Discussione

Dai risultati ottenuti si conferma che il formaggio è un ottimo substrato per la formazione delle ammine biogene e il livello totale di queste ultime aumenta in maniera continua nel tempo di maturazione. In questo periodo infatti aumenta la disponibilità di amminoacidi dalla proteolisi, fattore determinante nella formazione delle ammine biogene.

Per quanto riguarda la tiramina, ritrovata soprattutto nei pecorini del caseificio A e C all’ottavo mese di maturazione, si può ribadire, in accordo a quanto descritto in letteratura, il ruolo dei microrganismi tecnologicamente utili, come i Lb, preminente nell'accumulo di questa ammina nei formaggi stagionati. I livelli di Lb infatti crescono favoriti dalle condizioni che trovano durante tutto il periodo di maturazione. Inoltre le peptidasi continuano ad avere azione anche dopo la lisi della cellula batterica.

L’istamina ha valori elevati solo al t4 del caseificio A, tuttavia non tali da provocare da sola problemi per la salute del consumatore. L’azione di putrescina e cadaverina può influenzare però la metabolizzazione di istamina e tiramina potenziandone gli effetti.

Il valore trovato di CAD e PUT non induce a pensare a cattive condizioni igieniche di nessun caseificio in particolare per la presenza di Enterobacteriaceae e di enterococchi che hanno un'alta attività decarbossilasica specifica per produrre queste due ammine.

Si può ipotizzare che la differenza nei titoli di ammine sia dovuta alla maggiore attività degli enzimi decarbossilasi o alla prevalenza di una determinata specie batterica rispetto ad un’altra che si accentua nel periodo di maturazione.

Dai dati ottenuti si nota come l’azione enzimatica dei batteri non ha portato alla formazione di una singola ammina ma si ha la prevalenza di più di una ammina, tenendo così sotto limiti contenuti il titolo delle ammine ritenute maggiormente un rischio per la salute del consumatore.

L’origine quindi di differenti colonie batteriche può essere ricercata nei fattori di processo propri dei tre caseifici analizzati.

Gli starter utilizzati, che come definito dal disciplinare di produzione del pecorino toscano DOP possono essere fermenti lattici autoctoni, naturali o selezionati, sono

53 un marchio distintivo di ciascun caseificio. La ceppoteca dei fermenti lattici selezionati dal latte ovino della zona delimitata di produzione è conservata presso il Consorzio di tutela incaricato alla vigilanza. La scelta degli starter rientra nel segreto di produzione, dovuto ad una tradizione consolidata nel tempo che non è possibile indagare a fondo.

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Capitolo 5 Conclusioni

Come riportato nei capitoli precedenti quando si analizza il processo produttivo del pecorino toscano DOP è importante lo stato della materia prima, in particolare per prevenire la presenza di Enterobacteriaceae; tuttavia il rispetto della corretta prassi igienica in questa fase non permette di garantire l’assenza di ammine biogene nel prodotto finito.

I microrganismi presenti per sua natura nel latte, l’impiego di ceppi decarbossilasi-positivi tra i microorganismi tecnologicamente utili, per esempio i batteri lattici, può portare a grandi quantità di ammine nel prodotto.

La maturazione a cui viene sottoposto il pecorino ne determina le caratteristiche organolettiche peculiari ed apprezzate dal consumatore, ma i dati raccolti confermano come con il passare del tempo nel prodotto stagionato si abbia un aumento generale di ammine biogene.

Il contenuto di ammine biogene nel pecorino toscano DOP stagionato, risultato dalla ricerca svolta nei tre caseifici toscani, non desta particolare preoccupazione per un soggetto sano perché, sebbene il formaggio sia in generale un alimento che si trova spesso sulle nostre tavole, non viene consumato in quantità elevate. Il consumo di una porzione singola di pecorino si può stimare in media variabile fra gli 80 e i 100 grammi.

Un discorso a parte invece deve essere fatto quando si parla di soggetti con problemi di carenza enzimatica genetica o indotta. Ricordando che l’inibizione delle decarbossilasi necessarie per la metabolizzazione di ammine biogene può essere causata dai farmaci IMAO, si focalizza l’attenzione sulla tiramina, trovata nei tre caseifici a livello alto all’ottavo mese di maturazione, ed alla cui mancata inibizione è stata associata la sindrome del formaggio (Cheese syndrome).

Constatando la grande variabilità emersa dalle analisi, potrebbe essere interessante verificare quale particolare flora microbica influisce sulla produzione di ammine biogene, con particolare attenzione ai batteri starter utilizzati.

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Bibliografia

1. Marcobal, A., De las Rivas, B., Landete, J. M., Tabera, L., Rosario, M. (2012) Tyramine and Phenylethylamine Biosynthesis by Food Bacteria. Critical reviews in food science and nutrition. Departamento de Microbiología, Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, Madrid, Spain 52. 448-67. 10.1080/10408398.2010.500545

2. Qi, W., Hou, L. H., Guo, H. L., Wang, C. L., Fan, Z. C., Liu, J. F. (2014) Effect of salt-tolerant yeast of Candida versatilis and Zygosaccharomyces rouxii on the production of biogenic amines during soy sauce fermentation. Tianjin, China: J. Sci. Food Agric. 94, 1537–1542. doi: 10.1002/jsfa.6454

3. Marino, M., Maifreni, M., Moret, S., Rondinini G. 2000. The capacity of Enterobacteriaceae species to produce biogenic amines in cheese. Letters in Applied Microbiology. 31, 169-173.

4. Linares, D.M., Cruz, Martín, M.C., Ladero, V., Alvarez, M.A., Fernández, M. 2011. Biogenic Amines in Dairy Products. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51, 691-703.

5. Ladero, V., Fernández, M., Calles-Enríquez, M., Sánchez-Llana, E., Cañedo, E., Cruz Martín M.C., Alvarez, M.A. 2012. Is the production of the biogenic amines tyramine and putrescine a species-level trait in enterococci?. Food Microbiology. 30, 132-138.

6. Loizzo, M.R., Menichini, F., Picci, N., Puoci, F., Spizzirri, U.G., Restuccia, D. (2013). Technological aspects and analytical determination of biogenic amines in cheese. Trends in Food Science & Technology. 30. 38–55. 10.1016/j.tifs.2012.11.005.

7. Dalgaard, P., Emborg, J., Kjolby, A., Sorensen, N., Ballin, N. 2008. Histamine and biogenic amines - formation and importance in seafood. In: Improving seafood products for the consumer. Borrensen T, ed. Woodhead Publishing Ltd., Cambridge, UK.

8. EFSA. 2011 EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Scientific Opinion on risk based control of biogenic amine formation in fermented foods. EFSA Journal. 9 (10), 2393.

56 9. Maintz, L., Novak, N., 2007. Histamine and histamine intolerance. American J. Clin. Nutrit. 85, 5, 1185-1196.

10. Klocker, J., Matzler, S.A., Huetz, G.N., Drasche, A., Kolbitsch, C., Schwelberger, H.G., 2005. Expression of histamine degrading enzymes in porcine tissues. Inflamm. Res. 54, Suppl. S54-57.

11. Jarisch, R., 2004. Histamin-Intoleranz, Histamin und Seekrankheit. 2nd ed. Thieme, Stuttgart.

12. Spano, G., Russo, P, Lonvaud-Funel, A., Lucas, P., Alexandre, H., Grandvalet, C., Coton, E., Coton, M., Barnavon, L., Bach, B., Rattray, F., Bunte, A., Magni, C., Alvarez, M., Fernandez, M., Lopez, P., Barcelo, P., Corbi, A., Lolkema, J.S. 2010. Risk assessment of biogenic amines in fermented food. European J. Clin. Nutrition, 64, 95-100.

13. Kanki, M., Yoda, T., Tsukamoto, T., Baba E. 2007. Histidine decarboxylases and their role in accumulation of histamine in tuna and dried saury. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5, 1467-1473.

14. Forth, W., Henschler, D., Rummel, W., Förstermann, U. and Starke, K. 2001. Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, 8th ed. München, Jena, Urban and Fischer.

15. Jørgensen, E.A., Knigge, U., Warberg, J. and Kjær A. 2007. Histamine and the regulation of body weight. Neuroendocrinology 86, 210-214

16. Lehane, L. and Olley, J. 2000. Histamine fish poisoning revisited. Int. J. Food Microbiol. 58, 1-2, 1-37.

17. Reese, I., Ballmer-Weber,B., Beyer,K., Fuchs,T., Kleine-Tebbe,J., Klimek, L., Lepp, U., Niggemann, B., Saloga, J., Schäfer, C., Werfel, T., Zuberbier, T., Margitta Worm, M. German guideline for the management of adverse reactions to ingested histamine: Guideline of the German Society for Allergology and Clinical Immunology (DGAKI), the German Society for Pediatric Allergology and Environmental Medicine (GPA), the German Association of Allergologists (AeDA), and the Swiss Society for Allergology and Immunology (SGAI)Allergo J Int. 2017; 26(2): 72–79.Published online 2017 Feb 27. doi: 10.1007/s40629-017- 0011-5

57 18. Rauscher-Gabernig, E., Grossgut, R., Bauer, F. and Paulsen, P. 2009. Assessment of alimentary histamine exposure of consumers in Austria and development of tolerable levels in typical foods. Food Control, 20, 423-9.

19. Wöhrl, S., Hemmer, W., Focke, M., Rappersberger, K. and Jarisch, R. 2004. Histamine interolerance-like symptoms in healthy volunteers by oral provocation with liquid histamine. Allergy Asthma Proc. 25, 5, 305-311.

20. Kanny, G., Moneret-Vautrin, D.A., Schohn, H., Feldman, L., Mallie, J.P. and Gueant, J.L. 1993. Abnormalities in histamine pharmacodynamics in chronic urticaria. Clin. Experimental Allergy 23, 12, 1015-1020.

21. Lund, B.M., Baird-Parker, T.C. and Gould, G.W. 2000. The microbiological safety and quality of food. Volume 1. Aspen Publishers, Maryland, United States, p. 582.

22. Broadley K.H., 2010. The vascular effects of trace amines and amphetamines. Pharmacology and Therapeutics 125, 363-375.

23. Branchek, T.A. and Blackburn, T.P. 2003. Trace amine receptors as targets for novel therapeutics: legend, mith and fact. Curr. Opinion Pharmacol. 3, 1, 90-97. 24. Frascarelli, S., Gghelardoni, S., Chiellini, G., Vardiu, R., Ronca-Testoni, S., Scalan, T.S., Grandy, D.K. and Zucchi, R. 2008. Cardiac effects of trace amines: pharmacological characterization of trace aminesassociated receptors. European J. Pharmacol. 587, 1-3, 231-236.

25. Stockley's Drug Interactions. 2011. The Royal Pharmaceutical Society of Great Britain. Published by Pharmaceutical Press , London, 2010.

26. Zimmer, R., Puech, A.J., Philipp, F. and Korn, A., 1990. Interaction between orally administered tyramine and moclobemide. Acta Psychiatr. Scand. Suppl. 360, 78-80.

27. Patat, A., Berlin, I., Durrieu, G., Armand, P., Fitoussi, S., Molinier, P. and Caille, P. 1995. Pressor effect of oral tyramine during treatment with befloxatone, a new reversible monoamine oxidase-A inhibitor, in healthy subjects. J. Clin. Pharmacol. 35, 6, 633-43.

28. Lucas, P.M., Blancato, V.S., Claisse, O., Magni, C., Lolkema, J.S. and Lonvaud-Funel, A. 2007. Agmatine deiminase pathway genes in Lactobacillus

58 brevis are linked to the tyrosine decarboxylation operon in a putative acid resistance locus. Microbiol. 153, 2221-2230.

29. Halász, A. and Baráth, Á. 2002. Toxicity of biogenic amines – the present knowledge. In Food Science and technology COST 917 Biogenically active amines in food, Vol VI, pp 131-141, EC Publication, Luxembourg.

30. WCRF / AICR. Food, Nutrition, Physical Activity and the Prevention of Cancer: a Global Perspective, AICR, Washinghton DC 2007

31. Drabik-Markiewicz, G., Dejaegher, B., De Mey, E., Kowalska, T., Paelinck, H., Vander Heyden, Y. 2011-06-15. Influence of putrescine, cadaverine, spermidine or spermine on the formation of N-nitrosamine in heated cured pork meat. Food Chem. 2011 Jun 15;126(4):1539-45. doi: 10.1016/j.foodchem.2010.11.149. Epub 2010 Dec 15.

32. Ienistea, C. Signifiance and detection of histamine in food. In: Hobbs, B.C., Christian, J.H.B., (editors), The microbiological safety of foods, Academic Press, New York, 1973 pp. 327-343

33. Hui, J.Y. and Taylor, S.L. 1985. Inhibition of in vivo histamine metabolism in rats by foodborne and pharmacologic inhibitors of diamine oxidase, histamine N- methyltransferase, and monoamine oxidase. Toxicol. Appl. Pharmacol. 81, 2, 241- 249.

34. Hungerford, J.M., 2010. Scombroid poisoning: A review. Toxicon 56, 2, 231- 243.

35. Rauscher-Gabernig, E., Gabernig, R., Brueller, W., Grossgut, R., Bauer, F., Paulsen, P. (2012). Dietary exposure assessment of putrescine and cadaverine and derivation of tolerable levels in selected foods consumed in Austria. European Food Research and Technology. 235. 10.1007/s00217-012-1748-1.

36. Mayer, H.K., Fiechter, G, Fischer, E. (2010). A new ultra-pressure liquid chromatography method for the determination of biogenic amines in cheese. J Chromatogr A 1217:3251 3257

37. Raithel, M., Kufner, M., Ulrich, P. and Hahn, E.G. 1999. The involvement of the histamine degradation pathway by diamine oxidase in manifest gastrointestinal allergies. Inflamm. Res. 48, Suppl. S75- 76.

59 38. Maintz, L., Benfadal, S., Allam, J.P., Hagemann, T., Fimmers, R. and Novak, N. 2006. Evidence for a reduced histamine degradation capacity in a subgroup of patients with atopic eczema. J. Allergy Clin. Immunol. 117, 5, 1106-1112.

39. Azzaro, A.J., Vandenberg, C.M., Blob, L.F., Kemper, E.M., Sharoky, M., Oren, D.A. and Campbell, B.J. 2006. Tyramine pressor sensitivity during treatment with the selegiline transdermal system 6 mg/24 h in healthy subjects. J. Clin. Pharmacol. 46, 8, 933-44.

40. Berlin, I., Anthenelli, R.M. Monoamine oxidases and tobacco smoking. Int J Neuropsychopharmacol. 2001 Mar;4(1):33-42.

41. Olivetti, P., Rapaccini S., Marconi A., Aleandri M. (1999). Differenze di qualità del latte ovino in relazione a tre diverse tipologie aziendali. Atti XII Congresso Nazionale S.I.P.A.O.C, 219-222.

42. Disciplinare di produzione dop pecorino toscano, 1.

43. Mele, M., Bulleri, E. Caratteristiche nutrizionali del formaggio Pecorino Toscano DOP in relazione al sistema di allevamento, I Georgofili. Quaderni 2015- I La ricerca e l’innovazione nel pecorino toscano DOP: i risultati ottenuti e le sfide per il futuro Firenze, 18 maggio 2015

44. Pattono, D., Bottero, M.T., Civera, T., Grassi, A., Turi, R.M. 2002. Frazioni azotate e amine biogene nel formaggio - Influenza di alcune variabili introdotte nel processo di caseificazione. Industrie Alimentari. 41, 1186- 1190

45. Novella-Rodríguez, S., Veciana-Nogués, M.T., Trujillo-Mesa, A.J., Vidal- Carou, M.C. 2002. Profile of Biogenic Amines in Goat Cheese Made from Pasteurized and Pressurized Milks. Journal of Food Science. 67, 2940-2944 46. Martuscelli, M., Gardini, F., Torriani, S., Mastrocola, D., Serio, A., Chaves López, C., Schirone, M., Suzzi, G. 2005. Production of biogenic amines during the ripening of Pecorino Abruzzese cheese. International Dairy Journal. 15, 571- 578.

47. Lanciotti, R., Patrignani, F., Iucci, L., Guerzoni, M.E., Suzzi, G., Belletti, N., Gardini, F. 2007. Effects of milk high pressure homogenization on biogenic amine accumulation during ripening of ovine and bovine Italian cheeses. Food Chemistry. 104, 693-701.

60 48. Del Signore, A., Di Giacomo, F. 2008. Technological factor influencing the biogenic amine content in sheep cheeses and sensorial analysis (time of ripening, temperature, form size, anti-mould). Journal of Commodity Science, Technology And Quality. 47 (I-IV), 229-243.

49. Schirone, M., Tofalo, R., Mazzone, G., Corsetti, A., Suzzi, G. 2011. Biogenic amine content and microbiological profile of Pecorino di Farindola cheese. Food Microbiology. 28, 128-136.

50. Mercogliano, R., De Felice, A., Chirollo, C., Cortesi, M.L. 2010. Production of vasoactive amines during the ripening of Pecorino Carmasciano cheese. Veterinary Research Comunications. 34 (Suppl1), 175-178

51. Forzale, F., Giorgi, M., Pedonese F., Nuvoloni, R., D'Ascenzi, C., Rindi, S. 2011. Contenuto di amine biogene nel “Pecorino del Parco di Migliarino – San Rossore”. A.I.V.I. Online. 1, 149-153.

52. Forzale, F., Nuvoloni, R., Pedonese, F., D'Ascenzi, C., Giorgi, M. 2011. Biogenic amines content in Tuscan traditional products of animal origin. Medycyna Weterynaryina. 67, 110-114.

53. Bizzarro R., Tarelli G., Giraffa G., Neviani E. (1999). Phenotypic and genotypic characterization of lactic acid bacteria isolated from Pecorino Toscano cheese. Italian Journal of Food Science, 12: 303–316.

54. Andic, S., Genccelep, H., Kose, S. 2010. Determination of Biogenic Amines in Herby Cheese. International Journal of Food Properties. 13, 1300-1314.

55. Roig-Sagués, A.X., Molina, A.P., Hernández-Herrero, M.M. 2002. Histamine and tyramine-forming microorganisms in Spanish traditional cheeses. European Food Research and Technology. 215, 96-100.

56. La Gioia, F., Rizzotti, L., Rossi, F., Gardini, F., Tabanelli, G., Torriani, S. Identification of a tyrosine decarboxylase gene (tdcA) in Streptococcus thermophilus 1TT45 and analysis of its expression and tyramine production in milk. Appl Environ Microbiol. 2011;77(3):1140–1144. doi:10.1128/AEM.01928- 10

57. Deetae, P., Mounier, J., Bonnarme, P., Spinnler, H., Irlinger, F. and Helinck, S. (2009), Effects of Proteus vulgaris growth on the establishment of a cheese

61 microbial community and on the production of volatile aroma compounds in a model cheese. Journal of Applied Microbiology, 107: 1404-1413.

58. Neviani, E., Bizzarro, R., Righini, A., Mucchetti, G. (1998): Pecorino toscano DOP: tecniche di produzione e caratteristiche microbiologiche, «Industria del Latte», 34 pp. 3-35.

59. Quigley, L., O’Sullivan, O., Stanton C., Beresford, T.P., Ross, R.P, Fitzgerald, G.F., Cotter, P.D. (2013): The complex microbiota of raw milk, «FEMS Microbiology Reviews», 37, pp. 664-698

60. Mucchetti, G., Neviani, E.: Microbiologia e tecnologia lattiero-casearia. Qualità e sicurezza, Milano: Tecniche Nuove Editore; 2006

61. Lazzi, C., Neviani, E., I microrganismi nella tecnologia di produzione del Pecorino Toscano DOP: starter autoctoni e relazioni con la qualità del formaggio. La Ricerca e l’innovazione nel Pecorino Toscano DOP: i risultati ottenuti e le sfide per il futuro Firenze, 18 maggio 2015 Edizioni Polistampa.

62. Pedonese, F., Nuvoloni, R., D’ascenzi, C., Forzale, F., Bartalini, E., Zucconi, C., Rindi, S. (2009). effetti di differenti modalita’ di conservazione sull’evoluzione del profilo microbiologico e fisico-chimico di pecorino toscano d.o.p. a pasta tenera. Scienza e Tecnica Lattiero-casearia 60 (4), pp. 389-411, 2009.

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RINGRAZIAMENTI

Desidero ringraziare tutti coloro che mi hanno aiutato nella stesura di questa tesi, in particolar modo il relatore Prof.ssa Guidi Alessandra e il correlatore Dr. Cianti Luca che si sono adoperati per indirizzarmi ad approfondire un argomento interessante come degna chiusura della scuola di specializzazione. Ogni possibile errore, inesattezza all’interno del corpo della tesi è esclusivamente da attribuirsi a me.

Ringrazio i Dirigenti Veterinari della Asl Toscana Centro per gli insegnamenti pratici ricevuti nello svolgimento del tirocinio, soprattutto il Dr. Giovanni Munaò, in qualità di tutor, che mi ha seguito per tre anni spingendomi su una strada di miglioramento che continuerò per tutto il resto della mia vita.

Ringrazio la Dr.ssa Sonia Bressan per avermi accolto nel setting sud-est ed avermi fatto vedere ulteriori aspetti del lavoro del dirigente veterinario. Ringrazio il Dr. Giorgio Sirugo soprattutto per il suo impegno nel farmi capire meglio l’attività di ispettore al macello. Ringrazio tutti i Dirigenti veterinari e Tecnici della prevenzione della Asl Toscana Centro che ho avuto modo di conoscere proprio grazie al dottor Munaò e con i quali ho potuto studiare sempre nuovi settori della sicurezza alimentare. Le persone che ho citato e altre che non ho citato non solo sono state una valida ispirazione in quanto a professionalità ma anche persone importanti dal lato umano e porterò sempre dentro di me il ricordo di questo periodo molto impegnativo ma senza dubbio molto gratificante.

Il ringraziamento più grande è ovviamente per i miei genitori che sempre mi supportano.

Ringrazio la professoressa Patrizia per l’aiuto nella parte ortografica e sintattica. Ringrazio gli amici, i colleghi, i compagni di classe che hanno reso la specializzazione interessante e stimolante. In particolare le compagne della macchina da Firenze: Giusy, Martina e Sara; le colleghe di tirocinio: Elena e Martina; la collega, socia e amica migliore che potessi trovare: Federica.