DISCUSSIONI E CONCLUSION

Analizzando con attenzione i risultati ottenuti dalla prime indagini microbiologiche effettuate per la ricerca dei batteri lattici dai campioni di latte, cagliata e formaggio, si evidenziano non pochi problemi riguaardo all’isolamento di lattobacilli e lattococchi nei terreni elettivi.

Come si evidenzia nella tabella 2, il terreno M17 agar utilizzato per l’isolamento di lattococchi mesofili e termofili ha pernesso la crescita anche di batteri catalasi positivi, come i ceppi n. 13, 26, 38, 68, 201, 206 e 305. Gli stessi dopo successive analisi biochimiche sono risultati appartenere al genere Staphylococcus e per questo eliminati dai successivi steps di identificazione genotipica ai fini della ricerca.

Per quanto riguarda l’isolamento di batteri appartenenti al genere Lactobacillus il processo, come in tabella 3, si è dimostrato un po’ più complesso a causa della non idoneità del terreno MRS agar, che in molte occasioni ha permesso l’isolamento di cocchi GRAM positivi e non bacilli, successivamente identificati biochimicamente appartenenti al genere Lactococcus.

Di contro il terreno FH agar, utilizzato contemporaneamente per l’isolamento di lattobacilli, ha permesso l’isolamento di soli ceppi batterici appartenenti al genere Lactobacillus. Per questo motivo, al fine di non rallentare il proseguimento della ricerca, è stato utilizzato solo FH agar, come si evidenzia in tabella, mentre come dalla tabella 4 il terreno Kanamicine Aesculin Azide agar ha permesso di isolare solo ed esclusivamente batteri appartenenti al genere Enterococcus.

Come descritto nel capitolo precedente, l’identificazione genotipica è stata effettuata su tutti i ceppi di presunti batteri lattici caratterizzati dalle indagini biochimiche preliminari.

La tipizzazione genetica ha mostrato, come si evidenzia nella tabella 5, una certa omogeneità delle specie di lattococchi isolati dai campioni. In totale sono stato tipizzati geneticamente 147 ceppi:

- Lactococcus lactis subsp. lactis (74,5%) - Lactococcus lactis (24,6%)

- Lactococcus garvieae (7,3%)

- Lactoccus lactis subsp. cremoris (3,6%).

L’identificazione genotipica per il genere Lactobacillus ha mostrato una notevole eterogeneità di stipiti batterici isolati. In particolare i 111 ceppi tipizzati sono stati identificati come:

- Lactobacillus rhamnosus (42%) - Lactobacillus casei (25%)

- Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (25%) - Lactobacillus plantarum (3,6%)

- Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus (3,6%)

- Lactobacillus brevis (1,8%)

- Lactobacillus delbreuckii subsp. casei (1,8%)

Per il genere Enterococcus l’identificazione genotipica ha mostrato l’appartenenza della quasi totalità dei ceppi isolati alla specie Enterococcus faecium (83%) e i restanti 7 ceppi, dei 41 totali, alla specie Enterococcus faecalis (17%).

La capacità di sintesi di batteriocine dai batteri lattici è stata riscontrata solo per un ceppo dei 100 testati. In particolare lo stipite n.124 di Lactococcus lactis subsp. lactis ha evidenziato la sua attività inibente nei confronti del ceppo di Staphylococcus aureus.

La tabella 8 mostra i risultati degli aloni di inibizione del ceppo indicatore ottenuti con il metodo agar-spot test. Il tal quale della brodocoltura provoca un alone di 20 mm, mentre le diluizioni scalari danno luogo ad aloni di diametro via via inferiore, fino alla totale scomparsa nella diluizione 1/64.

Il titolo della batteriocina prodotta dal ceppo 124 di Lactococcus lactis subsp. lactis è mostrata nel grafico 1. Il risultato ottenuto è di 0,9972 AU/ml.

Il saggio dell’attività inibitoria della batteriocina con diversi enzimi proteolitici ha confermato la sua natura proteica, infatti, come mostra la tabella 13 e la foto 10, non si nota nessun alone di inibizione del ceppo indicatore, a differenza dei controlli positvi (tampone TRIS e HCl 0,02 M).

Nelle tabelle 9, 10, 11 e 12 si evidenzia il saggio dell’attività inibitoria della batteriocina a diverse concentrazioni idrogenioniche e a diverse temperature. I dati riportati mostrano come l’attività della batteriocina non subisce nessuna sostanziale variazione tra un ampio intervallo di pH e a diversi trattamenti termici. Infatti nella maggior parte dei casi si ha una lieve diminuzione del diametro degli aloni, considerando che l’alone iniziale del filtrato della brodocoltura è di 20 mm.

Dai risultati ottenuti nelle prove di caratterizzazione della batteriocina prodotta dal ceppo di Lactococcus lactis subsp. lactis, si può dedurre che la stessa appartiene a quelle del GRUPPO II, perché termostabile.

Confrontando tutti i risultati ottenuti da questa ricerca, si ritengono utili ulteriori approfondimenti, testando per la produzione di batteriocine tutti i ceppi isolati. Infatti, sebbene le specie dei lattococchi denuncino una scarsa eterogeneità, è opportuno ricordare che all’interno della stessa specie di batteri lattici esistono differenze significative in relazione alle attività espresse, infatti di tutti i Lactococcus lactis subsp. lactis testati solo uno ha espresso attività inibitoria verso lo Staphylococcus aureus.

Da quanto esposto finora si evince l’intenzione della ricerca di evidenziare batteriocine prodotte dalla microflora lattica autoctona dei formaggi tipici Siciliani. Un tale scopo deriva dalla volontà di analizzare la possibilità che il ceppo produttore possa essere utilizzato come starter autoctono, preservando le caratteristiche qualitative del prodotto nonché la possibilità di avere un’antagonista della microflora patogena.

Il risultato può dirsi essere quello sperato in quanto, tra i ceppi analizzati, è stato evidenziato Lactococcus lactis subsp. lactis che risponde alla caratteristiche richieste. La batteriocina individuata risulta infatti termostabile ed è, di conseguenza, possibile utilizzarla a diverse temperature di lavorazione: per processi produttivi a latte crudo (caciotta) o prodotti a pasta filata (caciocavallo di Palermo).

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