Le ammine biogene nel pecorino toscano DOP: definizione del pericolo e valutazione del rischio

Università degli Studi di Pisa

Scuola di Specializzazione in Ispezione degli alimenti di Origine

animale

Tesi di Specializzazione

Le ammine biogene nel pecorino toscano DOP:

definizione del pericolo e valutazione del rischio

Candidato: Nicola Brogelli Relatore: Prof.ssa Alessandra Guidi

Correlatore: Dr. Luca Cianti

Sommario

RIASSUNTO ...4

ABSTRACT ...4

Definizione degli acronimi ...6

Capitolo 1 Identificazione del pericolo ...7

1.1 Le ammine biogene (AB) ...7

1.1.1 Le ammine biogene negli alimenti ...9

1.2 L’istamina ... 10

1.2.1 Il ruolo dell’istamina nella fisiologia umana ... 11

1.2.2 Effetti tossici nell’essere umano ... 11

1.2.3 Relazione dose-risposta ... 12

1.3 La tiramina, feniletilammina, triptamina ... 13

1.3.1 Effetti tossici ... 14

1.4 Putrescina, cadaverina e spermidina ... 15

1.4.1 Ruolo fisiologico ... 15

1.4.2 Effetti tossici in umana... 16

1.5 Fattori che aumentano la sensibilità alle ammine biogene ... 19

1.5.1 IMAO ... 20

Capitolo 2 Il pecorino toscano DOP ... 24

2.1 Storia del pecorino toscano DOP ... 25

2.2 Processo produttivo del formaggio pecorino DOP ... 26

2.2.1 Diagramma di flusso processo di produzione ... 31

Capitolo 3 Le ammine biogene nei formaggi ... 33

3.1 Studi sulle ammine biogene nei formaggi ... 33

3.2 Aspetti microbiologici ... 37

3.3 Flora microbica presente nel Pecorino Toscano DOP ... 38

Capitolo 4 Parte sperimentale ... 41

4.1 Scopo della tesi... 41

4.2 Materiali e metodi ... 42

4.3 Risultati ... 44

Capitolo 5 Conclusioni ... 54 Bibliografia ... 55 RINGRAZIAMENTI ... 62

4

RIASSUNTO

Le ammine biogene sono basi organiche, naturalmente presenti negli organismi cellulari, essenziali, a bassa concentrazione, per le funzioni metaboliche e fisiologiche degli animali, delle piante e dei microrganismi. Esse sono presenti in un’ampia varietà di cibo ricco in proteine e/o fermentato. Sono formate tramite un processo di decarbossilazione microbica degli amminoacidi.

Le ammine biogene sono un contaminante biologico verso cui la Comunità Europea è particolarmente attenta dal momento che possono rappresentare un rischio per il consumatore a causa del loro effetto tossico. Questo effetto non è facilmente monitorabile in quanto molto spesso i sintomi non sono gravi e quindi non segnalati. Dalle analisi condotte in caseifici italiani ed europei riportate in bibliografia emerge che la presenza delle ammine biogene nei formaggi è una costante; cambiano tuttavia i titoli delle singole ammine. Partendo da questa evidenza, sono stati prelevati da tre caseifici del territorio toscano dei campioni di pecorino toscano DOP stagionato in quattro tempi diversi: t1 in 2 mesi, t2 in 4 mesi, t3 in 6 mesi e t4 8 mesi. I risultati ottenuti dalle analisi sono stati poi valutati tenendo conto dei dati attualmente conosciuti sul processo di produzione del pecorino e sull’influenza di fattori intrinseci ed estrinseci che portano alla presenza delle ammine biogene nel prodotto finale.

PAROLE CHIAVE:  valutazione del rischio  ammine biogene  pecorino toscano DOP  formaggio

ABSTRACT

Biogenic amines are organic bases that are naturally present in cellular organisms. They are essential for the metabolic and physiological functions of animals, plants

5 and microorganisms when they are at low concentration. Biogenic amines are present in a wide variety of protein-rich and / or fermented food. They are formed by microbial decarboxylation of amino acids. The European Community is particularly worried about biogenic amines; these biological contaminants pose a risk to the consumer due to their toxic effect.

This effect is not easily monitored because the symptoms are not severe and therefore not reported.

Many researchers have conducted analyzes in Italian and European dairies; the presence of biogenic amines in cheese is a constant, however, the titles of the individual amines change.

Starting from this evidence, samples of seasoned DOP Tuscan pecorino in four different times were taken from three dairies in the Tuscan territory: t1 2 months, t2 4 months, t3 6 months and t4 8 months.

The results obtained from this sampling have been evaluated taking into account the currently known data on the pecorino production process and on the influence of intrinsic and extrinsic factors that lead to the presence of biogenic amines in the final product.

KEYWORDS

 risk assessment

 biogenic amines

 d.o.p. toscano pecorino

6

Definizione degli acronimi

AB BAs: Ammine biogene AGM: Agmantina CAD: Cadaverina HIS: Istamina PHE: Feniletilammina PUT: Putrescina SPM: spermina SPD: Spermidina TRY: Triptamina TYR: Tiramina

7

Capitolo 1 Identificazione del

pericolo

1.1 Le ammine biogene (AB)

Le ammine biogene sono basi organiche a basso peso molecolare. Analizzando la loro struttura chimica, possono essere classificate come eterocicliche (istamina e triptamina), alifatiche (putrescina e cadaverina, spermidina, spermina) o aromatiche (tiramina e feniletilammina).

In base al numero di gruppi amminici che contengono possono essere divisi in monoammine

(istamina, tiramina e feniletilammina), diammine (putrescina e cadaverina), triammine (spermidina) e tetrammine (spermina).

Sono anche classificate come volatili (feniletilammina) e non volatili (istamina, cadaverina, putrescina, spermina, agmatina, triptamina, e tiramina).

Queste ammine sono naturalmente presenti negli organismi cellulari e sono essenziali, a bassa concentrazione, per le funzioni metaboliche e fisiologiche degli animali, delle piante e dei microrganismi.

Le più attive sono l’istamina e la tiramina, ma anche la putrescina, spermina, spermidina svolgono un ruolo nella crescita cellulare, nella differenziazione cellulare a causa della regolazione dell’espressione genica; sono altresì importanti per la modulazione della trasduzione del segnale.

Esse sono presenti in un’ampia varietà di cibo ricco in proteine e/o fermentato. Sono formate tramite un processo per decarbossilazione microbica degli amminoacidi.

Le ammine biogene possono essere prodotte sia da batteri Gram-positivi che da batteri Gram-negativi (1) Anche alcuni funghi (muffe e lieviti) sono coinvolti nella loro formazione (in particolare la cadaverina e la putrescina), ma il loro ruolo è ancora oggi dibattuto e per molti aspetti controverso.(2)

8 Gli enzimi che catalizzano la sintesi delle ammine sono chiamati amminoacido-decarbossilasi, agiscono selettivamente su specifici amminoacidi nei quali rimuovono il gruppo carbossilico con la formazione della corrispondente ammina e CO2.

La formula della reazione è la seguente:

decarbossilasi

R-CH-COOH R-CH2- NH2 + CO2

NH

Amminoacido Ammina

Dopo la decarbossilazione degli amminoacidi, la seconda fase del processo di amminogenesi è mediata da una proteina transmembrana, detta trasportatore di membrana, che permette il verificarsi di due eventi accoppiati (antiporto): viene rilasciato il substrato amminoacidico all’interno della cellula e vengono escreti i prodotti della decarbossilazione dal citoplasma.

La quantità delle AB è un importante indicatore del grado di freschezza, di maturazione e della qualità della conservazione del cibo. La loro concentrazione è maggiore nei cibi a rapida deperibilità: carne, pesce, birra, formaggio. Si trovano in minor quantità nel cioccolato, nella verdura e nei succhi di frutta.

Considerando che la formazione delle ammine dipende da molteplici fattori che interagiscono fra loro, ne consegue che è difficile caratterizzare quali sono gli effetti di ciascuna attività tecnologica sull’amminogenesi durante i processi di fermentazione, maturazione e conservazione.

Come è riportato negli studi effettuati da Marino (3) e successivamente supportati da quelli di Linares (4), si attribuisce la capacità di produrre una determinata ammina biogene come caratteristica distintiva di uno specifico ceppo con grandi differenze riportate per il tipo e la quantità di AB prodotte da ceppi diversi della stessa specie. Tuttavia gli studi di Ladero (5) hanno evidenziato che la produzione di tiramina è un tratto caratteristico delle specie Enterococcus durans,

9 Enterococcus faecium e Enterococcus faecalis. Lo stesso discorso vale per la capacita di produrre putrescina da parte di E. faecalis.(6)

I batteri Gram-negativi contaminanti come Hafnia alvei, Morganella morganii,

Klebsiella pneumoniae, Morganella psychrotolerans, Photobacterium

phosphoreum, Photobacterium psychrotolerans sono quelli implicati

maggiormente nella produzione di istamina. (7)

1.1.1 Le ammine biogene negli alimenti

La formazione delle ammine biogene come causa di intossicazione dei consumatori è ampiamente documentata in bibliografia. L’EFSA nel 2011 ha pubblicato una “review” dal titolo Scientific Opinion on risk based control of biogenic amine formation in fermented food EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ)2, 3 European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy (8)

In base ai dati sulla quantità di negli alimenti raccolti dall’EFSA, le categorie che mostrano la media più alta sono "acciughe essiccate" (348 mg / kg), "salsa di pesce" (196-197 mg / kg), "vegetali fermentati” (39,4 - 42,6 mg / kg), "formaggio" (20,9 - 62 mg / kg), "altri pesci e prodotti a base di pesce" (26,8 - 31,2 mg / kg) e "salsicce fermentate" (23,0 - 23,6 mg / kg).

Per quanto riguarda l’istamina, i valori di esposizione elevata sono stati calcolati per la matrice alimentare "altri pesci e prodotti ittici" (8.8 - 41.4 mg / giorno) seguito da "salsicce fermentate" (6.4 - 37.1 mg / giorno) e da "formaggio" (13 - 32.1 mg / giorno).

I valori medi più alti di tiramina invece si sono rilevati nei seguenti alimenti: "salsicce fermentate" (136 mg / kg), "salsa di pesce" (105 -107 mg / kg), "Formaggio" (68,5 - 104 mg / kg), "pesce fermentato" (47,2 -47,9 mg / kg) e "ortaggi fermentati" (45 - 47,4 mg / kg).

Per la tiramina, la classe con valori di esposizione elevati è stata calcolata per la birra (18,5 - 124,6 mg / giorno) e anche il formaggio ha mostrato un'elevata esposizione (44 - 108,7 mg / giorno). I Formaggi associati a focolai di intossicazione da istamina sono stati: Gouda, formaggio svizzero, Cheddar,

10 Gruyère e Cheshire. Le concentrazioni di istamina nei formaggi implicati in epidemie varia tra 850 e 1870 mg / kg.

1.2 L’istamina

L'istamina (2-4-imidazolil etilammina, formula C5H9N3) è una molecola organica,

sintetizzata a partire dall’amminoacido istidina per mezzo dell’enzima L-istidina decarbossilasi nell’apparato del Golgi di mastociti, basofili, piastrine, neuroni istaminergici e cellule enterocromaffine; piridossal fosfato o vitamina B6 svolgono il ruolo di cofattore. (9) Una volta sintetizzata viene immagazzinata in granuli ammassati all’interno di vescicole, per essere rilasciata dopo stimolazione. Può essere metabolizzata per deaminazione ossidativa da parte della diammino ossidasi (DAO) e per metilazione anulare da parte dell'istamina-N-metiltransferasi (HNMT), a seconda della sua localizzazione.

È dimostrato che DAO è una proteina secretoria prevalentemente sintetizzata nelle cellule epiteliali della porzione prossimale del tubulo renale e nelle cellule intestinali; viene immagazzinata nella vescicola associata alla membrana plasmatica. Pertanto, è stato proposto che DAO possa essere di primaria importanza per l'inattivazione e rimozione di istamina extracellulare proveniente da cibo ricco di istamina. (10)

Un’alta dose di cibo contenente istamina e il malfunzionamento o la ridotta attività di DAO possono causare livelli ematici elevati di istamina, che di conseguenza provocano un sovraccarico del sistema di inattivazione epatica interna di HNMT.

Differenze individuali nelle attività enzimatiche oltre a diverse concentrazioni di istamina nel cibo possono giustificare diversi livelli di tolleranza. (11)

L’istidina decarbossilasi ricade in due differenti classi: quella delle cellule eucariote e batteri Gram-negativi, la quale richiede il fosfato piridossalico come cofattore, e quella dei batteri Gram-positivi, che utilizza un meccanismo catalitico differente, basato su un gruppo piruvile legato covalentemente al sito attivo. Alcuni batteri Gram-negativi che contaminano l’alimento sono capaci di produrre istamina. I più forti produttori sono: Hafnia alvei, Morganella morganii,

11 Klebsiella pneumonia. Sono stati isolati dal pesce incriminato di episodi di sindrome sgombroide, Morganella psychrotolerans, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium psychrotolerans.

Nei cibi fermentati, è stata riscontrata la presenza dei ceppi di Oenococcus oeni, Pediococcus parvalus, Pediococcus damnosus, Tetragenococcus species, Leuconostoc species, Lactobacillus saerimneri, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus buchnerii e Lactobacillus curvatus, sono riconosciuti come produttori di istamina (12)

Kanki ha suggerito che l’attività enzimatica di istidina decarbossilasi continui anche dopo l’autolisi batterica; questo è stato confermato da esperimenti in cui è stato impiegato l’istidina decarbossilasi ricombinante (HDCs) ottenuta dai batteri istamino produttori, come nel caso di Photobacterium phosphoreum, P. damselae, R. planticola, e M. morganii dove gli stessi batteri erano assenti (13)

1.2.1 Il ruolo dell’istamina nella fisiologia umana

L’istamina è conosciuta come uno dei mediatori chimici più importanti nella reazione infiammatoria. Ha la funzione sia di ormone che di neurotrasmettitore. Le Mast cells, le cellule del sangue (in particolare basofili, granulociti e trombociti), e i neuroni nel cervello contengono istamina (14), la quale istamina interagendo con specifici recettori (H1, H2, H3, H4) sulle cellule target, l’istamina modula una varietà di funzioni. Il suo ruolo fisiologico include la secrezione acida gastrica, la crescita e la differenziazione cellulare, il ritmo circadiano, l’attenzione e la cognizione. Inoltre l’istamina è coinvolta nell’inizio della reazione allergica poichè recettori specifici che sono coinvolti nella contrazione dello strato di muscolo liscio (intestino, polmone, utero), e nella dilatazione dei vasi sanguigni, regolando così l’afflusso sanguigno nei tessuti circostanti come membrane mucose e sottocute (15).

1.2.2 Effetti tossici nell’essere umano

L’istamina assunta con la dieta è rapidamente metabolizzata dalle ammine ossidasi nelle persone che non presentano particolari patologie, ma che potrebbero comunque sviluppare i sintomi di intossicazione da essa come risultato di una dose ingerita troppo elevata. (16)

12 Grandi quantità d’istamina possono causare avvelenamento: quantità superiori a 100 milligrammi (mg) possono provocare solo lievi sintomi, mentre quantità superiori a 1000 mg possono provocare fenomeni di grave intossicazione. L'intossicazione da istamina si verifica soprattutto in seguito al consumo di pesce avariato, in particolare dalla famiglia Scombridae. (17)

La compromissione dell’attività delle DAO per predisposizione genetica, malattie gastrointestinali, o terapie con DAO inibitori hanno come risultato un eccesso di istamina e portano ad un’intolleranza all’istamina causando numerosi sintomi che mimano la reazione allergica anche dopo l’ingestione di un piccolo quantitativo che normalmente sarebbe tollerato da una persona sana L’intossicazione è caratterizzata da un periodo di incubazione che può variare da pochi minuti a qualche ora, con sintomi che nella maggior parte dei casi si risolvono in poche ore.

I sintomi legati all’intossicazione da istamina sono legati in particolare agli effetti sui vasi sanguigni e sulla muscolatura liscia e includono mal di testa, secrezione nasale, broncospasmo, tachicardia, extrasistole, ipotensione, edema palpebrale, orticaria, prurito, arrossamento, asma.

L’assunzione di istamina con la dieta è associata anche con lo svilupparsi di emicrania in individui sensibili che soffrono di deficienza di DAO.

1.2.3 Relazione dose-risposta

Sono stati eseguiti solo pochi studi in merito all’effetto dose-risposta dovuta all’assunzione di istamina di origine alimentare; principalmente questi risultati sono derivati sia da studi su volontari che da casi clinici, tuttavia questi studi non sono stati sempre conclusivi. (18)

I volontari in buono stato di salute non hanno sviluppato sintomi con l’assunzione di 25 – 50 mg di istamina con cibo solido come pesce o bevande non alcoliche; in alcuni in cui l’istamina ha raggiunto un livello da 75 a 300 mg in pesce o bevande non alcoliche ha provocato emicrania e arrossamento. (19)

L’installazione di 120 mg di istamina a livello duodenale è stata ben tollerata da soggetti sani ma individui che soffrivano di orticaria hanno presentato sintomi come orticaria, mal di testa, tachicardia, ipotensione, nausea e diarrea. (20)

13 L’istamina è l’ammina più conosciuta e si ritrova con maggior frequenza nei prodotti ittici; dopo questi è il formaggio l’alimento più spesso responsabile di intossicazione. In particolare i focolai segnalati includono sia formaggi prodotti da materia prima cruda, sia quelli prodotti da latte pastorizzato. (21)

L’istamina è l’unica ammina biogene con limiti imposti dalla Comunità Europea nei pesci e nei prodotti della pesca perché può portare fino ad esito letale del consumatore.

Il Regolamento europeo (CE) 2073/2005 stabilisce i limiti di istamina nei prodotti della pesca.

Per le specie ittiche associate a un'elevata quantità di istidina, la quantità è compresa tra 100 mg / kg (m) e 200 mg / kg (M) (n = 9, c = 2) e per i prodotti della pesca che hanno subito un trattamento di maturazione enzimatica in salamoia, ottenuti da specie ittiche associate a un tenore elevato di istidina, la quantità è compresa tra 200 mg / kg (m) e 400 mg / kg (M) (n = 9, c = 2).

Il regolamento (CE) n. 853/20047 prevede per i prodotti della pesca la possibilità di stabilire criteri di freschezza e limiti per quanto riguarda l'istamina e affida la responsabilità agli operatori del settore alimentare per garantire che i limiti relativi all'istamina non siano superati nel contesto delle norme sanitarie per questi prodotti.

1.3 La tiramina, feniletilammina, triptamina

Queste tre ammine sono sintetizzate nell’organismo umano per decarbossilazione a partire dai loro corrispondenti amminoacidi (tirosina, feniletilammina e triptofano).

Il loro catabolismo è principalmente mediato da monoammino ossidasi (MAO) Queste AB sono importanti all’interno dell’organismo umano in quanto svolgono funzione modulatoria per il sistema nervoso, essendo strutturalmente e funzionalmente associate alle catecolammine. (22)

Per questo motivo sono stati condotti studi per provare che possano avere un ruolo in alcune patologie umane (schizofrenia, depressione, deficit di attenzione e morbo di Parkinson. (23)

14 Il meccanismo d’azione dipende dalla loro localizzazione; nel cervello svolgono azione simpaticomimetica attraverso la stimolazione del rilascio di noradrenalina, che causa vasocostrizione e ipertensione transitoria. È stato ipotizzato che la tiramina introdotta con la dieta possa causare vasodilatazione del letto vascolare mesenterico, aumentando il flusso sanguigno a livello gastrointestinale e così facilitando il loro assorbimento. Effetti diretti associati con recettori specifici sono stati riportati a livello cardiaco, causando un aumento del battito cardiaco. (24)

1.3.1 Effetti tossici

La vasocostrizione determinata da tiramina, feniletilammina e triptamina porta ad ipertensione, ma possono essere associati anche altri sintomi come cefalea, aumento della sudorazione, vomito, midriasi, ecc.

I segni clinici appaiono da 30 minuti fino a poche ore dopo l’assunzione delle ammine biogene e scompaiono di solito in poche ore, con recupero completo del paziente nelle 24 ore.

In alcune pubblicazioni scientifiche sono riportate crisi ipertensive, associate a sporadici casi di emicrania, causate dal consumo di alimento ricco di tiramina dovute in particolar modo dall’interazione fra la presenza di tiramina e inibitori di ammino ossidasi nei pazienti che assumevano farmaci specifici. (25)

La relazione dose-risposta è stata studiata in casi clinici facendo attenzione alla tossicità specifica per l’effetto vasopressorio ed è stato visto che l’assunzione orale di tiramina con la dieta può portare ad un incremento della pressione sistolica fino ad un massimo di 30 mmHg (PD30).

In un gruppo di volontari, non affetti da patologie e non sottoposti a particolari terapie mediche, è stato osservato che la barriera intestinale riesce ad evitare gli effetti tossici da parte di cibo contenente tiramina; la situazione è completamente differente negli individui che seguono una terapia con farmaci IMAO. L’alterata funzione dell’enzima da parte degli IMAO non permette il completo metabolismo della tiramina, portando ad un aumento plasmatico della stessa dopo l’ingestione di alimenti ricchi di essa. In questi casi la curva dose-risposta subisce un considerevole spostamento a sinistra abbassando il valore ED50.

15 Un importante fattore di potenziamento, da 20 a 56 nell’aumento di sensibilizzazione alla tiramina, è stato descritto nell’assunzione di farmaci appartenenti alla classe degli inibitori non selettivi delle monoaminossidasi (IMAO) di prima generazione (irreversibili e non selettivi, come tranilcipromina). I farmaci di nuova generazione hanno un livello più elevato di sicurezza in quanto la loro azione è reversibile e/o selettiva per MAO-A o MAO-B.

In questi casi l’aumento di sensibilità alla tiramina è stata riportata con un range contenuto 2-5-volte (selegiline), 5-7-volte (moclobemide), 13-volte (phenelzine) dipendente dalla dose dei MAOI. (26)

In accordo con la letteratura, 6 mg di tiramina possono provocare lievi crisi di emicrania, 10 - 25 mg gravi crisi di mal di testa con emorragia intracranica in pazienti trattatati con IMAO classici, d’altra parte pazienti trattati con i farmaci di nuova generazione, chiamati RIMA (inibitori reversibili di MAO-A), possono tollerare livelli di tiramina variabili da 50 mg fino a 150 mg. (27)

1.4 Putrescina, cadaverina e spermidina

Putrescina e cadaverina sono diammine che possono essere formate dalla biosintesi di poliammine de novo come poliammine naturali o come ammine biogene per mezzo di decarbossilazione. La formazione di putrescina negli animali e nei microrganismi richiede la presenza dell’amminoacido libero ornitina e dell’enzima ornitina decarbossilasi. In alternativa la putrescina può essere prodotta dall’arginina biotrasformata in agmantina e convertita in putrescina. (28) L’amminoacido lisina è decarbossilato dalla lisina decarbossilasi per formare la cadaverina. Durante la degradazione la putrescina e la cadaverina sono ossidate dalle diaminossidasi conducendo alla formazione di aldeidi.

1.4.1 Ruolo fisiologico

Nell’organismo umano la putrescina agisce come precursore per le poliammine fisiologiche (spermidina e spermina) e tutte sono coinvolte nella regolazione della crescita cellulare, nella divisione cellulare e nella promozione del tumore. (29)

16 La putrescina è un importante costituente cellulare di tutte le cellule dei mammiferi ed è coinvolta in tutta una serie di fasi regolatrici durante la proliferazione delle cellule sia normali che maligne.

A causa del loro alto indice proliferativo la mucosa intestinale, soprattutto a livello del colon, ha un’elevata richiesta di putrescina.

Il ruolo della cadaverina è meno conosciuto, ma potrebbe contribuire all’azione sopracitata delle diammine e poliammine.

La spermidina partecipa ai processi che avviano l’autofagia, la degradazione cellulare di molecole e organelli danneggiati, invecchiati o non necessari. L’autofagia pare coinvolta in molte patologie e potrebbe essere uno dei processi in grado di aumentare la durata della vita e rallentare l’invecchiamento. Elevati livelli di poliammine sono infatti caratteristici in cellule tumorali, tuttavia gli studi effettuati non hanno ancora evidenziato un sicuro rapporto fra il tipo e la quantità di poliammine assunte con il cibo e lo sviluppo dei tumori. (30)

1.4.2 Effetti tossici in umana

L’attività farmacologica della putrescina e della cadaverina sembra essere meno potente di quella di istamina e tiramina.

Gli effetti avversi riscontrati sono ipotensione, bradicardia, trisma e paresi delle estremità.

Tuttavia, l’effetto più rilevante conosciuto a seguito di intossicazione alimentare dovuto alla presenza di putrescina e cadaverina rimane il potenziamento della tossicità delle altre ammine biogene, specialmente l’istamina. Inoltre, è stato dimostrato che queste diammine possono reagire con nitrito formando le nitrosammine cancerogene. (31)

Gli enzimi amminici ossidanti, monoammino ossidasi e diammina ossidasi sono in grado di metabolizzare più di una ammina biogene, quindi, la degradazione delle ammine biogene alimentari viene ritardata a seconda del numero e della concentrazione. La tossicità delle ammine biogene quindi dipenderà da fattori qualitativi e quantitativi associati allo stesso alimento. Sono importanti anche i fattori legati alla sensibilità e allo stato di salute del consumatore.

17 Dagli studi effettuati in vitro e in vivo sono state sviluppate due teorie possibili riguardo al potenziamento dell’attività tossica dell’istamina.

In accordo alla teoria di inibizione competitiva, l’assunzione simultanea di altre ammine, come putrescina e cadaverina, potrebbe inibire gli enzimi impiegati nei meccanismi di detossificazione delle ammine biogene, bloccando di conseguenza il metabolismo di istamina e tiramina. Anche se il meccanismo di potenziamento sarebbe equivalente per l'istamina e la tiramina, la maggior parte degli studi pubblicati si riferisce all'istamina. In vitro nelle cavie le diammine potenziano le contrazioni dell'ileo causate dall'istamina e ne inibiscono la degradazione da parte di DAO. Nei ratti, il metabolismo dell'istamina è inibito da una somministrazione orale simultanea di cadaverina, putrescina o una miscela di ammine biogene. Un aumento della quantità di istamina non metabolizzata è visibile nei campioni di urina delle 4 ore. In presenza della miscela l'inibizione è più efficace rispetto alla singola somministrazione. Oltre a competere per gli stessi enzimi, la teoria della rottura della barriera suggerisce che i potenziatori come la putrescina e la cadaverina possano alterare la funzione di barriera fisica dell'intestino tenue e consentire la diffusione di maggiori quantità di istamina nella circolazione. (32) Studi in vitro con mucina gastrica di maiale hanno mostrato che il legame con l'istamina è diminuito da cadaverina, putrescina e da una miscela di diammine e poliammine. Questo effetto è stato riportato solo quando il rapporto fra le diammine vasoattive è 5:1 o più alto. (33)

Tuttavia, non è stato possibile stimare i livelli di putrescina e di cadaverina assunti nel cibo necessari a causare effetti acuti sulla salute dovuti al potenziamento della tossicità istaminica. (34)

Nello studio del 2012 di Elke Rauscher (35), è stata indagata l’esposizione all’assunzione di putrescina e cadaverina della popolazione austriaca in relazione al loro consumo di alimenti fermentati. Nel formaggio il livello tollerabile della putrescina è stato individuato a180 mg/kg. Questo valore è stato calcolato assumendo che il 100 % di ornitina fosse convertito in putrescina.

L'ornitina è generalmente abbondante nei formaggi. Le quantità medie vanno da 550 a 720 mg / kg nel formaggio duro Swiss. Il rilascio di ornitina libera aumenta linearmente durante i primi 5 mesi di maturazione. Pertanto, l'aumento giornaliero

18 del contenuto di ornitina può variare da 4,5 a 6,8 mg / kg. Dopo 5 mesi di maturazione, può accumularsi una quantità di 675-1.020 mg / kg di ornitina, la cui conversione completa può portare a 450-680 mg / kg di putrescina. Questi valori sono paragonabili al livello massimo misurato di 670 mg / kg nel formaggio a pasta dura.

In un altro recente sondaggio di formaggi austriaci, 3 campioni su 58 campioni hanno superato il limite proposto di 180 mg / kg.

Per quanto riguarda invece la cadaverina nel formaggio è stato calcolato un livello massimo tollerabile di 540 mg / kg. La presenza del suo precursore lisina nel formaggio è molto elevata. Nel formaggio duro svizzero, le concentrazioni medie variano da 5.120 a 6.020 mg / kg. Per conversione completa, possono essere formati fino a 3.140 mg / kg di cadaverina. Tali concentrazioni sono state trovate nel formaggio a pasta dura con 3,170 mg / kg. Formaggio erborinato, formaggio a crosta lavata, formaggio cagliato acido e formaggio duro possono contenere livelli superiori al livello massimo tollerabile proposto di 540 mg / kg. In un sondaggio su 58 campioni di formaggio austriaco proposto da Mayer, è stato trovato solo un campione con contenuto di cadaverina superiore a 540 mg / kg. (36)

19

1.5 Fattori che aumentano la sensibilità alle ammine biogene

È estremamente difficile determinare la soglia di concentrazione delle AB che comporta un effetto tossico in quanto la dose soglia dipende fortemente dall’efficienza dei meccanismi di detossificazione.

Normalmente, nell’intestino, una piccola quantità di ammine biogene viene metabolizzata in composti fisiologicamente meno attivi: questo sistema include specifici enzimi DAO.

In generale, l'aumento della sensibilità contro queste ammine è dovuto all’azione enzimatica indebolita di degradazione, causata da alterazioni genetiche o acquisite, della funzione MAO, DAO, HNMT.

È stato dimostrato che nei pazienti con ipersensibilità immuno-mediata agli allergeni ingeriti, l'attività intestinale della DAO media era significativamente inferiore rispetto agli individui sani. (37)

È stato stimato che l'1% della popolazione ha un'intolleranza all'istamina, di cui l'80% sono pazienti di mezza età di sesso femminile.

Alcuni stati fisiologici possono anche modificare la sensibilità nei confronti delle ammine biogene. Nelle donne la diminuzione premestruale dell'attività di MAO di tipo B può causare ipersensibilità a istamina e tiramina. Al contrario, un aumento fisiologico della produzione DAO (fino a 500 volte) è stato verificato nella donna incinta, il che spiegherebbe remissioni di intolleranza alimentare frequentemente osservate durante la gravidanza.

Individui con orticaria cronica, eczema atopico, problemi respiratori e coronarici, ipertensione, carenza di vitamina B6 sono particolarmente a rischio a causa della loro sensibilità alle ammine biogene. (38)

Gli individui con gastroenteropatie da intolleranza o di tipo autoimmune o con patologie neoplastiche (gastrite, sindrome dell'intestino irritabile, morbo di Crohn, neoplasie del colon-retto, stomaco e ulcere del colon) possono essere a rischio per una minore attività delle ossidasi a livello intestinale rispetto a individui sani. La sensibilità acquisita alle ammine biogene può essere transitoria e reversibile dopo l'eliminazione delle cause.

20 Gli individui che assumono farmaci inibitori dell'attività MAO o DAO possono essere più soggetti a intossicazione da ammine biogene perchè i farmaci ne prevengono l'eliminazione.

1.5.1 IMAO

IMAO è la sigla utilizzata per identificare le sostanze in grado di ridurre o bloccare l'attività delle monoaminossidasi, enzimi mitocondriali che metabolizzano per via ossidativa le monoammine. Le IMAO inibiscono sia numerose sostanze endogene come alcuni neurotrasmettitori (per es. serotonina e le catecolamine adrenalina, noradrenalina, melatonina, dopamina) sia i composti esogeni come la tiramina e alcuni farmaci.

Durante lo sviluppo di derivati di un farmaco impiegato per il trattamento della tubercolosi, l'isoniazide, idrazide dell'acido nicotinico, si è giunti alla scoperta degli IMAO. Il primo analogo dell'isoniazide sintetizzato è stato l'iproniazide. Nei pazienti affetti da tubercolosi e trattati con questo farmaco fu subito notato un miglioramento dell'umore. Tuttavia l’uso dell'iproniazide è stato vietato a causa della sua epatotossicità evidenziata alle dosi terapeutiche necessarie per ottenere sia un'azione antitubercolare, sia un'azione antidepressiva. L'azione antidepressiva dell'iproniazide, però, ha dato impulso alla ricerca di nuovi inibitori delle

monoamino ossidasi.

La classificazione delle IMAO è divisa in base alla loro origine: derivati

farmaceutici e derivati naturali; queste due classi sono a loro volta divise secondo la loro azione specifica: inibitori non selettivi MAO-a, MAO-b, inibitori selettivi delle MAO-a, inibitori selettivi delle MAO-b.

Esistono due isoenzimi MAO chiamati A e B, con differenti localizzazioni e substrati specifici.

La presenza di MAO-A è maggiore nello stomaco, intestino e placenta e ha come substrati preferiti le ammine aromatiche polari (quali noradrenalina e

octopamina). MAO-B invece predomina a livello del cervello e nelle piastrine e svolge una deaminazione selettiva su ammine aromatiche non polari come feniletilammina e dopamina.

21 La tiramina è substrato per entrambe le forme di MAO; MAO-A è responsabile per il metabolismo intestinale impedendo così il suo assorbimento sistemico. (39)

L'inibizione delle IMAO a livello del sistema nervoso centrale determina un aumento dei livelli sia intracellulari che sinaptici dei

neurotrasmettitori catecolamine e della serotonina, che svolgono un ruolo nelle patologie psichiatriche.

Il blocco può essere di due tipi: reversibile e irreversibile

 Nel primo caso i farmaci non inattivano irreversibilmente l'enzima ma ne conservano una parziale attività e possono essere rimossi da amine esogene come ad esempio la tiramina. I farmaci appartenenti a questa classe sono detti infatti inibitori reversibili delle monoaminossidasi (o RIMA) e proprio grazie a questa loro reversibilità non presentano interazioni con la tiramina o altre amine simpaticomimetiche. Fra i farmaci che ne fanno parte ci

sono toloxatone e moclobemide. I (RIMA) sono utilizzati con beneficio anche in pazienti affetti da ansia sociale (fobia sociale).

 Gli IMAO tradizionali sono quelli che causano l'inattivazione irreversibile dell'enzima che dovrà quindi essere risintetizzato nuovamente dalla cellula.

Gli IMAO vengono rapidamente assorbiti dal tratto digerente. I pazienti che assumono IMAO devono tener presente che un’appropriata inibizione delle MAO si ottiene in 5-10 giorni, a seconda del farmaco impiegato. D’altra parte la cessazione di tutti gli effetti farmacologici si verifica in circa 15-20 giorni dalla sospensione del trattamento, cioè quando tutte le MAO inattive vengono metabolizzate e rimpiazzate da nuove.

I principi attivi di farmaci IMAO che sono ancora utilizzati sono i seguenti: Tranilcipromina, Felzina, Moclobemide, isoniazide.

Come descritto per gli inibitori delle MAO, lo stesso discorso vale per gli inibitori delle DAO che portano ad una mancata metabolizzazione dell’istamina. I più comuni farmaci con principi attivi DAO-inibitori

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 mezzi di contrasto

 inibitori di pompa protonica

 miorilassanti (pancuronio)

 anestetici (tiopental), analgesici (morfina, ASA, FANS), anestetici locali (prilocaina),

 metamizolo

 cardiotonici (dopamina, dobutamina)

 antipertensivi (verapamil, alprenololo, diidrazina)

 antiaritmici (propafenone)

 diuretici (amiloride)

 antibiotici (cefuroxime, isoniazide, pentamidina, acido clavulanico, imipenem neomicina)

 clorochina

 mucolitici (ambroxolo, acetilcisteina)

 broncodilatatori (aminofillina, teofillina)

 citostatici: ciclofosfamide  antidepressivi: amitriptilina  metoclopramide  antistaminici: cimetidina  chemioterapici: pentamidina  antidiabetici: aminoguanidina  diazepam  furosemide  acemitacina  acriflavina  quinidina  d-cicloserina  aloperidolo

23 L'accumulo di prove precliniche e cliniche ha dimostrato che anche il fumo porta a una potente inibizione di entrambi i tipi (A e B) delle monoaminossidasi (MAO). I fumatori hanno attività MAOB inferiore del 30-40% e attività MAOA inferiore del 20-30% rispetto ai non fumatori. La ridotta attività delle MAO nei fumatori è stata dimostrata da misure dirette (piastrine, studi tomografici a emissione di positroni) e da misure indirette (concentrazione di cataboliti monoaminici nel plasma o CSF). (40)

La capacità degli enzimi disintossicanti (MAO, DAO, HNMT) di degradare le ammine ingerite può essere ridotto da componenti alimentari, come altre ammine, alcol e dal suo metabolita acetaldeide.

24

Capitolo 2 Il pecorino toscano DOP

Fra gli alimenti nei quali sono sviluppate le ammine biogene ci sono i formaggi ed in questo capitolo verrà preso in esame il processo produttivo del pecorino DOP toscano. I formaggi di origine ovina infatti rappresentano al giorno d’oggi una grande realtà commerciale per nazioni come: Grecia, Spagna, Francia e Italia. Per salvaguardare questa importante produzione è stato emanato il REGOLAMENTO (CE) N. 1263/96 DELLA COMMISSIONE del 1° luglio 1996 che completa l'allegato del regolamento (CE) n. 1107/96 relativo alla registrazione delle indicazioni geografiche e delle denominazioni di origine nel quadro della procedura di cui all'articolo 17 del regolamento (CEE) n. 2081/92.

I pecorini DOP riconosciuti dall’Europa sono:

- Pecorino delle Balze Volterrane - Pecorino Crotonese - Pecorino Filiano - Pecorino di Picinisco - Fiore Sardo - Pecorino Romano - Pecorino Sardo - Pecorino Siciliano - Pecorino Toscano

Secondo i dati raccolti nel 2014: il nostro paese si colloca al terzo posto a livello europeo e al quinto posto a livello mondiale per produzione di formaggio di pecora con 57.595 tonnellate rispettivamente dietro alle seguenti nazioni elencate in ordine decrescente: Grecia, Cina, Spagna, Siria. (Fonte: FAOstat)

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2.1 Storia del pecorino toscano DOP

Nel 2016 il Consorzio per la tutela del Pecorino Toscano Dop ha registrato oltre 1 milione e 500 mila di forme prodotte e 1 milione e 125 mila di forme vendute, tra tenero e stagionato, per un fatturato di circa 24,2 milioni di euro, cresciuto del 2,02% rispetto all'anno precedente. Il fatturato complessivo al consumo è stato di oltre 50 milioni di euro. Nel 2017 i 16 caseifici consorziati hanno lavorato circa 35 milioni di litri di latte con un incremento del 10 per cento negli ultimi due anni. Nel triennio 2015-2017 si è registrato un aumento costante sia sul mercato nazionale che sui mercati esteri dove il Pecorino Toscano DOP ha registrato una forte ascesa. In Europa l’export è stato incrementato del 20 per cento, a partire dalla Germania, dal Belgio, dalla Finlandia e Regno Unito. Inoltre Il Pecorino Toscano DOP si è confermato molto apprezzato negli Stati Uniti dove ha raggiunto circa il 29 per cento delle esportazioni.

L’origine del pecorino Toscano viene attribuita, secondo la tradizione, ad un prodotto tipico della provincia di Siena, dove veniva chiamato Caciofiore perché coagulato con le infiorescenze del cardo selvatico. Del formaggio toscano ne parlava già Plinio il Vecchio nella sua opera “Naturalis Historia”, citando un formaggio prodotto nella città di Luni conosciuto con il nome di “Lunense”, elogiato per la sua particolare bontà. Nel XV secolo nuovamente si hanno notizie del Pecorino Toscano citato con il nome di “cacio marzolino”, in riferimento al periodo di produzione che andava appunto da Marzo fino alla fine del periodo primaverile.

Oggi, secondo il disciplinare, viene prodotto in tutta la regione Toscana ed il latte proviene non solo dalla stessa regione, ma anche da comuni limitrofi del Lazio (Viterbo) e Umbria (Terni).

Il pecorino toscano è un formaggio ottenuto esclusivamente con latte ovino intero e può essere fresco o stagionato. Le razze utilizzate sono la Massese, autoctona, o razze importate, quali Comisana e Sarda.

È un formaggio a pasta semicotta o semidura e ha una forma cilindrica; il diametro varia dai 15 ai 22 cm e scalzo da 7 a 11 cm.

26 Il peso è compreso tra 0,75 a 3,50 kg e a fine lavorazione ogni forma deve riportare il marchio del consorzio di tutela, ad inchiostro sul formaggio a pasta tenera, a caldo sul formaggio a pasta semidura.

La crosta è liscia e nel pecorino fresco ha un colore giallo, tendente al paglierino ed una pasta bianca, al tatto denota una consistenza tenera, il gusto è dolce. Il pecorino stagionato ha invece una crosta giallo intenso ed una pasta di colore giallo paglierino, dal colore intenso; sapore fragrante, leggermente piccante.

2.2 Processo produttivo del formaggio pecorino DOP

Il pecorino toscano DOP viene prodotto seguendo la tradizione, ma con l’ausilio di tecnologie moderne.

Arrivo materia prima

Il latte proveniente dalla mungitura delle pecore viene subito lavorato, oppure viene conservato nei serbatoi frigoriferi. Viene raccolto il latte di 1 o 2 giorni e i refrigeratori aziendali contengono il latte di 4-5 mungiture. (41)

Se il latte non può essere processato entro 12 ore dall’arrivo viene conservato ad una temperatura non superiore a 4° C, fino al momento in cui viene prelevato dal casaro per la lavorazione.

Trattamento termico (eventuale)

Il latte utilizzato per la produzione di formaggio può essere utilizzato crudo, oppure dopo aver subito un trattamento termico fino alla pastorizzazione. 65-70 °C X 20-40 minuti, in caldaia a 35-38 °C.

Coagulazione

Il latte intero di pecora viene coagulato ad una temperatura di 33-38°C con caglio di vitello, eventualmente è consentita l’aggiunta di fermenti lattici autoctoni provenienti dalla ceppoteca del Consorzio Tutela Pecorino Toscano DOP. I

27 fermenti lattici inoculati sono del tipo mesofilo o termofilo, impiegati singolarmente o in combinazione. Acidità 25-40 °SH/100 – inoculo 1-2%.

Viene aggiunto caglio di vitello in polvere o liquido. Il formaggio nasce dalla coagulazione delle proteine, processo che consente al latte di passare dallo stato liquido a quello semisolido.

Il latte viene coagulato ad una temperatura compresa tra i 33° e i 38°C e la coagulazione arriva al termine in 20-25 minuti circa.

Rottura della cagliata

Quando la cagliata è pronta viene rotta in grumi la cui dimensione è variabile. Per ottenere un Pecorino Toscano DOP a pasta tenera la dimensione dei grumi è di una nocciola, in questo modo viene trattenuta una maggiore quantità di umidità. Per avere invece un formaggio a pasta semidura le dimensioni dei grumi sono quelle di un chicco di mais, permettendo così un rapido defluire del siero in eccesso.

Trattamento termico

La cagliata che verrà utilizzata per la produzione di formaggio a pasta semidura (stagionato) viene sottoposta ad un trattamento termico a 40-42°C per 10-15 minuti.

Formatura

Viene eseguita una spinatura in 5 minuti e la cagliata viene travasata negli stampi. Le operazioni di estrazione e di riempimento degli stampi possono essere meccanizzate e la miscela siero/cagliata, dopo estrazione dalla polivalente con l’aiuto di pompe è avviata al sistema di riempimento e ribaltamento degli stampi o dei “bloc moules”.

L’estrazione avviene per caduta: la cagliata, attraverso dei tubi viene ripartita negli stampi disposti su un cassone predisposto per recuperare il siero di sgrondo. Gli operatori schiacciano con le mani la cagliata all’interno degli stessi per regolarizzarne la ripartizione negli stampi.

28 Stufatura

Durante la stufatura sono mantenute la condizioni ideali per la fermentazione lattica e viene impedita la formazione anticipata della crosta che rallenterebbe lo spurgo. Le forme sono lasciate a riposare in specifici locali “camere calde” dove attraverso caldo e umidità continuano a perdere siero.

Durante questa fase i formaggi vengono sottoposti a successivi ribaltamenti (minimo 3 massimo 6) con tempi progressivamente maggiori tra un ribaltamento e l’altro.

La sineresi viene ottenuta mediante pressatura manuale oppure con stufatura a vapore per un periodo variante da 30 a 150 minuti ad una temperatura che varia fra 25-40 °C.

La scelta della temperatura è specifica per il tipo di starter impiegato e per la velocità di acidificazione desiderata. L’acidificazione della cagliata ha pH pari a 5.0 nel caso di formaggio prodotto con starter termofilo e viene completata in circa 3 ore dall’estrazione della cagliata dalla vasca polivalente. Nel caso dei formaggi teneri, il produttore di solito preferisce ricorrere al solo innesto mesofilo; in questo caso le temperature per stufare la cagliata sono coerentemente ridotte, ma la temperatura del formaggio non dovrebbe arrivare sotto i 32 °C.

Salatura

Dopo che le forme hanno riposato una notte, viene effettuata la salatura: a secco, aspergendo cioè le forme direttamente con il sale in superficie, e/o in salamoia. La salatura a secco, dove viene salata una faccia alla volta, richiede mediamente circa 32 ore.

La salatura in salamoia viene eseguita al 17-19% di cloruro di sodio.

La permanenza in salamoia, riferita a chilogrammo di peso, è di almeno 8 ore per il pecorino a pasta tenera e di almeno 12-14 ore per il pecorino a pasta semidura.

29 Stagionatura

Il periodo di maturazione del Pecorino Toscano DOP cambia in base al prodotto che si vuole ottenere: minimo 20 giorni di stagionatura per il pecorino a pasta tenera, un minimo di 4 mesi per quello stagionato

La stagionatura avviene in celle, ad una temperatura di 7-12°C e con una umidità relativa dell’80-90%; in questa fase sono sempre molto attivi i fermenti.

Fondamentale, in questo delicato passaggio finale, è il controllo di due fattori: la temperatura e l’umidità dell’ambiente nel quale il formaggio matura.

Durante il processo di maturazione viene gestito lo sviluppo di muffe e gli stagionatori periodicamente lavano e spazzolano le forme. In alcuni casi viene fatto un trattamento esterno con preparati ad azione antimuffa come per esempio natamicina o pimaricina.

Confezionamento e vendita

Alla fine della maturazione il pecorino viene talvolta trattato in crosta con olio o pomodoro. Il trattamento esterno è un processo che integra il ruolo prezioso svolto dalla crosta. L’uso di elementi naturali come olio, cenere o salsa di pomodoro, serve a proteggere ulteriormente il formaggio da contaminazioni esterne e da un’eccessiva disidratazione.

In alcuni casi può essere rivestito con sostanze plastiche ad uso alimentare per una maggiore protezione.

Le tipologie di formaggio Pecorino Toscano in commercio sono due: una a pasta tenera (prodotto

“fresco”) con un periodo di maturazione di 20 giorni e l’altra a pasta semidura (prodotto “stagionato” o “da serbo”) con un periodo di stagionatura

minima di 120 giorni.

Il prodotto finito, destinato alla vendita, ha un pH di 5,30-5,10 e il sale complessivo oscilla fra 1,3 e 2,1 %.

30 Dal disciplinare:

confezione esterna: crosta di colore giallo con varie tonalità fino al giallo carico; il colore della crosta può eventualmente dipendere dai trattamenti subiti; colore della pasta: di colore bianco leggermente paglierino per il tipo a pasta tenera, di colore leggermente paglierino o paglierino per il tipo a pasta semi dura; struttura della pasta: tenera per il tipo a pasta tenera, pasta a struttura compatta e tenace al taglio per il tipo a pasta semidura, con eventuale minuta occhiatura non regolarmente distribuita; sapore: fragrante, accentuato caratteristico delle particolari procedure di produzione; grasso sulla sostanza secca: non inferiore al 40% per il prodotto stagionato e non inferiore al 45% per il prodotto tenero. Al fine di limitare gli scarti di lavorazione, fatto salvo il rispetto dei requisiti di peso e altezza sopracitati, è ammessa, per il prodotto destinato

esclusivamente al preconfezionamento (affettamento, cubettatura,

grattugia), la produzione di Pecorino Toscano in forma diversa da quella cilindrica. (42)

Art. 9. Logotipo Marchio da apporre sulle forme o sulle confezioni di porzionato:

| mm. 50,00 |

Marchio da apporre sulle etichette: Dimensioni minime mm. 15 Può essere utilizzato nei colori sopra riportati (verde bandiera, bianco e rosso bandiera su sfondo giallo) o ad un colore.

31

2.2.1 Diagramma di flusso processo di produzione

Materie prime in entrata: latte ovino, caglio bovino, fermenti lattici, forme, sale, acqua, olio, antimuffa, salsa di pomodoro, etichetta alimentare.

latte intero di pecora Trattamento termico eventuale Coagulazione Presa 8-10’ indurimento 10-15’ Fermenti lattici Rottura cagliata Semicottura (stagionato) Spinatura 5’ Stoccaggio a T fra 0-4 °C Caglio Siero Stoccaggio in luogo fresco e asciutto Stoccaggio 12 mesi a +4°C oppure 18 mesi a -18°C Dosatura Ricostituzione Filtratura latte Filtratura latte

32 Travaso cagliata in stampi

Stufatura Riposo Salatura (salamoia-secco) Stagionatura Confezionamento Vendita Sale Acqua Olio Salsa di pomodoro Etichetta Forme Siero Stoccaggio Dosatura Dosatura Acqua Antimuffa Stoccaggio _Stoccaggio Stoccaggio Acqua

33

Capitolo 3 Le ammine biogene nei

formaggi

3.1 Studi sulle ammine biogene nei formaggi

Il formaggio è una matrice ideale per la produzione di ammine per una buona disponibilità di amminoacidi e per la presenza del cofattore piridossal fosfato. Analizzando i fattori che ne favoriscono la produzione si evidenzia la presenza di una frazione proteica elevata dal 25 al 30% del peso totale del formaggio pecorino che comprende una quota di proteina degradata (composta prevalentemente da aminoacidi liberi); questa varia in funzione del trattamento termico cui è sottoposto il latte, del grado di stagionatura del formaggio e del potere proteolitico degli enzimi endogeni del latte e di quelli esogeni appartenenti ai batteri lattici coinvolti nel processo di trasformazione e di maturazione del formaggio. La frazione proteica del pecorino Toscano DOP è ricca di aminoacidi essenziali quali la lisina, caratteristica questa che la accomuna con la frazione proteica di tutti gli alimenti di origine animale. (43)

Sono stati studiati i fattori intrinseci ed estrinseci che possono favorire lo sviluppo delle ammine biogene ponendo l’attenzione sulle condizioni igieniche in generale, sul pH, sulla concentrazione di sale, sull’Aw, sul contenuto di grassi, pastorizzazione del latte, sulla presenza dell’enzima decarbossilasi, sugli starter utilizzati, sulla temperatura di maturazione, sulla modalità di conservazione. L’azione dei batteri è fondamentale per la formazione delle ammine biogene, quindi in primo luogo sono state studiate le condizioni igieniche presenti nei caseifici, analizzando in seguito anche quali batteri potessero essere responsabili di questa reazione biochimica.

Pattono ha studiato l'effetto di diversi parametri sul contenuto di AB in formaggi prodotti sperimentalmente, focalizzando l’attenzione sul processo di

34 pastorizzazione, concludendo come quest’ultimo fosse importante nel ridurre le AB, soprattutto PUT e CAD. (44)

Anche lo studio effettuato da Novella-Rodriguez nel 2004 supporta lo stesso concetto dal momento che in formaggi di capra prodotti sperimentalmente con latte crudo si sono ottenuti livelli significativamente più alti di AB rispetto a quelli a latte pastorizzato; nei primi il contenuto di TYR è risultato fino a 30 volte superiore. Gli stessi autori però riportano anche una diminuzione del contenuto di AB nei formaggi prodotti con latte sottoposto a trattamento di omogeneizzazione ad alta pressione (100 MPa). (45)

Al contrario Martuscelli (46) ha ottenuto dati differenti studiando il contenuto di AB nel Pecorino Abruzzese prodotto da latte crudo senza l’aggiunta di coltura starter (A) e da latte pastorizzato con l’uso di starter (B). Alla fine della maturazione (dopo 60 giorni), il valore totale delle ammine biogene presenti nel formaggio del gruppo A era di 697 mg/kg e di quelle del gruppo B di 1086 mg/kg, con differenti percentuali delle singole ammine. Istamina, tiramina e putrescina erano le maggiori AB presenti nel formaggio sottoposto a maturazione del gruppo A (rispettivamente, 38 %, 26 % e 9%); d’altra parte nel gruppo B feniletilammina (28%), tiramina (23%), etilammina (15%) e putrescina (15%) erano le AB più abbondanti. La percentuale simile della tiramina trovata nei due gruppi mostra inoltre come il processo di pastorizzazione non abbia diminuito in maniera sostanziale la presenza di questa ammina nel pecorino abruzzese. Nel formaggio ottenuto dal latte crudo, il contenuto di AB ha raggiunto il suo massimo dopo 60 giorni, mentre nel formaggio del lotto B ha toccato il livello più alto dopo 30 giorni e in seguito è diminuito. I test qualitativi hanno indicato un'ampia diffusione di colture formanti AB tra i membri delle Enterobacteriaceae e dei LAB. I risultati dell'osservazione delle differenze tra i livelli di AB hanno evidenziato la necessità di migliorare le condizioni igieniche generali della produzione di formaggio pecorino abruzzese e di controllare la popolazione batterica autoctona. In pecorini sperimentali prodotti con latte crudo e senza starter oppure con latte pastorizzato e l'aggiunta di starter sono stati trovati etilammina, TYR, PUT, HIS, CAD, TRP, 2PHE,SPM e SPD. Il contenuto totale

35 medio di AB è stato di 600-700 mg/kg nel pecorino a latte crudo, dove prevalevano HIS, TYR e PUT; nel formaggio prodotto con latte pastorizzato il contenuto totale medio di AB superava i 1000 mg/kg e le ammine prevalenti erano 2PHE, TYR, etilammina e PUT.

Lanciotti ha trovato livelli significativamente più alti di AB in formaggi prodotti sperimentalmente con latte bovino e ovino sottoposto a processo termico rispetto a quelli a latte crudo. (47)

Del Signore e Di Giacomo hanno studiato l'influenza di vari fattori (tempo di stagionatura, temperatura, presenza di antimuffa sulla superficie) sul contenuto di ammine biogene e sulle caratteristiche organolettiche di formaggi pecorini. Hanno rilevato una maggiore presenza di AB nel caso di periodi di maturazione più lunghi e temperature più alte; le concentrazioni finali sono state di 112,7 mg/kg di AB totali con la quota maggiore di tiramina: 51,70 mg/kg. (48)

Ci può essere grande variabilità del contenuto di AB anche tra formaggi dello stesso tipo, come dimostrato da uno studio su 10 Pecorini di Farindola prodotti in altrettanti stabilimenti e maturati per 90 giorni dove il totale di AB trovato variava da un minimo di 209,0 mg/kg, ad un massimo di 2393 mg/kg); la tiramina era l'ammina più rappresentata, ma sono state rilevate anche PUT, CAD, etilammina, 2PHE, SPD e HIS. (49)

Gli studi effettuati sulla quantità di ammine non sempre confermano un loro aumento durante il processo di maturazione, Mercogliano et al. hanno infatti visto che nel Pecorino di Carmasciano il contenuto di tiramina e istamina era maggiore il giorno della caseificazione, rispettivamente 473,5 mg/kg di tiramina e 137,81 mg/kg di istamina, mentre dopo 201 giorni le analisi hanno rilevato 136,41 mg/kg di tiramina e 65,5 mg/kg di istamina con la spermidina che era diventata l'ammina maggiormente presente a fine stagionatura (348,4 mg/kg). (50)

Forzale et al. hanno raccolto dati sul contenuto di AB sia nella parte centrale che nel sottocrosta del formaggio “Pecorino del Parco di Migliarino – San Rossore” fino al quinto mese di stagionatura; nella porzione centrale il livello di AB era maggiore e, anche in questo caso, si è registrato un andamento in crescita nel

36 corso del tempo. Le ammine maggiormente presenti erano TYR e PUT, seguite in quantità minore da HIS e CAD. Al terzo mese di stagionatura, termine della maturazione, il contenuto totale di AB era di 591,92 mg/kg e aumentava in maniera importante arrivando al quinto mese con un totale di AB di 1578,72 mg/kg nella porzione centrale, rappresentato in maggioranza da tiramina (1300,05 mg/kg). (51)

In un altro studio di Forzale et al. sono stati analizzati 15 pecorini prelevati dal commercio, 8 a pasta molle e 7 a pasta semidura, riscontrando un'elevata variabilità nel contenuto di AB, tanto da rendere non significativa la notevole differenza tra i valori medi per le due categorie. I risultati sono stati di 307,61 mg/kg per i pecorini a pasta semidura e di 78,59 mg/kg per i pecorini a pasta molle. In generale le ammine maggiormente presenti sono state TYR e PUT seguite, in misura minore, da CAD, 2PHE, TRP e HIS. (52)

Da questi studi riportati si può dedurre come lo sviluppo delle ammine biogene non dipenda in maniera determinante soltanto dalla carica batterica generale della materia prima utilizzata, che con il trattamento termico (pastorizzazione) subisce inoltre una riduzione. Negli ultimi anni si è anche assistito ad un miglioramento delle condizioni igieniche all’interno dei caseifici; in particolare le analisi effettuate hanno avuto lo scopo di garantire un alimento sicuro al consumatore con l’assenza dei batteri potenzialmente patogeni.

Dagli studi emerge inoltre come il momento della stagionatura abbia spesso un forte effetto sul contenuto di AB nei formaggi. Durante il periodo di maturazione la proteolisi che avviene all'interno del formaggio aumenta la disponibilità di amminoacidi che sono decarbossilati dagli enzimi microbici portando alla formazione delle ammine biogene. Il prodotto stagionato presenta un indice di maturazione NCN/N totale pari a circa 25, 12 a fronte di un valore di 16.8 per il fresco. La quantità di amminoacidi liberi risulta più che triplicata nel Pecorino Toscano stagionato. (53)

37

3.2 Aspetti microbiologici

Fra i microrganismi responsabili della formazione di AB nei formaggi si possono elencare: batteri lattici starter, batteri lattici non-starter e altra microflora spontanea. In molti casi tuttavia l'accumulo di ammine è stato attribuito principalmente all'attività della microflora non starter. (6)

Linares et al. (4) che i principali produttori di AB nei formaggi siano i batteri Gram-positivi e che HIS e TYR si formino soprattutto per azione dei batteri lattici (Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus); la contaminazione, secondo questi autori, può avvenire prima, durante o dopo la lavorazione del latte, oppure è dovuta all’utilizzo di colture starter.

I batteri lattici, pur essendo meno attivi nella decarbossilazione degli amminoacidi, raggiungono un livello elevato nel formaggio durante i lunghi periodi e deve essere tenuto quindi in considerazione la loro implicazione nella produzione di AB. (54)

Schirone et al., 2011 (49) hanno ipotizzato un ruolo anche indiretto dei batteri lattici, in quanto le loro peptidasi, rilasciate anche dopo la loro lisi, potrebbero essere essenziali per fornire gli amminoacidi precursori delle ammine.

Il genere Lactobacillus è coinvolto nella produzione di istamina e putrescina, mentre solitamente non viene descritto come produttore di tiramina. Fanno eccezione i ceppi di Lactobacillus brevis e Lactobacillus casei riportati come produttori di tiramina. (55)

Un gene della tirosina decarbossilasi (tdcA) è stato identificato in 1 su 83 ceppi di Streptococcus thermophilus testati in uno studio di La Gioia et al. La sua sequenza, quasi identica a quella di un tdcA di Lactobacillus curvatus, indicava un evento di trasferimento genico orizzontale. Anche se ulteriori e dettagliati studi in merito sono necessari per approfondire la questione, gli autori ipotizzano che la presenza del gene tdcA, indotto principalmente in condizioni di scarsa disponibilità di energia, rappresenta un rischio quando la tirosina è presente nel

38 terreno, a causa dell'attività dei batteri proteolitici durante la stagionatura del formaggio, portando alla formazione di livelli critici di tiramina. (56)

In colture sia pure di ogni batterio in mezzo di laboratorio supplementato con amminoacidi, sia miste con D. hansenii in un formaggio modello è stato visto che Microbacterium foliorum, Proteus vulgaris e Psychrobacter sp. e il lievito Debaryomyces hansenii durante il processo di maturazione producono AB. Tutti questi ceppi microbici hanno prodotto almeno un’ammina biogena in terreno di laboratorio. La più alta quantità di AB è stata prodotta da P. vulgaris, nello specifico putrescina e isoamilammina. L’istamina è stata prodotta in presenza di Psychrobacter sp. mentre l’isoamilammina quando nell’ecosistema era presente P. vulgaris. I livelli massimi di AB sono stati trovati a fine maturazione. (57) Marino, studiando la capacità delle Enterobacteriaceae di produrre AB in formaggi erborinati, ha correlato la presenza di conte elevate di questi microorganismi con maggiori quantità di CAD, tanto da suggerire specificatamente questa ammina come indicatore della qualità igienica delle caseificazioni, mentre attribuiscono la presenza di altre ammine (come HIS e TYR) alla contemporanea attività di altri microorganismi. (3)

3.3 Flora microbica presente nel Pecorino Toscano DOP

Uno studio condotto da Neviani ha evidenziato come specie dominanti all’interno del pecorino DOP toscano L. lactis subsp lactis e S. thermophilus, ovvero le due principali specie acidificanti utilizzate come starter durante la produzione. (58) Questo risultato si allinea con quanto descritto riguardo la presenza di microrganismi autoctoni e caratteristici sia dell’allevamento che dell’ambiente di trasformazione del formaggio Pecorino Toscano DOP da Quigley. (59) Nel latte crudo sono state ritrovate le seguenti specie: S. thermophilus, Streptococcus macedonicus, Enterococcus feacalis, Enterococcus italicus, Lactococcus raffinolactis, Leuconostoc mesenteroides e Leuconostoc citreum. S. thermophilus è stato isolato solo dal latte di due caseifici; questo conferma quanto descritto dalla letteratura che riporta che S. thermophilus si ritrova nel latte crudo in

39 quantità assai minore rispetto alla specie L. lactis e che l’origine di questa specie sia prevalentemente l’innesto. (60)

Le specie microbiche trovate nei campioni in cagliata a fine stufatura mostrano come una parte della microflora, composta dai batteri lattici, sia stata in grado di svilupparsi, acidificando la cagliata, durante il tempo di stufatura. Alcuni di questi batteri erano già presenti nel latte crudo ed hanno resistito alla pastorizzazione, altri sono stati addizionati con l’innesto. (61)

Uno studio degli effetti di differenti modalità di conservazione sull’evoluzione del profilo microbiologico e fisico-chimico di pecorino toscano DOP a pasta tenera ha fornito risultati complessivamente in accordo con quelli presentati da Neviani; i cocchi lattici mesofili sono risultati le microflore dominanti. Gli streptococchi termofili e i lattobacilli mesofili hanno manifestato cariche analoghe rispetto a quelle riportate nei precedenti studi. Fanno eccezione i lattobacilli termofili, provenienti dallo starter, che hanno evidenziato invece valori più elevati.

I batteri lattici, i cocchi lattici dei campioni confezionati hanno avuto cariche costantemente superiori ai controlli a partire dal 60° giorno; i lattobacilli invece, sia mesofili che termofili, hanno mostrato la tendenza a rimanere costanti. (62)

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Capitolo 4 Parte sperimentale

4.1 Scopo della tesi

Lo scopo della tesi è quello di analizzare il pericolo rappresentato dalle ammine biogene nel prodotto pecorino toscano DOP.

Le ammine biogene sono un contaminante biologico verso cui la Comunità Europea è particolarmente attenta dal momento che possono rappresentare un rischio per il consumatore a causa del loro effetto tossico. Questo effetto non è facilmente monitorabile in quanto molto spesso i sintomi non sono gravi e quindi non segnalati. Dalle analisi condotte in caseifici italiani ed europei riportate in bibliografia emerge che la presenza delle ammine biogene nei formaggi è una costante; cambiano tuttavia i titoli delle singole ammine. Partendo da questa evidenza, sono stati prelevati da tre caseifici del territorio toscano dei campioni di pecorino toscano DOP stagionato in quattro tempi diversi: t1 in 2 mesi, t2 in 4 mesi, t3 in 6 mesi e t4 8 mesi. I risultati ottenuti dalle analisi sono stati poi valutati tenendo conto dei dati attualmente conosciuti sul processo di produzione del pecorino e sull’influenza di fattori intrinseci ed estrinseci che portano alla presenza delle ammine biogene nel prodotto finale.

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4.2 Materiali e metodi

Sono stati analizzati i dati ricavati da tre caseifici aderenti al consorzio dei produttori del pecorino toscano DOP. Nell’ambito della produzione ordinaria, è stato concordato con i caseifici il prelievo di campioni di pecorino toscano a lunga stagionatura. Per eseguire la campionatura è stato tenuto in considerazione la shelf life del prodotto, cioè 8 mesi.

Sono stati eseguiti campioni a 2, 4, 6 e 8 mesi di una forma di medie dimensioni di 2 kg.

Da ogni campione è stato deciso di ricavare 30 aliquote da 4 grammi con l’obbiettivo di ottenere una rappresentazione statisticamente significativa dell’intero campione.

La procedura di raccolta dei campioni di pecorino può essere schematizzata nei seguenti punti:

1. Estrazione degli analiti mediante omogeneizzazione in ambiente acido (40 ml di HCl 1 M per 4 grammi di formaggio) con mixer a lame

2. Separazione dei grassi mediante raffreddamento a -20°C

3. Centrifugazione a 4000 rpm per 10’ e raccolta dello strato acquoso

4. Filtrazione su filtro monouso in acetato di cellulosa (diametro 25 mm, porosità 0,45 µm)

L’analisi strumentale è stata eseguita mediante la metodica (RP-HPLC) Cromatografia liquida ad elevate prestazioni in fase inversa, in cui la fase stazionaria è apolare mentre l’eluente è una soluzione polare, in presenza del reagente ion pairing (ottansolfonato sodico) con derivatizzazione post colonna con o-ftalaldeide (OPA) e rivelazione spettrofluorimetrica per la la quantificazione di nove ammine biogene PHE, CAD, HIS, AGM, PUT, SPD, SPM, TRP, TYR.

Il sistema cromatografico utilizzato era composto da:

 Apparecchio HPLC Shimadzu con rivelatore spettrofluorimetrico e sistema di pompaggio a bassa pressione di tipo quaternario sfruttando

43 l’ausilio di un software per l’elaborazione dei dati cromatografici e il controllo dei parametri strumentali Class VP.

 Derivatizzatore post colonna costituito da una pompa isocratica e cella di reazione termostatata (Labservice).

 Colonna HPLC Luna C18 da 250 x 4,6 mm con particelle di granulometria 5 µm (Phenonmenex)

La Separazione cromatografica è stata condotta con la velocità di flusso 1,0 ml/min e due fasi mobili : A e B.

Fase mobile A Tampone acetato a pH 5,3 contenente Ottansolfonato sodico 5 mM

Fase mobile B Tampone acetato a pH 4,5 in rapporto con Acetonitrile (70:35). Il Gradiente di concentrazione Iniziale 80% fase A gradiente lineare in 30’ fin al 40% di fase A Rivelazione λEx = 330 nm - λEm = 465 nm

Un Volume di iniezione di 10 µl

Derivatizzazione post colonna caratterizzato dai seguenti aspetti: Flusso 0,3 ml/min

Temperatura cella di reazione 40°C