• Non ci sono risultati.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.2. DMAE-ALA stabilumo tyrimas

Pagal farmakokinetinius reikalavimus provaistas turi pasižymėti sta-bilumu ir maža hidrolize vaisto formoje bei greitu virsmu į vaistą fizio-loginėje terpėje. Vietinio poveikio vaisto skvarbai raginis sluoksnis sudaro daug apribojimų. Tačiau tyrimų duomenimis, daugiausiai provaistų hid-rolizei reikšmingų fermentų, esterazių, yra epidermyje ir dermoje [3, 103, 179]. Cheminio ir fermentinio stabilumo tyrimai leidžia geriausiai įvertinti provaisto tinkamumą praktiniam vartojimui [71]. Nešiklis, skirtas vaisto įterpimui, turi atitikti pH reikšmių intervalo ribas dėl keleto priežasčių: 1) siekiant išvengti odos dirginimo, nešiklio pH vertė turi būti ne mažesnė kaip 4; 2) pačios odos pH vertė yra 4,5, todėl siekiant sudaryti osmosinį gradientą, kuris spartintų vaistų skvarbą, rekomenduojama rinktis pH reikšmės, didesnės bent vienetu (t. y. pH turėtų būti bent 5,5) [74]; 3) fi-ziologinis pH pasirenkamas kaip vienas iš atskaitos taškų vietinio poveikio vaisto formos stabilumo tyrimams. Kintanti nešiklio terpės pH vertė leidžia patikrinti vaistinio preparato stabilumą.

Darbe įvertinta provaisto cheminis ir fermentinis stabilumas bei tinkamiausios nešiklio pH vertės provaisto įterpimui, kad būtų išvengta jo hidrolizės. Ištirta, kaip provaistą veikia fiziologinių skysčių pH bei odos hidrolazės. Antrajame tyrimo etape, imituojant žmogaus kūno terpėms bū-dingas sąlygas, nustatyta provaisto geba virsti į 5-ALA. DMAE-ALA stabi-lumas patikrintas nešiklyje dviejų pH reikšmių intervale [5,5; 7,4], kuris yra optimalus jontoforezei. Prieš tyrimą apibrėžta, kad provaistas bus laikomas

stabiliu, kai 2 val. laikotarpiu po provaisto įterpimo į nešiklį suskils ne daugiau kaip 10 proc. į ją įterpto provaisto [71].

Eksperimentas atliktas pagal 2.4.4 skyriuje aprašytą metodiką. Nusta-tyta, jog provaistas skyla į 5-ALA, nes susidarę 5-ALA moliniai kiekiai atitinka hidrolizavusį DMAE-ALA. Skylančio provaisto ir susidariusios 5-ALA koncentracijų priklausomybė nuo laiko dviejų skirtingų pH buferi-niuose tirpaluose pavaizduota 3.2.1 pav. a ir b. Veikliųjų medžiagų koncen-tracija mėginiuose nustatyta validuotu sutrumpintu izokratiniu UESC metodu.

Iš 3.2.1 paveikslo matyti, kad 7,4 pH vertės buferiniame tirpale DMAE-ALA visiškai virsta į 5-ALA per 70 min. Tuo tarpu 5,5 pH vertės buferiniame per 8 valandas suskilo 25,3 proc. provaisto ir susidarė 0,47 µM 5-ALA koncentracija tirpale. Tokia koncentracija turėtų susidaryti, suskilus 21,4 proc. provaisto. Atsiradusią paklaidą galima paaiškinti veikliosios medžiagos koncentracijos nustatymui naudota UESC-MS/MS metodikos paklaida bei galimu skirtingu provaisto skilimu įvairių pH verčių terpėse.

Susidariusios 5-ALA ir vietinio poveikio vaisto formoje likusios DMAE-ALA kiekiai palyginti su teoriniais šių veikliųjų medžiagų susi-darymo skaičiavimais skirtingose pH tirpaluose. Teorinis turėjusios su-sidaryti 5-ALA kiekis apskaičiuotas pagal provaisto koncentracijos suma-žėjimą tyrimo metu, ir padaryta prielaida, kad provaisto kiekis turėjo pilnai hidrolizuoti į 5-ALA ir alkoholį. Lyginant realiai susidariusius ir turėjusios susidaryti 5-ALA kiekį, gautos reikšmingai nesiskiriančios jų koncentracijos (0,01 proc. ir 3,55 proc.) 5,5 pH vertės tirpale, atitinkamai 3,43 ir 9,48 proc. koncentracijos (p > 0,05) 7,4 pH vertės tirpale.

Siekiant geriau pavaizduoti DMAE-ALA skilimą skirtingų pH reikš-mių buferiniuose tirpaluose bei nustatyti skilimo (hidrolizės) reakcijų laipsnį, skilimo pusperiodžius ir konstantas, nubraižyta vaisto likusios frak-cijos natūrinio logaritmo priklausomybė nuo skilimo laiko (3.2.1 pav. c).

Remiantis DMAE-ALA skilimo kreivėmis (3.2.1 pav.) nustatyta, kad provaisto skilimo reakcijos yra priskiriamos pirmojo laipsnio kinetikai. Pa-gal reakcijos greičio laipsnį įvertinta provaisto skilimo konstanta skirtingų pH tirpaluose (atitinkamai 3,01 (s–1), esant 7,4 pH reikšmei, bei 0,04 (s–1), esant 5,5 pH reikšmei). Pagal šiuos parametrus apskaičiuoti provaisto ski-limo pusperiodžiai skirtingo pH tirpaluose (0,23 ± 0,03 val., esant 7,4 pH reikšmei, bei 17,22 ± 0,18 val., esant 5,5 pH reikšmei). Nustatyta, kad 7,4 pH vertės tirpale visas provaistas suskiltų per 26 ± 1,8 min. DMAE-ALA 5,5 pH vertės tirpale pagal nustatytą t1/2 būtų pilnai konvertuota į 5-ALA per 34 val. ir 30 min. ± 10,8 min., t. y. skilimas vyktų beveik 80 kartų lėčiau, lyginant su 7,4 pH vertės buferiniu tirpalu. Šis tyrimas įrodo, kad provaistas

yra tinkamas vartoti žmogaus organizme. Jis fiziologinės pH vertės terpėje suskyla į 5-ALA ir esti stabilus 5,5 pH vertės tirpale.

3.2.1 pav. DMAE-ALA stabilumas ir 5-ALA susidarymas dviejų pH verčių buferiniuose tirpaluose

a) stabilumas 7,4 pH vertės tirpale; b) stabilumas 5,5 pH vertės tirpale; c) buferiniuose tirpaluose liekančio provaisto (DMAE-ALA) kiekio kitimo natūrinio logaritmo

Nustačius provaisto stabilumą 5,5 pH buferiniame tirpale, atlikti jo stabilumo tyrimai epidermyje ir dermoje. Epidermio ir provaisto mėginių tyrimai parodė odos paviršiaus ir raginio sluoksnio esterazių poveikį provaistui. Atitinkamai, provaistu paveiktos odos ir nuo jos atskirtos dermos mėginių tyrimai – odos esterazių poveikyje įvykusią provaisto hidrolizę. Abiejų etapų tyrimo rezultatai atspindi fermentinį odos aktyvumą, kadangi naudota šviežia kiaulės oda [162]. Provaisto stabilumo tyrimui epidermyje (3.2.2 pav. a) ir dermoje (3.2.2 pav. b) pasirinkta 2 val. (120 min.) ekspe-rimento trukmė darant prielaidą, kad jontoforezės ir pasyvios skvarbos eksperimentų trukmė, tiriant mėginius antrąja sistema, neviršija dviejų valandų.

Iš 3.2.2 paveikslų a ir b matyti, kad dermoje DMAE-ALA pilnai kon-vertuota į 5-ALA 110 ± 3,33 tyrimo minutę (daugiau negu pusė provaisto hidrolizuota po 30 min. nuo tyrimo pradžios). Po 120 min. nuo tyrimo pradžios santykinai nedidelis kiekis (9,3 proc.) DMAE-ALA suskaidytas į 5-ALA ir alkoholį epidermyje. Lyginant realiai susidariusios 5-ALA ir vietinio poveikio vaisto formoje likusio provaisto kiekį, teoriškai turėjusių susidaryti 5-ALA kiekį ir turėjusį skilti DMAE-ALA kiekį, gautos iki 3,06 proc. statistiškai nereikšmingos paklaidos, tiriant epidermio mėginius, atitinkamai nuo 2,66 proc. iki 7,59 proc. statistiškai nereikšmingi skirtumai, tiriant dermos mėginius.

Nubraižius odoje liekančio provaisto (DMAE-ALA) kiekio kitimo natūrinio logaritmo priklausomybę nuo laiko (3.2.2 pav. c), nustatytos pro-vaisto skilimo konstantos (t. y. 0,056 (s–1) epidermyje ir 1,62 (s–1) dermoje). Pagal šiuos parametrus apskaičiuoti provaisto skilimo ir hidrolizės pusperiodžiai epidermyje ir dermoje, atitinkamai 12,46 ± 0,52 val. ir 0,43 ± 0,03 val. Pagal skilimo pusperiodžius įvertinta, kad teoriškai epidermio esterazių poveikyje provaistas iš vietinio poveikio formos, terpės pH esant 5,5, pilnai suskiltų per 24 val. 55 min ± 31,2 min., dermoje – per 52 min. ± 1,8 min. Tai rodo, jog žmogaus organizme esterazių veikiamas provaistas sparčiai ir pilnai suskiltų į 5-ALA molekules. Provaistas, užneštas ant epidermio, sąveikoje su raginio sluoksnio lipidais ir esterazėmis skyla lėtai, todėl epidermyje ilgai išlieka provaisto molekulės dvigubas teigiamas krūvis, kuris sudaro palankias sąlygas jontoforezės vyksmui.

3.2.2 pav. Provaisto stabilumas epidermyje (a) ir dermoje (b).

Odoje liekančio provaisto (DMAE-ALA) kiekio kitimo natūrinio logaritmo priklausomybė nuo laiko (c)

3.3. ESC ir UESC metodų sąlygų optimizavimas ir validavimas

Documenti correlati