Il carcinoma ovarico rappresenta la quinta causa di morte per cancro nelle donne (126). Il suo elevato rapporto mortalità-incidenza è dovuto all'assenza di sintomi specifici e alla mancanza di strategie di screening efficaci. Attualmente, le opzioni terapeutiche includono una combinazione di chirurgia, chemioterapia e radiazioni. Tuttavia, la prognosi generale nelle pazienti con CO rimane scarsa, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni di circa il 30% (127, 128). Il trattamento con i PARPi è stato recentemente approvato per il trattamento di tumori con mutazioni BRCA1/2 (129), in quanto l'inibizione di PARP è in grado di indurre morte attraverso un meccanismo chiamato letalità sintetica nelle cellule con deficit del meccanismo di riparazione per ricombinazione omologa (HR). Tuttavia, i tassi di risposta clinica all’Olaparib (AZD-2281), un piccolo inibitore molecolare di PARP1, sono inferiori al 50% in pazienti con CO con inattivazione di BRCA1/2 confermata (130, 131). Molte pazienti sviluppano inoltre recidive locali e metastasi a distanza, spesso accompagnate da resistenza ai trattamenti di prima linea e ai PARPi (132, 133). È quindi necessaria una migliore comprensione della funzione dell'inibizione di PARP per prevedere l’efficacia clinica e stratificare le pazienti da sottoporre al trattamento. Inoltre, la comprensione dei meccanismi di resistenza ai farmaci e l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici sono necessari per migliorare la gestione clinica delle pazienti con CO al fine di introdurre nuovi protocolli clinici efficaci basati su terapie combinate.
89 In questo lavoro di tesi, in primo luogo è stato indagato l'effetto del trattamento prolungato di Olaparib in tre linee cellulari di CO, identificando diversi profili di risposta ai farmaci. L'arresto del ciclo cellulare nella fase G2/M rappresenta una risposta cellulare a vari agenti dannosi per il DNA, inclusi i PARPi, e può essere associato ad apoptosi potenziata (134-136). In questo studio è stato osservato come il trattamento con Olaparib è in grado di indurre danno al DNA e arresto del ciclo cellulare in fase G2/M in tutte le linee cellulari di CO, come mostrato nelle Figure 21 e 22, ma tali alterazioni portano all'attivazione di percorsi apoptotici solo nella linea sensibile UWB, forse a causa della persistenza del danno al DNA durante il trattamento prolungato (144 h), danno che invece viene riparato nelle cellule UWB- BRCA e SKOV3. Interessante notare che, nelle cellule UWB-BRCA, il trattamento prolungato con Olaparib induce l'attivazione dell'autofagia, un processo che può essere sovraregolato in risposta al danno al DNA, funzionando come una risposta citoprotettiva adattativa (137). In questo contesto, l'attivazione dell'autofagia potrebbe rappresentare sia un meccanismo di soppressione del tumore, attraverso cui vengono eliminate le cellule neoplastiche, sia un vantaggio selettivo per le cellule tumorali, garantendone la sopravvivenza e incrementando la resistenza ai farmaci, e quindi l'aggressività del tumore (138-140). In seguito, ho investigato se i diversi profili di sensibilità all’Olaparib fossero mediati dalla differenziale espressione di proteine. L’attenzione è stata focalizzata su NRP1, proteina nota per essere overespressa nel CO e coinvolta nella farmacoresistenza. In effetti, è stata osservata una differenza nei livelli basali di NRP1 nelle tre linee, in quanto NRP1 è espressa ad alti livelli nelle cellule resistenti (SKOV3) mentre è presente in piccole quantità nelle
90 cellule sensibili (UWB). Nelle cellule UWB-BRCA, parzialmente sensibili, NRP1 ha un livello basale basso ma viene significativamente over-espressa dopo trattamento prolungato con Olaparib, suggerendo che in queste cellule la modulazione di espressione di NRP1 è sufficiente a modificare la sensibilità al farmaco, limitando così l'effetto dell’Olaparib sulla vitalità cellulare e sull'induzione dell'apoptosi. I dati ottenuti indicano quindi che NRP1 può esercitare un ruolo fondamentale nella regolazione della resistenza delle linee cellulari di CO al PARPi. Pertanto, il blocco dell'espressione di NRP1 nelle cellule di CO potrebbe fornire una via per aumentare la sensibilità delle cellule farmacoresistenti all’Olaparib. I risultati hanno rivelato che la riduzione dell’espressione di NRP1 nelle cellule resistenti SKOV3, dopo trattamento con Olaparib, inibisce la vitalità cellulare, riduce il potenziale di formazione di colonie e induce l'apoptosi, indicando che l’assenza di NRP1 è in grado di ripristinare la sensibilità al PARPi.
Gli RNA non codificanti, compresi i miRNA, sono elementi regolatori endogeni che svolgono un ruolo chiave in eventi cellulari come la proliferazione, il differenziamento e l'apoptosi, sia in condizioni fisiologiche che patologiche (141). Nel cancro, i miRNA possono influenzare lo sviluppo del tumore, la progressione e la resistenza ai farmaci. Di conseguenza, bersagliare i miRNA oncogenici o ripristinare i miRNA oncosoppressori potrebbe rappresentare uno strumento affidabile per migliorare la terapia del cancro (142-144). Tuttavia, poiché ciascun miRNA può regolare diversi geni bersaglio e vie di segnalazione, il trattamento basato su miRNA richiede un'attenta scelta del potenziale bersaglio.
91 Diversi studi dimostrano che l'espressione aberrante dei miRNA appartenenti alla famiglia miR-200 (comprendente miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-429 e miR- 141) è coinvolta nello sviluppo del CO e nella chemioresistenza (145-147). In questo lavoro di tesi, l’attenzione è stata focalizzata su miR-200c, poiché è altamente espresso nel CO, dove contribuisce alla transizione epitelio-mesenchima, all'invasività, alla crescita tumorale e alla metastatizzazione (148). D'altra parte, la perdita di miR-200c è associata all'acquisizione di resistenza contro vari agenti chemioterapici in diversi tipi di cancro, incluso il CO (149). Ad oggi, la funzione e le basi molecolari di questo miRNA nella resistenza ai farmaci sono però ancora oggi
oggetto di studio.
Mediante siti Web di predizione online, come TargetScan e R22 v2, ho identificato NRP1 come target candidato del miR-200c. Inoltre, l'interazione tra miR-200 e il 3'UTR di NRP1 è stata precedentemente dimostrata mediante esperimenti di luciferasi e saggi Western blot (150). In linea con tali dati, questo studio ha mostrato come i livelli di espressione di miR-200c e NRP1 siano inversamente proporzionali, infatti nelle cellule tumorali di CO dove l’espressione di NRP1 è bassa, il miR-200c risulta altamente espresso. Inoltre, lo studio dimostra come la sovra-espressione di miR-200c è in grado di revertire la resistenza all’Olaparib nelle cellule di CO attraverso la modulazione dell'espressione di NRP1. Coerentemente con questi risultati, altri studi hanno riportato una correlazione tra bassa espressione di miR- 200c e resistenza al paclitaxel nel CO (151) e un ripristino della sensibilità al paclitaxel in caso di sovra-espressione di miR-200c, sia in linee cellulari tumorali resistenti alla chemioterapia (152, 153) che in un modello tumorale di xenotrapianto
92 (154). Alla luce di questi dati è possibile affermare che miR-200c rappresenta un importante punto di controllo per lo sviluppo della chemioresistenza nel CO.
I risultati ottenuti in questo lavoro suggeriscono che i tumori con ridotta espressione di NRP1 o con alta espressione di miR-200c potrebbero essere più suscettibili all'inibizione di PARP o ad altre strategie basate sulla letalità sintetica. L'efficacia dimostrata, nei modelli cellulari di CO, di questo nuovo approccio terapeutico, basato sulla down-modulazione di NRP1 attraverso la sovra-espressione di miRNA, fornisce le basi per studi su modelli preclinici in vivo. L'approccio proposto, progettato per essere somministrato in combinazione con il PARPi al fine di aumentarne l'efficacia terapeutica mantenendo la minima tossicità, ha il potenziale per definire nuovi protocolli terapeutici per la gestione clinica delle pazienti affette da CO. In conclusione, questo studio dimostra che miR-200c aumenta la sensibilità delle cellule di CO resistenti all’Olaparib modulando l’espressione di NRP1, dimostrando come l'interazione miR-200c/NRP1 possa revertire la resistenza correlata al PARPi. Inoltre, è stato dimostrato che sia l'inibizione selettiva di NRP1 sia la sovra-espressione stabile di miR-200c rappresentano un approccio promettente per migliorare l'efficacia del trattamento con Olaparib. Questi risultati forniscono inoltre dati interessanti sul profilo di risposta al PARPi nelle tre diverse linee cellulari di CO, chiarendo il ruolo del danno al DNA, dell'arresto del ciclo cellulare e dell'induzione di apoptosi/autofagia. Tali evidenze potrebbero contribuire alla progettazione di ulteriori nuove strategie terapeutiche per ottimizzare l'uso clinico del PARPi nei pazienti con CO.
93
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