazione cellulari, le risposte immunitarie, il differenziamento, l’angiogenesi e la sopravvivenza. Oltre al suo ruolo fisiologico, CREB è coinvolto nelle trasformazioni maligne delle cellule. Cellule di glioblastoma, carcinoma mammario, melanoma ed altri tumori solidi esprimono alte concentrazioni di CREB, rispetto ai tessuti adiacenti non tumorali. Tale effetto è stato associato ad alterazioni a livello post-trascrizionale a carico di vari miRNA. Accanto ad un controllo post-trascrizionale, l’attività di CREB può essere regolata anche a livello post-trasduzionale da vari segnali extracellulari tra cui la fosforilazione, l’ubiquitinazione e l’acetilazione (73). La fosforilazione di CREB è quindi una modificazione importante per l’attività e gli effetti finali di questa proteina.
NG 108-15 U87 MG T1AM 1 µM pCREB RSV 10 µM + T1AM (0,1/1 µM) PKC SIRT1 Aβ(25-35) 10 µM +RSV 10 µM+ T1AM 1/10 µM ERK1-2
Tabella 2. Schema riassunto dei risultati ottenuti mediante Western Blot nelle
due linee cellulari.
Allo scopo di evidenziare la presenza o assenza di proteine fosforilate nei lisati cellulari utilizzando un ulteriore controllo, è stato inoltre messo a punto un protocollo che prevede un trattamento preventivo con la fosfatasi lambda, la quale catalizza la rimozione di gruppi fosfato da residui di serina, treonina e tirosina.
Un obiettivo futuro è quello di utilizzare tale protocollo per caratterizzare la fosforilazione delle proteine maggiormente coinvolte con l’LTP, a seguito di trattamenti, con le tre molecole oggetto di studio, per diversi periodi di tempo: 30 minuti, 1 ora, 4 ore e 24 ore.
Un altro importante scopo è stato quello di ottenere, mediante un protocollo di serum starvation, già noto in letteratura, una linea cellulare differenziata verso un fenotipo
63 colinergico, a partire da NG108-15 indifferenziate. Tale linea potrebbe essere in futuro utilizzata come ulteriore modello cellulare in vitro.
Da un’analisi preliminare di natura strettamente morfologica, si è osservata, a seguito del trattamento, una transizione fenotipica evidente. Tuttavia per poter confermare l’avvenuto differenziamento saranno necessarie in futuro ulteriori analisi mediante Real Time PCR su geni marker noti, caratteristici della linea colinergica. Tra questi: SERCA2 (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase), ChAT (Choline acetyltransferase) o IP3R3 (inositol 1,4,5-trisphosphate receptors).
In conclusione, resveratrolo e T1AM sono composti con struttura chimica simile che si
sono dimostrati in grado di agire sinergicamente nel modificare l’espressione di alcune proteine coinvolte nella cascata di trasduzione del segnale associata al LTP, in linee cellulari tumorali di tessuto nervoso. I loro effetti possono variare utilizzando linee cellulari diverse e in presenza di beta-amiloide. Per chiarire ulteriormente questi aspetti come prospettive future ci si propone di estendere tali trattamenti a :
- una linea cellulare di solo neuroblastoma, come la linea BE(2)-C derivata da biopsia di midollo osseo umano
- colture cellulari primarie derivate da mesencefalo di topo, sia ad uno stadio embrionale che adulto
- modelli murini di Alzheimer, ampliando quindi la ricerca anche in vivo, a livello fisiologico, oltre che molecolare-cellulare.
64 Il lavoro svolto è parte di un più ampio progetto, che verrà presentato nella sessione O7 -Mechanisms of Thyroid Hormone Action in Brain and Thyroid in occasione del 40th Annual Meeting of the European Thyroid Association (ETA), che si terrà a Belgrado nei giorni 9-12 settembre 2017. Si riporta di seguito l’abstract:
Effects of 3-iodothyronamine (T1AM) on signaling pathways involved in synaptic plasticity and neuroprotection.
Ginevra Sacripanti, Maria Pia Fogliaro, Giulia Giannini, Leonardo Lorenzini, Riccardo Zucchi, Sandra Ghelardoni
In mouse, the administration of 3-iodothyronamine (T1AM) had an antiamnestic and
prolearning effect. In addition, T1AM rescued long term potentiation (LTP) in enthorinal
cortex exposed to the toxic effect of β-amyloid. In the present paper we used a neuronal cell line to evaluate the effect of T1AM on the expression calcium calmodulin dependent
kinase II (CamKII) and protein kinase C (PKC), two key players involved in LTP. The effects on sirtuin 1 (SIRT1), allegedly responsible for the neuroprotective effect of resveratrol, were also investigated.
Methods: A hybrid line of cancer cells of mouse neuroblastoma and rat glioma (NG108- 15) was used and treated with 100 nM to 10 M T1AM for 24 h, alone or in combination
with 10 µM resveratrol and/or 10 µM amyloid β peptide (25-35). Protein expression and post-translational modifications were investigated by Western blot technique. Glucose consumption was also measured upon 4 h treatment.
Results: NG108-15 expressed TAAR1, the putative T1AM receptor, as well as AMPA and
NMDA receptors, that are involved in the signaling cascade responsible of LTP. T1AM (10
M) induced CaMKII phosphorylation (p<0.001), but had no direct effect on PKC and SIRT1 expression. However, in the presence of β-amyloid, T1AM increased PKC and SIRT1
expression at 1 M and 10 M concentration, respectively, although β-amyloid alone had no significant effect. The response to resveratrol was also modified by T1AM, since
resveratrol inhibited PKC expression while the association of resveratrol and T1AM (100
nM) produced a remarkable increase vs the baseline (P<0.05). Furthermore an increase in glucose consumption was observed at the highest T1AM concentration (p<0.01).
Conclusions: In NG108-15 cells T1AM activated CaMKII and had complex effects on the
65