LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Vilma Armoškaitė
VIETINIO POVEIKIO VAISTO
FORMŲ
IR JONTOFOREZĖS POVEIKIO
5-
AMINOLEVULINO RŪGŠTIES
IR JOS PROVAISTO SKVARBAI
Į (PRO) ODĄ ĮVERTINIMAS
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,
farmacija (08B)
Disertacija rengta 2009–2014 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijoje ir Ženevos universitete.
Mokslinis vadovas
prof. dr. Vitalis Briedis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Me-dicinos akademija, biomeMe-dicinos mokslai, farmacija – 08B)
Konsultantė
TURINYS
SANTRUMPOS IR SUTARTINIAI ŽYMĖJIMAI ... 5
ĮVADAS... 7
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Fotodinaminė terapija ir jos taikymas ... 11
1.2. Pasyvios ir aktyvios skvarbos tyrimai ... 15
1.3. Jontoforezė ir jos taikymas ... 18
1.4. 5-ALA ir jos darinių skvarbos į (pro) odą tyrimai ... 25
2. TYRIMŲ OBJEKTAI IR METODAI ... 32
2.1. Tyrimų objektai ... 32
2.2. Reagentai ir medžiagos ... 32
2.3. Naudota aparatūra ir įrengimai ... 34
2.4. Tyrimų metodai ... 35
2.4.1. DMAE-ALA sintezė ... 35
2.4.2. DMAE-ALA sintezės, struktūros ir grynumo stebėjimo metodai ... 37
2.4.3. Odos paruošimas in vitro eksperimentams ... 38
2.4.4. Cheminio ir fermentinio provaisto stabilumo įvertinimas ... 39
2.4.5. 5-ALA ir DMAE-ALA analizė ESC ir UESC metodais ... 40
2.4.6. Vietinio poveikio vaisto formų kokybės tyrimai ... 43
2.4.7. Skvarbos į (pro) odą tyrimai ... 45
2.4.8. Statistinis duomenų vertinimas ... 48
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 49
3.1. DMAE-ALA sintezės metodo pritaikymas ... 49
3.2. DMAE-ALA stabilumo tyrimas ... 50
3.3. ESC ir UESC metodų sąlygų optimizavimas ir validavimas ... 55
3.3.1. ESC metodo 5-ALA nustatymui ir kiekybiniam įvertinimui optimizavimas ... 55
3.3.2. UESC metodo 5-ALA ir DMAE-ALA nustatymui ir kiekybiniam įvertinimui optimizavimas ... 55
3.3.3. ESC metodų validacijos parametrų įvertinimas ... 63
3.3.4. UESC metodo validacijos parametrų įvertinimas ... 68
3.3.5. ESC ir UESC metodų validavimo parametrų palyginimas ... 74
su kitais 5-ALA kiekybinio įvertinimo metodais ... 74
3.4. Nešiklių ir vietinio poveikio vaisto formų kokybės tyrimai ... 76
3.4.1. Polimerų koncentracijų parinkimas gelių gamybai ... 76
3.4.3. Skirtingos kilmės polimerinių gelių nuodžiūvio tyrimas ... 77
3.4.4. Nešiklių dinaminės klampos ir laidžio tyrimai ... 80
3.4.5. Reologiniai puskiečių vaisto formų tyrimai ... 83
3.5. 5-ALA ir provaisto pasyvios ir jontoforetinės skvarbos iš įvairių nešiklių tyrimai ... 87
3.5.1. 5-ALA pasyvi skvarba iš puskiečių vietinio poveikio ... 87
vaisto formų su begaline doze ... 87
3.5.2. 5-ALA jontoforezė ir pasyvi pernaša iš buferinio tirpalo ... 89
3.5.3. 5-ALA jontoforezė ir pasyvi pernaša iš CP, MC ir HM polimerinių gelių ... 91
3.5.4. DMAE-ALA jontoforezė ir pasyvi pernaša iš buferinio tirpalo .... 96
3.5.5. DMAE-ALA jontoforezė ir pasyvi pernaša iš CP, MC ... 98
ir HM gelių ... 98
3.5.6. Tyrimų rezultatų palyginimas su kitais tyrimais ... 101
IŠVADOS ... 106
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 108
DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 124
PRIEDAI ... 126
SANTRUMPOS IR SUTARTINIAI ŽYM
ĖJIMAI
1
H BMR protono magnetinis rezonansas
5-ALA 5-aminolevulino rūgštis (angl. 5-aminolaevulinic acid) ACN acetonitrilas
ANOVA vienfaktorinė dispersinė analizė
Anthem Nepriklausoma mėlynojo kryžiaus ir mėlynojo skydo asociacija (angl.
Independent Blue Cross and Blue shield Association)
ASCJ atmosferos slėgio cheminė jonizacija (angl. atmospheric pressure
chemical ionisation)
ASFJ atmosferos slėgio fotojonizacija (angl. atmospheric pressure
photoionisation)
BEH etilsiloksano/silikagelio hibridinis sorbentas (angl. ethylene bridged
hybrid)
Boc N-tert-butiloksikarbonilo grupė
Bu-ALA butilaminolevulinatas
CDCl3 chloroformas, turintis deuterio atomą
CP karbopolis
d dupletas
D2O vanduo, turintis 2 deuterio atomus
DMAE dimetilaminoetanolis
DMAE-ALA
2-(dimetilamino)-etil-5-amino-4-oksopentanoatas
DMSO dimetilsulfoksidas
DMSO-d6 dimetilsulfoksidas, turintis 6 deuterio atomus EM elektromigracija
EO elektroosmozė
ESC efektyvioji skysčių chromatografija
ESC-ŠSD efektyvioji skysčių chromatografija, naudojant šviesos sklaidos detektorių
EIJ elektro-išpurškiamoji jonizacija (angl. electrospray ionization) Et-ALA etilaminolevulinatas
Eur. Ph. Europos farmakopėja
FA metano rūgštis, skruzdžių rūgštis (angl. formic acid) FAP fotokatyvūs porfirinai
FDT fotodinaminė terapija
HEPES 4-(2-hidroksietil)-piperazin-1-etansulfoninė rūgštis Hex-ALA heksilaminolevulinatas
HILIC hidrofilinės sąveikos skysčių chromatografija (angl. hydrophilic
interaction liquid chromatography)
HM hipromeliozė
IR infraraudonoji spektroskopija
LoD aptikimo riba (angl. limit of detection)
LoQ nustatymo riba (angl. limit of quantitation)
LSD Fišerio mažiausiai reikšmingo skirtumo (angl. least significant
difference) kriterijus
LSHPC nedidelio pakaitingumo hidroksipropilceliuliozė LSMU Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
Ko/v pasiskirstymo sistemoje oktanolis/vanduo koeficientas m multipletas
m/z masės ir krūvio santykis MC metilceliuliozė
MES 2-(N-morfolino)-etansulfoninė rūgštis Met-ALA metilaminolevulinatas
MRM daugialypių reakcijų stebėjimas MS/MS tandeminė masių spektrometrija
MSA masės selektyvaus aptikimo režimas (angl. selected ion monitoring)
OPA o-ftalaldehidas
PBG porfobilinogenas
Phe-ALA fenilalanino ir 5-aminolevulino rūgšties dipeptidas pI izoelektrinis taškas
pKa jonizacijos konstanta
pl platus
PpIX protoporfirinas IX
PSO pasaulio sveikatos organizacija R2 determinacijos koeficientas
ROS reaktyviosios deguonies formos (angl. reactive oxygen forms) RSS liekanų kvadratų suma (angl. residual sum of squares)
S/N signalo ir bazinės linijos triukšmo santykis (angl. signal to noise
ratio)
s singletas
SSN santykinis standartinis nuokrypis
ŠSD šviesos sklaidos detektorius (angl. evaporative light scattering
detector)
t tripletas
t1/2 skilimo pusperiodis
TFA trifluoracto rūgštis (angl. trifluoroacetic acid) TIC suminė jonų srovė (angl. total ion current) TLC plonasluoksnė chromatografija
TOF skrydžio (lėkio) trukmės masių analizatorius (angl. time-of-flight
(TOF) mass spectrometer)
UESC ultra efektyvioji skysčių chromatografija
UESC-MS/MS
ultra efektyvioji skysčių chromatografija, naudojant tandeminį masių spektrometrą
ĮVADAS
Pasaulyje nuolat daugėja odos karcinoma bei ikinavikiniais dariniais, aktinine keratoze, sergančių pacientų. Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis [195], kiekvienais metais diagnozuojama 2–3 milijonai nemelanominio odos vėžio ir apytikriai 132 tūkstančiai melanomos atvejų. Nuolat ieškoma efektyvių, greitų ir novatoriškų būdų gydyti odos karcinomą bei ikinavikinius darinius. Iš jų vienas progresyviausių ir sparčiausiai besivystančių gydymo metodų – fotodinaminė terapija (FDT). FDT metu įvairūs fotosensibilizatoriai yra vartojami aktininės keratozės gydymui. Vietinio poveikio 5-aminolevulino rūgšties (5-ALA) formos gaminamos ex tempore, įterpiant ją į iš anksto paruoštus kremų ar tepalų pagrindus (pvz., „Basalis“ kremą arba „Eucerin“ losjoną), vadovaujantis gydymo įstaigų sudarytais FDT protokolais. Dėl lėtos 5-ALA skvarbos į (pro) odą reikia laukti 6–12 val., kol pasiekiama FDT taikymui reikalinga 5-ALA koncentracija odoje [25, 26].
Išskiriami trys pagrindiniai būdai veikliųjų medžiagų skvarbai iš vietinio poveikio vaisto formų į odą skatinti: 1) pernašos būdo pakeitimas (aktyvavimas); 2) kryptingas nešiklio parinkimas ir išvystymas; 3) veik-liosios medžiagos modifikavimas, sintetinant efektyvesnės skvarbos da-rinius.
Mokslinių tyrimų duomenimis, itin perspektyvus 5-ALA pernašos skatinimo būdas yra jontoforezė. Parinkus tinkamos struktūros vaistinę medžiagą ir elektros srovės stiprį, įvairių fotosensibilizatorių skvarba į (pro) odą padidėja nuo kelių iki kelių šimtų kartų, lyginant su pasyviosios skvarbos rezultatais [8, 105, 129]. Puskiečių vietinio poveikio vaisto formų pasyvioji pernaša padidėja nuo kelių iki keliasdešimt kartų, naudojant tinkamus nešiklius [117].
intensyvumui turi ir vietinio poveikio vaisto formos. Įprastai jontoforezei yra naudojami vandeniniai veikliosios medžiagos tirpalai ir geliai. Geliai dažniausiai gaminami iš polivinilkarboksilinės kilmės polimerų [124, 145]. Tuo tarpu duomenų apie vietinio poveikio vaisto formų gelifikavimui naudojamus celiuliozinius polimerus yra mažai [18]. Nuspręsta įvertinti 5-ALA darinių pernašą į (pro) odą iš skirtingos kilmės polimerinių gelių, lyginant su kitomis vietinio poveikio vaisto formomis.
Darbo tikslas – įvertinti 5-aminolevulino rūgšties ir naujo provaisto skvarbą į (pro) odą iš vietinio poveikio vaisto formų.
Uždaviniai:
1. Susintetinti naują 5-aminolevulino rūgšties provaistą, nešiklyje įgau-nantį du teigiamus krūvius; ištirti jo charakteristikas nešikliuose ir odoje.
2. Pritaikyti analitines metodikas 5-ALA ir provaisto kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui vietinio poveikio formose ir odos mėginiuose in vitro.
3. Įvertinti vietinio poveikio vaisto formų, skirtų 5-ALA ir provaisto įterpimui, charakteristikas ir jų kokybę.
4. Nustatyti 5-ALA ir provaisto pasyviąją ir jontoforetinę skvarbą į (pro) odą iš vietinio poveikio vaisto formų in vitro.
5. Įvertinti provaisto ir vaisto struktūros ir nešiklių įtaką veikliųjų me-džiagų skvarbai į (pro) odą tyrimais in vitro.
Mokslinio darbo naujumas. Atlikta naujo provaisto 2-(dimetilami-no)-etil-5-amino-4-oksopentanoato (DMAE-ALA) sintezė, ištirtos jo cha-rakteristikos. Nustatytas susintetinto provaisto stabilumas įvairių pH verčių buferiniuose vandeniniuose tirpaluose ir odos esterazių poveikyje. Atlikti du teigiamus krūvius vaisto formoje įgaunančio provaisto pernašos iš buferinių tirpalų ir celiuliozinės bei polivinilkarboksilinės kilmės polimerinių gelių į (pro) odą tyrimai in vitro. Ištirta vaisto formų, pagamintų iš celiuliozės polimerų, kokybė ir jų pasyvioji bei jontoforetinė pernaša.
Praktinė ir teorinė reikšmė. Validuoti ir optimizuoti ESC-ŠSD (efektyvioji skysčių chromatografija, naudojant šviesos sklaidos detektorių) ir UESC-MS/MS metodai patikimai, tiksliai ir atkartojamai leidžia kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti 5-ALA ir provaisto skvarbą į (pro) odą biologiniuose mėginiuose. Tokiu būdu galima įvertinti: 1) elektros srovės įtaką jonizuotų molekulių skvarbai į (pro) odą; 2) molekulės jonizacijos svarbą pasyviai ir aktyviai skvarbai į (pro) odą, naudojant elektros srovę ir nenaudojant jos; 3) vietinio poveikio vaisto formos įtaką aktyviai ir pasyviai 5-ALA ir naujai susintetinto provaisto skvarbai į (pro) odą.
Įrodytas provaisto molekulės tinkamumas pernašai į (pro) odą ir jos stabilumas skirtingas pH reikšmes turinčiuose buferiniuose tirpaluose, dermoje ir epidermyje. Nustatyti pasyviai ir aktyviai jontoforetinei skvarbai naudojamų vietinio poveikio vaisto formų pH vertės, provaisto skilimo odos fermentų poveikyje pusperiodžiai. Įrodyta didesnį krūvį jonizacijos metu įgaunančio provaisto aktyvesnė pernaša į (pro) odą, naudojant jontoforezę. Patvirtinta didesnė 5-ALA pasyvi ir aktyvi pernaša, susintetinto provaisto didesnė aktyvi pernaša iš celiuliozės polimerinių gelių, lyginant su poli-vinilkarboksilinės kilmės geliais.
Įrodyta, kad provaisto įterpimui naudojant celiuliozės polimerų pagrindu pagamintus gelius, pasiekiama didžiausia 5-ALA pernaša.
Vaisto ir provaisto skvarbos efektyvumas palygintas su LSMU akti-ninei keratozei gydyti naudojamu vietinio poveikio emulsiniu kremu. Įvertintas susintetinto provaisto pritaikymas praktikoje. Suformuluotos reko-mendacijos gydytojams veikliųjų medžiagų bei vietinio poveikio vaisto formų parinkimui pasyviajai bei jontoforetinei pernašai.
1. L
ITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Fotodinaminė terapija ir jos taikymasFotodinaminė terapija – tai gydymo metodas, pagrįstas fotosensibi-lizatorių savybe kauptis navikų audiniuose, kuriuos apšvitinus atitinkamo bangos ilgio šviesa susidariusios reaktyviojo deguonies rūšys, sukelia na-viko ląstelių nekrozę ar apoptozę [19, 111]. Fotosensibilizatoriai – tai molekulės, kurias sužadinus regimosios šviesos intervalo bangomis, vyksta fotodinaminiai procesai audiniuose.
FDT mechanizmas susideda iš trijų dalių: 1) organas ar organo dalis – taikinys yra veikiamas fotosensibilizatoriaus, kuris selektyviai prasiskverbia į pažeistą sritį, pakitus kraujagyslių laidumui dėl neįprastos fermentų aktyvacijos, pH pokyčių arba sumažėjus limfos nutekėjimui; 2) audinyje susikaupęs fotosensibilizatorius yra aktyvuojamas (sužadinamas) atitinkamo ilgio regimosios šviesos bangomis; 3) energijos pernaša iš sužadinto fotosensibilizatoriaus į deguonies atomus sukelia toksiškų ir reaktyvių deguonies radikalų (ROS) susidarymą, kurie sunaikina pažeistas naviko ląsteles [110].
Neinvazinė FDT vis plačiau taikoma dėl efektyvių gydymo rezultatų. Toksiniai produktai nesikaupia paciento organizme, todėl FDT yra pranašesnė už spindulinį gydymą. FDT efektyvumas priklauso nuo įvairių veiksnių: 1) audinyje-taikinyje susikaupusio fotosensibilizatoriaus kiekio; 2) fotosensiblizatoriaus poveikio audiniams selektyvumo, homogeniškumo ir sukeliamo fotojautrumo; 2) šviesos prasiskverbimo ir fotosensibiliza-toriaus molekulių sužadinimo gylio; 3) deguonies kiekio FDT veikiamuose audiniuose. FDT suminis poveikis priklauso nuo trijų atskirų komponentų – fotosensibilizatoriaus, šviesos ir deguonies – sąveikos [121].
1.1.1 pav. FDT mechanizmas
(fotosensibilizatoriaus sužadinimas ir poveikis) [165]
FS – fotosensibilizatorius.
Sužadintai tripletinei fotosensibilizatoriaus būklei yra būdingi dviejų tipų virsmai. Pirmo tipo virsmo metu tripletinė fotosensibilizatoriaus forma gali reaguoti su substratu (pvz., ląstelės membrana ar molekule) ir protono ar elektrono pernašos metu su deguonimi sudaryti ROS. Antrojo virsmo metu tripletinis fotosensibilizatorius savo energiją gali perduoti tiesiogiai molekuliniam deguoniui ir sudaryti sužadintą singletinę deguonies formą. Abiejų tipų reakcijos gali vykti tuo pačiu metu [194].
Dėl sužadinimo energijos pernašos susidarę laisvieji radikalai sukelia molekulių oksidaciją. Sužadinta deguonies molekulė pasižymi stipriomis oksidacinėmis savybėmis, sutrikdo ląstelių metabolizmą, sukelia ląstelių žūtį. Daugelis fotosensibilizatorių gali sudaryti abiejų tipų citotoksiniu poveikiu pasižyminčias molekules – laisvuosius radikalus ir ROS. Vyrauja nuomonė, kad ROS sąlygoja fotosensibilizatorių fototoksinį poveikį [31, 149].
Fotosensibilizatoriai pagal struktūrą ir prigimtį yra klasifikuojami į porfirinų, porfirinų prekursorių, ftalocianinų, porficenų, chlorofilų, feofor-bidų ir kitas grupes [136].
išskirtų hematoporfirinų mišiniai. Šiems mišiniams būdingas molekulių nesužadinantis šviesos absorbcijos spektras, selektyvumo trūkumas. Pa-cientams šie mišiniai sukeldavo ilgai trunkantį fotojautrumą, nepastovų veikiamų organų ir audinių atsaką į FDT [12, 121]. Vėliau susintetinta ir modifikuota įvairių porfirininių bei į porfirinus panašių fotosensibilizatorių arba provaistų.
Dermatologijoje FDT vartojamos vietinio poveikio vaisto formos. Jos parenkamos pagal vaisto skvarbą į (pro) odą, kad susidarytų terapinė kon-centracija. Vietiškai ant odos rekomenduojama vartoti puskietes vaisto formas (tepalus, gelius, pleistrus, kremus, pastas ir kt.) dėl jų tinkamos konsistencijos (vaisto formą tirpalo pavidalu sunku sukoncentruoti ant odos) bei galimybės jas modifikuoti, keičiant veikliųjų medžiagų savybes. Puskiečių vaisto formų kokybės tyrimams priskiriami tapatybės, homo-geniškumo, reologinių savybių, dalelių dydžio nustatymo, konsistencijos, vaistinių medžiagų atpalaidavimo tyrimai. Vietinio poveikio vaisto for-moms, skirtoms specifiniams pernašos būdams, pvz., jontoforezei, yra papildomai nustatomi farmakopėjoje neminimi parametrai, tokie kaip pH vertė, elektrinis laidis, drėgmės netektis, klampa ir kt. [44, 56, 96].
Puskiečių vaisto formų pH vertė yra tiriama pasyvios ir aktyvios skvarbos atveju. Pasyvios skvarbos atveju pH vertė tiriama, siekiant sudaryti odos dirglumo reikalavimus atitinkančią vaisto formą. Aktyvios skvarbos atveju, naudojami elektriniai reiškiniai ir pH vertė yra svarbus rodiklis, numatant medžiagų prasiskverbimą į (pro) odą (1.1.1 lentelė). 1.1.1 lentelėje pateikiami pasyviai ir aktyviai vaisto skvarbai rekomenduojami parametrai.
1.1.1 lentelė. Rekomendaciniai vietinio poveikio vaisto formų fizikiniai
parametrai.
Parametras Vaisto forma
pasyviai skvarbai
Vaisto forma aktyviai skvarbai (jontoforezei) Veikliosios medžiagos tirpumas vandenyje > 1 mg/ml > 1 mg/ml Lipofiliškumas 10<Ko/v<1000 – Molekulinė masė <500 Da <5000 Da
Krūvis – pKa arba pI<4 (rūgštims); >7,4 (bazėms)
Lydimosi temperatūra <200ºC –
Įsotintos formos pH pH 5–9 pH 5–9
Dozė, pernešama pro
Reologiniai tyrimai taikomi vaisto formos takumo deformacinės jėgos poveikyje vertinimui. Šių tyrimų tikslas – įvertinti medžiagų klampumą, t. y., tekėjimo gebą, paveikus tam tikra jėga. Pagal poslinkio įtempio ir greičio priklausomybę išskiriami išsiplečiantis, niutoninis, pseudoplastiškas, plastiškas ir pseudoplastiškas su ribiniu slėgiu medžiagų tekėjimo tipai. Iš jų kiekvienam priskiriamas skirtingas jį aprašantis matematinis modelis. Esant mažiems poslinkio įtempiams, puskietėms medžiagoms takumas nėra bū-dingas, t. y. nedideliu slėgiu plokštumoje veikiant medžiagą, ji patiria grižtamą deformaciją. Pasiekus ribinį poslinkio įtempį, puskietės medžiagos teka kaip skysčiai [2, 114]. Farmakopėjoje nurodyta, kad puskietės vietinio poveikio vaisto formos įprastai pasižymi viskoelastinėmis savybėmis ir yra priskiriamos neniutonėms medžiagoms, t. y. esant dideliam poslinkio grei-čiui, puskietės formos pasižymi plastinėmis, pseudoplastinėmis arba tikso-tropinėmis savybėmis. Praktiniu požiūriu, reologinis tyrimas leidžia įvertinti puskietės vaisto formos tepumą ir pasiskirstymą ant odos [154, 163].
Farmakopėjos duomenimis, nuodžiūvis yra dažniau rekomenduojamas ekstraktų, augalinių žaliavų, kietų farmacinių formų kokybės tyrimui, tačiau šis tyrimas gali būti panaudotas ir vandens pagrindu pagamintų puskiečių vaisto formų tyrimui. Galima tirti gelių masės kitimus vandens išgaravimo sąskaita, geliuose esančių polimerinių medžiagų gebėjimą sudaryti plėveles, slopinant vietinio poveikio vaisto formos masės netektį vandens pavidalu [187].
Tikslinga tirti vaisto nešiklių, kurie bus veikiami elektros srove jon-toforezės ar elektroporacijos metu, elektrinį laidį. Šis parametras padeda geriau nustatyti elektros stovės gebą plisti nešiklyje ir aktyvuoti veikliąją medžiagą. Tai leidžia daryti prielaidas apie molekulių judrį vaisto formoje bei joje esančių pašalinių jonų poveikį [109, 130].
Vaisto molekulės skvarbą lemia barjerinė raginio sluoksnio funkcija, puskietės vaisto formos kilmė, lipofiliškumas bei veikliųjų medžiagų geba išsilaisvinti iš nešiklio. Tam, kad veikliosios medžiagos molekulės geriau skverbtųsi iš vietinio poveikio vaisto formų, jos turi turėti polinkį „išsi-laisvinti“ iš nešiklio ir pereiti į odą. Todėl pasyvios vaisto skvarbos tyrimų atveju hidrofilinės molekulės nėra talpinamos į stipriomis hidrofilinėmis savybėmis pasižyminčius nešiklius, kur jos tiesiog ištirpsta ir neprasi-skverbia į lipofilinę raginio sluoksnio aplinką. Lipofilinių molekulių atveju veikliąsias medžiagas stengiamasi įterpti į mažiau lipofilinius nešiklius.
Nežiūrint įvardintų vaisto molekulių skvarbos ir jo nešiklių skirtin-giems jų pernašos ir gydymo būdams kriterijų, trūksta tyrimų duomenų apie vietinio poveikio vaisto formų parinkimą. Dažnai teorinis ir praktinis vaisto formų parinkimas Lietuvos ir kitų šalių gydymo įstaigose yra empirinis, mažai standartizuotas. Taigi disertacijoje ištirti ir aprašyti vietinio poveikio 5-ALA formų parinkimo metodai ir jų praktinis pritaikymas.
Praktikoje FDT yra taikoma gydyti aknei, aktininei keratozei, psoria-zei, paviršinei odos karcinomai, burnos leukoplakijai, gimdos kaklelio vėžiui, kepenų, smegenų ir prostatos navikams [36, 41, 189, 196].
1.2. Pasyvios ir aktyvios skvarbos tyrimai
Odos barjerinę funkciją nulemia kelių mikronų storio raginis epi-dermio sluoksnis. Tai yra keratinu užpildytų korneocitų (diferencijuotų keratinocitų) sluoksnis, sutvirtintas lipofiline matrica [87, 171]. Ši kor-neocitų ir lipidų sąveikoje susidariusi membrana dėl struktūrinių ypatybių pasižymi itin stipriomis lipofilinėmis savybėmis. Todėl hidrofilinėmis savy-bėmis pasižyminčių molekulių geba skverbtis į arba pro ją yra apie tūkstantį kartų mažesnė, lyginant su lipofilinio pobūdžio molekulėmis [150, 160, 177].
Pasyvi vaisto molekulių skvarba vyksta difuzijos principu ir priklauso nuo vaisto tirpumo nešiklyje ir membranoje bei koncentracijos gradiento [13, 128]. Pasyvios skvarbos metu lengviausiai per raginį epidermio sluoks-nį prasiskverbia stipriomis lipofilinėmis savybėmis pasižymintys junginiai. Pasyvi skvarba gali būti skatinama, keičiant pasiskirstymo koeficientą tarp odos raginio sluoksnio (membranos) ir vietinio poveikio vaisto formos, didinant vaistinės medžiagos koncentraciją, keičiant vaisto molekulės struktūrą ir formą, pritaikant nešiklius, įterpiant vaisto skvarbos skatintojų [101, 174], sudarant eutektines sistemas [13, 22, 131].
Aktyvi vaisto molekulių skvarba yra pagrįsta išorinės energijos po-veikiu ir priemonių, skirtų barjerinei odos funkcijai mažinti, keičiant epi-dermio raginio sluoksnio fiziologines savybes, taikymu. Molekulių skvarbą per raginį sluoksnį didina elektros energijos pritaikymas (elektroporacija ar jontoforezė), ultragarsas (sonoforezė ar fonoforezė), odos apdorojimas lazeriu, fotomechaninėmis ar magnetinėmis bangomis, radiodažniais, tem-peratūra, mikroadatomis, abrazija ir kt. [13, 22, 127, 131].
pernašos greitį. Vaisto molekulės skvarbą apibūdina Fiko difuzijos lygtis, kuri gali būti išreiškiama keliais būdais [67, 144]:
c K c h A K D dt dQ Js ×∆ = p× × × = = (1),
kur Js – veikliosios medžiagos srautas, esant pusiausvyros sąlygoms, Q – per odą prasiskverbusio vaisto kiekis, t – skvarbos tyrimo trukmė, D – vaisto difuzijos koeficientas h storio raginiame sluoksnyje, A – membranos (odos) plotas, K – vaisto pasiskirstymo tarp odos raginio sluoksnio ir ne-šiklio koeficientas, Δc – vaisto koncentracijos gradientas abipus raginio sluoksnio, c – vaisto, ištirpinto nešiklyje, koncentracija, Kp – vaisto skvarbos pro odą koeficientas, priklausantis nuo vaisto nešiklio.
Ši lygtis rodo, kad didesnė molekulių skvarba pasiekiama didinant membranos (odos raginio sluoksnio) plotą bei mažinant jos storį. Pagal formulėje nurodytus sąryšius, teoriškai nustatyta, kad pasyvi medžiagų skvarba į (pro) odą gali būti didinama, gerinant vaisto difuziją ir vaistinės medžiagos pasiskirstymą raginiame sluoksnyje. Vaisto koncentracija ir vaisto įsotinimo laipsnis vietinio poveikio vaisto formoje ar nešiklyje yra parametrai, kurie gali būti keičiami, siekiant padidinti vaisto skvarbos į (pro) odą srautą. Daugeliu atvejų vaisto koncentracijos didinimas teigiamai veikia veikliųjų medžiagų skvarbą tik iki plato fazės. Tai rodo, kad barjerinis odos sluoksnis yra mažai paveikiamas difuzijos gradientų. Ši savybė riboja medžiagų pernašą į (pro) odą. Ypač tai akivaizdu tais atvejais, kai koncentracijos gradientas yra pagrindinė vaisto pernašą į (pro) odą sąlygojanti jėga. Koncentracijos gradientą taip pat veikia vaisto geba pasiskirstyti odoje ir prasiskverbti į gilesnius audinius (Kp koeficientas) [180, 183]. Pasiskirstymo koeficientas sistemoje oktanolis–vanduo (Ko/v) taip pat yra naudojamas nustatyti molekulių pasiskirstymą raginiame odos sluoksnyje. Kp su Ko/v gali būti susiejamas tokia lygtimi: Kp = Ko0,/ v74 [65,
Molekulių skvarba taip pat priklauso nuo molekulinės tiriamosios medžiagos masės ir dydžio. Didžiausias molekulių srautas pro odą eksponentiškai mažėja, didėjant molekulinei medžiagos masei. Medžiagos, kurios molekulinė masė yra didesnė kaip 500 Da [151], praktiškai neprasiskverbia pro žmogaus odą ar jos analogus [91]. Tuo tarpu 50–100 Da dydžio molekulėms prireikia 0,5–1 val. pusiausvyrinei būsenai pasiekti. Pasyvi jonizuotų molekulių skvarba pro odą yra nedidelė. Pasyviu būdu nejonizuotos molekulės skverbiasi dešimt ir daugiau kartų greičiau nei jonizuotos molekulės. Nustatyta, kad hidrofilinėmis savybėmis pasižy-minčių molekulių jonizuotų ir nejonizuotų formų prasiskverbimo pro odą greitis panašus, o lipofilinių medžiagų skirtingų formų jis skiriasi [91, 182]. Kai kuriais atvejais tiriamosios medžiagos difuzijos greitis keičiasi dėl polinės sąveikos tarp viduląstelinių odos ląstelių lipidų ir vandenilinių ryšių, susidarančių veikliosios medžiagos funkcinių grupių sąveikos metu [46]. Tiriamųjų molekulių struktūroje esantis vandenilį prijungiančių grupių skaičius mažina molekulių pasyvią skvarbą į (pro) odą. Molekulėje pridėjus vieną vandenilį prijungiančią grupę, difuzijos koeficientas sumažėja apie 10 kartų [72]. Vaistinių medžiagų molekulės, kurios jungiasi su raginiame odos sluoksnyje esančiomis struktūromis (pvz., baltymais), taip pat lėčiau skver-biasi pro odą. Šiai grupei priskiriamos molekulės, turinčios sunkiųjų metalų jonų (pvz., Ag+
, Cd2+, Hg2+), amonio jonų, heterociklų, dietanolaminų, chininų, rūgštinių chloridų ir kt. [91, 182].
Teoriniu atžvilgiu, norint pasiekti didžiausią vaisto molekulių srautą pro odą, vaisto forma turi būti įsotinta vaistine medžiaga. Tai pasiekiama didinant veikliosios medžiagos koncentraciją arba mažinant jos tirpumą nešiklyje [128]. Tai pasiekiama tuo atveju, kai vietinio poveikio vaisto forma yra suspensija. Joje ištirpusi vaistinė medžiagos dalis yra pusiau-svyroje su suspenduota medžiagos dalimi. Tačiau vaisto forma – suspensi-ja – įprastai praktikoje nenaudojama dėl mažo fizikinio ir cheminio sta-bilumo, konservanto būtinybės, vietinio dirginimo. Vaistinės medžiagos įsotinimas farmacinėje formoje atliekamas išgarinus tirpiklį ar lakiąsias, pagalbines medžiagas, skatinant vandens skvarbą iš odos į vietinio poveikio vaisto formą [13, 137].
Fizinės veikliųjų medžiagų savybės, tokios kaip lydymosi temperatūra, taip pat lemia medžiagų skvarbos greitį į (pro) odą. Medžiagos, kurių ly-dymosi temperatūra yra sąlyginai žema (ne didesnė kaip 200 °C), geriau tirpsta lipofiliniame raginiame sluoksnyje ir greičiau pasyviai difunduoja pro odą [14, 131, 142].
lauke įgaunančių to paties vaisto darinių pernašos skirtumus. Tokios per-našos palyginimo rezultatai, nustatyti šiame darbe, padės pasirinkti tinka-miausią vaisto molekulinę sandarą veiksmingesnei jo pernašai į (pro) odą.
1.3. Jontoforezė ir jos taikymas
Vietinio poveikio vaisto pasyvi skvarba į (pro) odą ne visada perneša pakankamą vaistinės medžiagos kiekį, kad susidarytų terapinė vaisto koncentracija organo audinyje-taikinyje. Vienas efektyviausių būdų skatinti jonizuotų molekulių skvarbą yra jontoforezė [176]. Tai yra neinvazinio pobūdžio vaistų skvarbos didinimo pro odą metodas, kurio metu vaistų skvarbos skatinimui yra naudojama silpno intensyvumo (≤ 500 µA/cm2
) elektros srovė [152, 169]. Baterijos ar kitokio elektros šaltinio sugeneruota srovė yra perduodama vaisto molekulėms per elektrolitinį tirpalą (ar kitokia elektros srovei laidžia terpe), naudojant teigiamo ir neigiamo elektrodų sistemą (t. y. anodą ir katodą) [20, 42]. Tekant elektros srovei tokia sistema, tirpale esantys katijonai, veikiami anodo, juda katodo link. Tuo tarpu anijonai, esantys katode, juda priešinga kryptimi. Kiekviena jonizuota molekulė geba transportuoti elektros srovės dalį, kuri yra aprašoma jonų pernašos greičiu. Jeigu jonas sugeba pro odą transportuoti 100 proc. nau-dojamos elektros srovės, tai jono pernašos greitis yra lygus 1,0 [129].
Siekiant optimizuoti tiriamo vaisto joninės formos jontoforetinę pernašą, būtina tam pritaikyti vaisto formą ir jontoforezės prietaisą. Vaisto pernašos į (pro) odą greitis priklauso nuo šio prietaiso parametrų (elektros srovės, naudojamos vaisto pernašai, tankio ir poliškumo, elektrodų tipo) ir vietinio poveikio vaisto formos ypatybių (ją sudarančių medžiagų pri-gimties, vaisto koncentracijos, konkurencinių vietinio poveikio vaisto formoje esančių jonų koncentracijos, pH ir joninės jėgos) [1, 32, 173].
Pagrindiniai jontoforezės naudojimo tikslai yra du: 1) padidinti polinių ir besijonizuojančių bei didelės molekulinės masės vaistų pernašą [40, 47, 83, 99]; 2) geriau kontroliuoti prasiskverbiančias vaistinių medžiagų dozes ir jų suderinamumą su paciento organizmu (pvz., fentanilio atveju) [10, 153].
srovė ir ant elektrodų vykstančios elektrocheminės reakcijos neturi keisti vaistinės medžiagos savybių [181].
1.3.1 pav. Jontoforezės, naudojant Ag/AgCl elektrodų sistemą, schema [86]
V+ – teigiamas vaistinės medžiagos katijonas, A– – vaistinės medžiagos priešjonis, EM – elektromigracija, EO – elektroosmozė.
Kaip pavaizduota 1.3.1 pav., anodo kameroje yra talpinamas jo-nizuotas vaistas kartu su savo priešjoniu ir NaCl. Elektros potencialas sukelia elektros srovės tekėjimą grandine. Elektrodo ir vaisto formos sąlytyje Ag+
ir Cl– jonai reaguoja tarpusavyje ir nusėda ant anodo netirpių AgCl nuosėdų pavidalu. Tuo pačiu metu sidabro elektrodas atpalaiduoja elektroną į elektros grandine tekančią elektros srovę (1 elektrocheminė lygtis).
Ag0 + Cl–→ AgCl +e–(anodas) (1 elektrocheminė lygtis) Elektromigracijos metu vyksta katijonų pernaša (įskaitant ir teigiamai jonizuotą vaisto molekulę iš anodo kameros) į odą. Tuo pačiu metu endogeniniai anijonai (dažniausiai Cl–jonai) juda į anodo kamerą. Cl– jonai
Nuolatinės elektros srovės šaltinis
Anodas (+) Katodas (–)
ODA
Elektroosmozė (EO), kai pH>pI
Elektromigracija (EM)
V+
↓
yra atpalaiduojami iš elektrodo į katodo kamerą, todėl, siekiant elekt-roneutralumo, reikia, kad anijonas būtų pašalintas iš katodo kameros arba iš odos į elektrodo kamerą pereitų katijonas. Katode (AgCl elektrode), sidabro chloridas yra redukuojamas tuo metu, kai elektrodą pasiekia elektronas, atsipalaidavęs Ag anodo oksidacijos metu. Ant elektrodo atsiranda sidabras ir padengia elektrodą. Tuo pat metu į tirpalą atpalaiduodami Cl–
jonai (2 elektrocheminė lygtis). Elektroneutralumas yra išlaikomas katijono migracija iš odos arba anijono pasišalinimu iš elektrolito tirpalo ir perėjimu į odą [35, 69, 86].
AgCl + e–→ Ag0 +Cl–(katodas) (2 elektrocheminė lygtis) Elektros grandinę užbaigia neorganiniai odos jonai, įprastai Na+
ir Cl– [49]. Šie jonai gali trukdyti efektyviai vaisto pernašai dėl konkurencijos su veikliųjų medžiagų molekulėmis dėl elektros srovės, pernešančios jonus ir jonizuotas molekules [184].
Du pagrindiniai jontoforezės veikimo mechanizmai yra elektromig-racija ir elektroosmozė. Bendras jontoforezės intensyvumas priklauso nuo šių dviejų procesų suminio efekto [1, 68, 139].
Elektromigracija – tai tvarkingas jonų judėjimas, veikiant elektros srovei; jono elektromigracijos srautas (x) yra tiesiogiai proporcingas elektros srovei (ix): x x ER X i AF z J = 1 (2),
kur JERx nurodo tam tikro jono (x) elektromigracinę pernašą, A – pernašai naudojamas membranos ar odos plotas, zx – jono (x) krūvis, F – Faradėjaus konstanta (96500 C/mol).
Jonų srautas yra susijęs su jono (x) judriu ir priklauso nuo naudojamos srovės stiprio (amperais) ir jono pernašos (transporto) indekso (tx, kur 0<tx<1). I t AF z J x x ER X 1 = (3),
kur tx – pernašos indeksas, I – elektros srovės stipris.
skvarba į (pro) odą [44, 129]. Elektromigracijos srautas priklauso nuo jonų judrio ir koncentracijos. Todėl konkuruojančių molekulių, kurioms būdingas didelis judris, koncentracijos padidėjimas, sumažina vaisto srautą ir vaisto skvarbą į odą. Procesas yra priešingas tuo atveju, jeigu jonams yra būdingas mažas judris [95, 132, 135].
Idealiomis sąlygomis yra vykdoma vieno jono jontoforezė (t. y. vieno jonizuoto vaisto skvarba yra skatintina jontoforeze). Tokiu atveju jonizuota vaisto molekulė konkuruoja tik su endogeniniais priešjoniais. Praktikoje tokia situacija pasitaiko retai, kadangi į vietinio poveikio vaisto formas dažnai įterpiama buferinių medžiagų, klampos modifikatorių ir konservantų, kurie gali sumažinti pernašos efektyvumą [172]. Naudojant Ag/AgCl elektrodus, juose vykstančios elektrocheminės reakcijos priklauso nuo Cl– jonų (1 elektrocheminė lygtis ir 1.3.1 pav.). Todėl pageidautina, kad vietinio poveikio vaisto formose būtų įterpta chlorido jonų, kurie palaiko nuolatinės elektros srovės tekėjimą.
Antrasis mechanizmas, kuris yra sudedamoji jontoforezės metu prasiskverbusių medžiagų srauto dalis, yra elektroosmozė. Elektroosmozė – tai tirpiklio ir krūvių judėjimas, susidarantis elektrinio potencialo ant odos poveikyje. Terminas „elektroosmozė“ įvardija reiškinį, kai, veikiant elektros srovei odą, fiziologinėmis sąlygomis pro raginį epidermio sluoksnį lengviau skverbiasi Na+, o ne Cl– jonai dėl jo selektyvumo katijonams [5, 100]. Odos izoelektrinis taškas yra lygus apytikriai 4,0–4,5 vertei. Esant didesnei pH reikšmei, aminorūgščių karboksilo- grupės, esančios odos paviršiuje, yra jonizuojamos. Taigi esant fiziologiniam pH, odos krūvis yra neigiamas [125], todėl katijonų pernaša yra intensyvesnė už anijonų pernašą. Dėl šios priežasties, naudojant vietinio poveikio vaisto formą, kurios pH yra 7,4, Na+ jonų pernaša yra dvigubai intensyvesnė už Cl– jonų pernašą [24]. Praktinė elektroosmozės reikšmė – fiziologinėmis sąlygomis katijonų pernaša į (pro) odą yra skatinama, o anijonų pernaša – stabdoma [69]. Dėl elektoosmozės neutralios molekulės fiziologinėmis sąlygomis yra pernešamos į odą [70].
Anksčiau manyta, kad jontoferezės metu vykstanti elektroosmozė yra vienintelis mechanizmas makromolekulių (t. y. molekulių, kurių molekulinė masė didesnė kaip 1 kDa) į (pro) odą pernašai, ir ji nepriklauso nuo molekulinės masės [73]. Vis dėlto nustatyta, jog elektromigracijos metu molekulių pernaša priklauso nuo pro odą pernešamų medžiagų molekulinės masės. Jos didėjimas lėtina molekulės pernašą į (pro) odą. Tačiau neseni jontoforetiniai tyrimai su peptidais ir makromolekulėmis parodė, kad priklausomybė tarp medžiagos molekulinės masės ir jos pernašos į (pro) odą greičio ne visada yra tiesinė [59, 72].
1. Vietinio poveikio vaisto forma [88]. Elektros srovės laidis yra svarbiausias parametras jontoforetinės vietinio poveikio vaisto formos parinkimui. Dažniausi vaisto nešikliai naudojami jontoforezei – tirpalai arba hidrofiliniai elektrolitiniai geliai. Hidrogeliai dažniau pasirenkami prak-tiniais sumetimais, kadangi jie nenuteka (skirtingai nuo vandeninių tirpalų) [80, 157].
Geliai yra gaminami iš keleto tipų skirtingų polimerų. Vieni tokių – polivinilkarboksilinių polimerų grupė. Iš jų pagamintiems geliams būdingos anijoninės savybės. Jų pranašumai kitų polimerinių gelių atžvilgiu yra aktyviai pernašai į (pro) odą tinkamos reologinės savybės, inertiškumas fiziologinėmis sąlygomis, netoksiškumas ir terminis stabilumas [124, 125, 159]. Tokie geliai veikia kaip buferis, kuris palaiko pH vertes nuo 5 iki 7 ir nesukelia odos dirginimo. Jų trūkumai jontoforentinei vaisto pernašai į (pro) odą – šie geliai gali reaguoti su teigiamai jonizuotais vaistais ir konkuruoti su vaistu dėl elektros srovės poveikio [5].
Nejoniniai hidrofiliniai polimerai (įprastai celiuliozinės kilmės) yra tinkami jontoforetinių gelių formavimui. Šių gelių gebėjimas ištirpinti įvairius jonizuotus vaistus (net ir teigiamai jonizuotus) nepriklauso nuo kitų jonų buvimo vietinio poveikio vaisto formoje [178].
Polimeras nešiklio sudarymui parenkamas pagal jo suderinamumą su vaistine veikliąja medžiaga. Būtinai reikia įvertinti vaistinės medžiagos jonizaciją nešiklyje ir vaisto molekulių sąveiką su gelio polimeru. Įver-tinama vaisto nešiklio – pagrindo dinaminė klampa, kadangi įprastai ji yra atvirkščiai proporcinga jono judriui ir polinkiui migruoti į (pro) odą. Didelė klampa stabdo vaisto skvarbą į (pro) odą (nors gali ir padėti kontroliuoti itin skvarbių molekulių pernašą, kai vaistinė medžiaga atpalaiduojama „porci-jomis“) [140, 141]. Didelė nešiklio klampa yra trikdis greitam elektros srovės perdavimui. Siekiant didesnės vaisto skvarbos į (pro) odą, naudojama aukštesnė įtampa, kuri gali suketi „elektros šoko“ pojūtį pacientui. Dėl to didelės klampos puskietės vaisto formos nėra tinkamos jontoforezei [155, 156].
2. Vaisto koncentracija. Vaisto koncentracijos vietinio poveikio vaisto formoje ir jo skvarbos į (pro) odą sąsajos yra intensyviai tiriamos [32, 63, 64]. Šiame skyriuje paminėtos 2 ir 3 lygtys rodo, kad teoriškai vaisto skvarba į (pro) odą turėtų didėti, didėjant vaisto koncentracijai nešiklyje. Praktiškai ši teorija ne visada pasitvirtina. Vaisto skvarbą į (pro) odą veikia ir kiti parametrai – konkuruojantys jonai, fizinės ir cheminės vaisto savybės ir jo polinkis reaguoti su įvairiomis odos audinio struktūromis [86].
jonų. Jonizuoto vaisto pernaša į (pro) odą didėja, nešiklyje esant mažo judrio konkurenciniams jonams, o mažėja, esant didelio judrio konkuren-ciniams jonams [115, 143].
Vaistams, kurių pagrindinis mechanizmas, skatinantis jontoforetinę skvarbą, yra elektroosmozė (pvz., katijoninės molekulės su ilga lipofiline grandine), koreliaciją tarp vaisto koncentracijos ir skvarbos į (pro) odą dar sunkiau nustatyti. Vaistinės medžiagos koncentracijos padidinimas gali sumažinti į odą prasiskverbusio vaisto kiekį. Taip gali įvykti dėl vaisto gebėjimo sumažinti, neutralizuoti arba pakeisti odos krūvį. Vaistas gali sudaryti teigiamą odos paviršiaus krūvį, kuris yra priešingas įprastam fiziologiniam neigiamam odos krūviui, todėl pakinta vaisto skvarbos į (pro) odą kinetika [164].
3. Nešiklio pH vertė. Jontoforezės metu nešiklyje krūvį įgaunantys vaistai turi būti dedami į skyrių su tą patį krūvį kaip ir vaistas turinčiu elektrodu (t. y. teigiamai jonizuoti vaistai yra derinami su anodu, o nei-giamai jonizuoti vaistai – su katodu). Nešiklyje nejonizuotų vaistų pernaša yra skatinama teigiamu elektrodu, kuris stiprina elektroosmozės poveikį [52, 140].
Vaisto formos pH vertė gali nulemti elektroosmotinę vaisto pernašą į (pro) odą bei vaisto jonizacijos laipsnį (taip reguliuojamas elektromigracijos indėlis į bendrą vaisto pernašos srautą). Padidėjus vaisto formos pH, vais-tas – silpna bazė jonizuojasi mažiau; dėl to sumažėja ir vaisto elektro-migracijos potencialas. Jei vietinio poveikio vaisto forma turi didesnes pH reikšmes (6,5–7), elektroosmozė veikia stipriau už elektromigraciją, nes oda yra pilnai jonizuota [132]. Elektromigracija ir elektroosmozė yra viena kitai priešingos jėgos ir priklauso nuo fizikocheminių vaistinių medžiagų savybių.
Tiriant nešiklio pH įtaką 5-ALA skvarbai pro odą, pastebėta, kad, esant pH 7,4 reikšmei, jos pernaša vyksta tik dėl elektroosmozės. 5-ALA yra izolelektrinėje būsenoje ir neturi elektromigracijai būtino krūvio. Mažinant donorinės vaisto formos pH vertę, 5-ALA katijoninės formos dalis ženkliai padidėja, tačiau vaisto skvarba į (pro) odą mažai pakinta, nes, in-tensyvėjant elektromigracijai, mažėja elektroosmozė. Šiuo atveju elektro-osmozės sumažėjimas aiškinamas neigiamo fiziologinio odos krūvio pra-radimu [106]. Tyrimų duomenimis, nustatyta atvejų, kai sumažėjus vaisto jonizacijai (pvz., leuprolidas) bendra jo pernaša pro odą padidėja dėl in-tensyvesnės elektromigracijos [95].
molekulės jonizacijos laipsnį (šis parametras yra atsakingas už migraciją); 2) odos jonizaciją (šis parametras yra atsakingas už elektro-osmozę); 3) jontoforezės proceso aplinką, priešjonius ir vietinio poveikio vaisto formoje esančius kitus jonus.
Iki šiol nėra priimtų standartizuotų protokolų ir gairių, kaip naudoti jontoforezės aparatūrą, vykdant eksperimentus [6]. Įprastai jontoforetinė sistema yra sudaryta iš celių, elektrodų, maitinimo šaltinio, elektroche-minėms reakcijoms skirtų skyrių ir kai kuriais atvejais – termostato bei druskos tiltelių. Jontoforezei naudojamos standartinės arba modifikuotos Franz’o celės [11, 134]. Elektrocheminiai reakcijų skyriai anodinės pernašos metu užpildomi 0,9 proc. arba didesnės koncentracijos NaCl tirpalu. Tai padeda lengviau vykti anodinei jontoforezei, nes išvengiama elektroforezės metu susidarančių Cl2 ir H2dujų. Vaisto formoje neatsiranda burbulų, kurie trukdo medžiagos pernašai pro odą, mažina konkurencinių katijonų susidarymą donorinėje fazėje [7, 37]. Tyrimų metu rekomenduojama multimetru stebėti sistemoje sukuriamos nuolatinės elektros srovės stiprį ir bendrą sistemos varžą. Taip tikrinamas odos integralumas, elektrodų kokybė ir jų sąlytis su oda, taisyklingas sistemos sujungimas [11].
Jontoforezė vis plačiau tyrinėjama įvairių jonizuotų molekulių per-našai į audinius-taikinius, pvz., liuteinizuojančio hormono, insulino, ribonukleazės A fermento) [102, 138, 162, 185, 192], nukeozidų ir nu-keotidų [75], antibiotikų [82], antihipertenzinių vaistų [132], citochromo C, triptorelinio [32, 170], fotosensibilizatorių [64, 106] ir kitokių medžiagų pernaša į (pro) odą.
Jontoforezė vis plačiau diegiama į medicininę praktiką. 1993 metais Maisto ir vaistų agentūra jontoforezę patvirtino kaip diagnostinį tyrimą cistinei fibrozei ir hiperhidrozei nustatyti. 2004 metais ta pati tarnyba patvirtino LidoSite® sistemą (Vyteris, JAV) lidokanino ir epinefrino skvar-bos pro odą didinimui. 2006 m. Ionsys® fentanilio įvedimo jontoforetinę sistemą (Alza, JAV) patvirtino Maisto ir vaistų agentūra bei Europos medicinos agentūra.
1.4. 5-ALA ir jos darinių skvarbos į (pro) odą tyrimai
Kuriant naujus fotosensibilizatorius, neapsiribojama esamomis 5-ALA molekulės modifikacijomis. Nuspręsta skatinti endogeninių porfirinų sintezę, naudojant jų prekursorius (pirmatkus) [29, 191]. Tyrimų metu nustatyta, kad vietinio poveikio 5-ALA selektyviai padidina fo-toaktyvių porfirinų (FAP) kaupimąsi ligos paveiktų audinių ląstelėse. Vie-tinio poveikio 5-ALA naudojimo pranašumai – greitas sužadinto foto-sensibilizatoriaus klirensas (trunkantis 24–48 val.) ir gera endogeninių mo-lekulių tolerancija [186, 193]. 5-ALA indukuoti porfirinai ypač selektyviai veikia pažeistus audinius dėl jų ląstelinių ir metabolinių pakitimų [136].
5-ALA apykaita tarp ląstelių citozolio ir mitochondrijų yra pavaiz-duota 1.4.1 pav., parodant endogeninės ir egzogeninės 5-ALA įtaką šiam procesui. 5-ALA sintezė skatina glicino ir sukcinil-KoA jungimąsi, sudarant vieną 5-ALA molekulę. Vėliau citozolyje dvi 5-ALA molekulės, veikiamos 5-aminolevulinat-dehidrogenazės, yra kondensuojamos ir sudaro vieną porfobilinogeno (PBG) molekulę. Fermentų kaskados metu, keturios PBG molekulės yra sujungiamos į tetrapirolinį žiedą uroporfirinogeno III (URO III) pavidalu. Dekarboksilinimo ir oksidavimo reakcijų metu šis darinys yra konvertuojamas į protoporfiriną IX (PpIX), į kurį ferochelatazei įterpus geležies (II) joną, susidaro hemas. Hemas taip pat gali susidaryti iš glicino ir sukcinil-KoA (šis procesas konkuruoja su endogeninės 5-ALA susidarymu). Esant endogeninės 5-ALA pertekliui, skatinamas hemo susidarymas ir slopinama PpIX sintezė (normaliomis sąlygomis ląstelėse nesusidaro daug fotosensibilizatoriaus). Egzogeniniu būdu į ląstelę įnešus 5-ALA, slo-pinamas endogeninės 5-ALA susidarymo iš hemo mechanizmas. Atitin-kamai ir susidariusio PpIX konversijos į hemą mechanizmas tampa mažai aktyvus, kadangi ląstelėje yra pakankami kiekiai 5-ALA molekulių, kurių nereikia sintetinti endogeniniu būdu (t. y. nereikia skaidyti PpIX molekulių tam, kad būtų susintetinta 5-ALA). Dėl to susidaro pakankami PpIX kiekiai fotojautrioms reakcijoms vykti [146].
1.4.1 pav. 5-ALA apykaitos ir hemo sintezės schema
Egzogeninės ir endogeninės 5-ALA įtaka šiems procesams. URO – uropofirinogenas; KOPRO – kopropofirinogenas, PROTO – protopofirinogenas [adaptuota pagal 58].
5-ALA ir šviesos paveiktos ląstelės sudaro fluorescuojančius por-firinus. Intensyvi paveikto audinio fluorescencija rodo pakankamą susi-dariusių porfirinų kiekį audinyje-taikinyje bei išryškina patį naviką ir jo ribas. Porfirinų fluorescencija yra naudojama navikų diagnostikai urolo-gijoje, dermatolourolo-gijoje, onkologijoje. Skirtingai nuo jonizuojančiosios spinduliuotės, FDT gali būti pakartotinai taikoma toje pačioje srityje [77, 193].
5-ALA hidrofilinė struktūra riboja pasyviąją jos pernašą į (pro) odą, o jos cviterjoninė struktūra – riboja jontoforezės vyksmą. Todėl susintetinta įvairių 5-ALA darinių, pasižyminčių didesniu lipofiliškumu arba tam tikrame pH įgaunamu didesniu teigiamu arba neigiamu molekulės krūviu (priklausomai nuo pasirinkto vaisto pernašos į (pro) odą tipo).
pavidalu – tai yra balti kristaliniai milteliai, pasižymintys dideliu tirpumu vandenyje (1000 mg/ml, 25°C temperatūroje) bei stipriomis hidrofilinėmis savybėmis (logP = –3,25) [124]. Molekulės disociacija ir įgaunami krūviai skirtingos pH vandeniniuose tirpaluose yra apibūdinami disociacijos konstantomis (Ka = 4,05 (karboksigrupei) ir Kb = 8,9 (aminogrupei)).
N H3 + O O -O N H3 + O OH O N H2 O O -O +OH- +OH -+H+ +H+ pH<4,05 4,05<pH<8,9 pH>8,9
1.4.2 pav. 5-ALA disociacija ir jonizacija
Kaip pavaizduota 1.4.2 pav., 5-ALA fiziologinėmis sąlygomis yra cviterjonas. Jos aminogrupė yra teigiamai jonizuota, o karboksigrupė turi neigiamą krūvį. Dėl šio bipoliškumo ir suminio neutralumo 5-ALA molekulės sunkiai skverbiasi į biomembraną. Dėl hidrofiliškumo ir poliš-kumo mažėja molekulės giminingumas raginiam epidermio sluoksniui ir jonizuotos molekulės geba skverbtis į (pro) odą [125, 132].
Vaisto pasyviai skvarbai į (pro) odą pagerinti, jei nekečiama vietinio poveikio vaisto forma ar nenaudojama jontoforezė, svarbu pasirinkti lipofiliškesnius 5-ALA darinius. Tai pasiekiama hidrofilines karboksi- arba aminogrupes pakeitus lipofiliškesnėmis savybėmis pasižyminčiomis gru-pėmis (t. y. esterių, amidų ir kitokių darinių sintezė). Didinant 5-ALA darinių lipofiliškumą, padidėja jų giminingumas odai ir skvarba į (pro) ją. Šie dariniai odos esterazių poveikyje yra konvertuojami į 5-ALA ir įjun-giami į porfirinų sintezės ciklą. Šio ciklo metu susidaro aktyvus fotosen-sibilizatorius PpIX, kuris, aktyvuotas šviesos spinduliuote, veikia ląsteles [85].
Pagal cheminę sandarą 5-ALA dariniai yra skirstomi:
1) esteriai (a) alkilesteriai (linijiniai ir nelijiniai (šakoti)); b) cikliniai ir (arba) aromatiniai; c) etilenglikolio dariniai; d) halogeninti dariniai, e) nitro- ir tioesteriai (dariniai, kurių struktūroje yra nitrogrupių bei sieros elementų);
2) 5-ALA amidai ir pseudopeptidai;
5-ALA ir jos darinių efektyvumas priklauso nuo jų skvarbos į (pro) odą ir susintetinto FAP (PpIX ir kitų), kurie pasižymi fotosensibilizuo-jančiomis savybėmis, kiekio [60, 146].
Susintetintų FAP geba įsiterpti į hemoglobino apykaitos ciklą ląstelėje tiriama ląstelių kultūrose. Tai nustatoma pagal 5-ALA darinio koncentraciją, kuria pasiekta didžiausia paveiktų ląstelių fluorescencija (tiesiogiai siejama su FAP sintezės intensyvumu) [118].
Pastebėta, kad esteriams su ilga grandine (C5–C8) reikia 30–150 kartų mažesnės koncentracijos pasiekti tokiai pačiai paveiktų ląstelių fluorescen-cijai lyginant su 5-ALA. Tokios pačios tendencijos pastebėtos ir halo-genintuose (fluorintuose) 5-ALA alkilesteriuose [23]. Esterio grandinės šakojimasis (ypač 1-oje karboksilinės grupės padėtyje) mažina FAP sintezę in vitro. Toks ilgos grandinės šakojimasis gali dar labiau sumažinti FAP sintezę dėl lipofilinių savybių ir provaisto molekulių precipitacijos [194]. Įrodyta, kad į (pro) odą prasiskverbia didesnis metilaminolevulinato (Met-ALA) ir heksilaminolevulinato (Hex-(Met-ALA) kiekis nei 5-ALA, tačiau 5-ALA fotodinaminis intensyvumas, nustatytas pagal FAP koncentraciją, yra didesnis nei abiejų esterių [84].
Vertinant 5-ALA amidus, pastebėta, kad porfirinų indukcija in vitro ir in vivo nevyksta. Manoma, jog tai yra dėl ląstelių nesugebėjimo pašalinti acetilo pakaitą ir sudaryti hemo sintezei reikalingą prekursorių [93, 94]. Pseudopeptidai susintetinti, prijungiant vieną ar kelias aminorūgštis prie 5-ALA arba jos alkilinių esterių. Didžiausias FAP kiekis paveiktame audi-nyje susidaro, naudojant fenilalanino ir 5-aminolevulino rūgšties dipeptidą (Phe-5-ALA). Nustatyta, jog ilgėjant 5-ALA aminorūgščių grandinei, opti-maliai FAP sintezei pasiekti reikia didelių polipeptidinių junginių koncent-racijų, lyginant su paprastais n-alkilesteriais [29, 30].
Siekiant pernešti į (pro) odą didesnius 5-ALA kiekius, susintetintos molekulės, sudarytos iš keleto arba keleto dešimčių sujungtų 5-ALA molekulių fragmentų [112, 113]. Įrodyta, kad 5-ALA dendrimerinė struktūra susintetina daugiau FAP audinyje-taikinyje palyginti su jos tetramerine struktūra [23]. Dendrimerų poveikyje sintetinamas FAP kiekis paveiktame audinyje panašus arba 3–5 kartus didesnis palyginti su 5-ALA. Dendrimerų junginiai rodė panašų FAP aktyvumą kaip ir 5-ALA bei jos alikiliniai esteriai. Tačiau in vivo tyrimai parodė, kad dendrimerai yra mažai aktyvūs FAP sintezei [28, 43]. Įvairių alkilesterių pernašos tyrimų palyginimas pateiktas disertacijos 3.5.6 poskyryje.
dariniuose įvertinimas jontoforezės intensyvumui netirtas. Atsižvelgiant į tai, disertaciniame darbe susintetintas toks naujas cheminis junginys ir ištirti jo pasyvios bei jontoforetinės pernašos į (pro) odą dėsningumai.
1.5. Vietinio poveikio vaisto formų įtaka 5-ALA skvarbai į (pro) odą Tyrimų duomenimis, siekiant padidinti pasyviąją 5-ALA skvarbą į (pro) odą, veiklioji medžiaga yra įterpiama į įvairius hidrofilinius ar lipofilinius nešiklius. Nustatyta, kad iš kremų ir losjonų besiskverbdama 5-ALA didžiausias koncentracijas odoje sudaro po 3 val. nuo eksperimento pradžios [29]. Pernašos iš losjono metu susidaro FAP kiekis, didesnis už šių junginių kiekį, pasigaminusį, naudojant 5-ALA kremą. Padaryta išvada, kad losjonas pasyviai medžiagos skvarbai į (pro) odą yra tinkamesnis nešiklis už kremus. 5-ALA kiekis, prasiskverbęs į (pro) odą iš fiziologinio tirpalo su dimetilsulfoksidu (DMSO) palygintas su 5-ALA skvarba į (pro) odą iš kremo, liposomų ir vazelino pagrindo. Didžiausia 5-ALA skvarba pastebėta naudojant fiziologinį tirpalą su DMSO [30]. Skysta vaisto forma (tirpalai) nėra plačiai naudojama medicinos praktikoje dėl jų takumo ir sudėtingumo ją koncentruoti pažeidimo srityje [39]. DMSO pasižymi odą dirginančiomis savybėmis. Todėl skystų 5-ALA formų vartojimas yra reikšmingas tik teoriniu požiūriu [175]. Ištyrus kai kurias gelių sistemas bei iš jų pagamintus pleistrus, nustatyta, kad pasyviai prasiskverbusios 5-ALA kiekiai iš gelių ir pleistrų padidėja iki 2 kartų, lyginant su atitinkamais tepalais [45, 120, 197]. Tyrimų in vitro duomenimis, po 48 val. 80,3 proc. pradinės 5-ALA dozės prasiskverbė į odą iš pleistrų, 66,4 proc. – iš kubinių gelių ir šiek tiek mažiau – iš hidroksietilceliuliozinių gelių [190].
5-ALA skvarba į (pro) odą iš liposomų, sudarytų iš keramido, choles-terolio, palmių aliejaus, kolesterilio sulfato, esti mažesnė negu vandeninio tirpalo. Tačiau 5-ALA užsilaikymas ir pasiskirstymas epidermyje padidėja [147], kai hidrofilinė veiklioji medžiaga būna koncentruota liposomų viduje esančioje vandeninėje terpėje. Naudojant skirtingos pH vertės 5-ALA tir-palus, įterptus į liposomas (sudarytas iš floretino ir 6-ketocholestanolio), pastebėta, kad 5-ALA difuzija į (pro) odą padidėjo 1,7–3,5 kartus, lyginant su vandeniniu 5-ALA tirpalu be liposomų [9]. V/A tipo mikroemulsijos, sudarytos iš etiloleato, PEG-8, poligliceril-6-dioleato ir vandens sumažina 5-ALA difuzijos koeficientą ir veikliosios medžiagos atsipalaidavimą, tačiau padidina in vitro pernešamos 5-ALA kiekius, lyginant su kitomis vaisto formomis [8].
2.
TYRIMŲ OBJEKTAI IR METODAI
2.1. Tyrimų objektaiVietinio poveikio 5-aminolevulino rūgšties ir jos provaisto formos ir jų biofarmacinis vertinimas. 5-aminolevulino rūgštis tiriama vandenilio chlorido druskos pavidalu, o provaistas 2-(dimetilamino)-etil-5-amino-4-oksopentanoato trifluoracto rūgšties druska (DMAE-ALA) gauta keliapa-kopės sintezės būdu. Šis provaistas pasirinktas dėl potencialo įgauti du teigiamus krūvius fiziologinėmis sąlygomis, kadangi nuspręsta įvertinti papildomo krūvio įtaką molekulės pasyviai ir aktyvintai jontoforezės būdu skvarbai į (pro) odą. Abi veikliosios medžiagos 15–120 µM koncentracijų intervale įterptos į įvairius nešiklius (tirpalus, gelius, kremus), siekiant ištirti jų skvarbos į (pro) odą kinetiką, veikliųjų medžiagų pernašos tendencijas.
N H2 O O N CH3 CH3 O N H2 O OH O a) b)
2.1.1 pav. 5-ALA ir DMAE-ALA struktūros: a) 5-ALA; b) DMAE-ALA
Itin didelis dėmesys skirtas nešikliams, naudojamiems veikliųjų medžiagų įterpimui ir biofarmaciniam vertinimui. Suformuotos pasyvios skvarbos ir jontoforezės tyrimams naudotinos vietinio poveikio vaisto formos iš skirtingų polimerų: a) celiulioziniai geliai (pagaminti iš metilce-liuliozės ir hipromeliozės); b) polivinilkarboksilinės kilmės (karbopolio) geliai. 5-ALA ir DMAE-ALA įterptos į šiuos nešiklius bei į praktiniam gydymui LSMU Odos ir venerinių ligų klinikoje naudojamus pagrindus identiškais kiekiais, siekiant įvertinti 5-ALA ir DMAE-ALA pasyvią bei jontoforetinę skvarbą iš šių pagrindų, palyginti praktiškai gydymui naudojamas vietinio poveikio vaisto formas su eksperimentiniams tyrimams pagamintomis vietinio poveikio vaisto formomis, įvertinti provaisto sta-bilumą jose.
2.2. Reagentai ir medžiagos
Kiti provaisto sintezei reikalingi reagentai įsigyti atitinkamai iš šių įmonių: natrio vandenilio karbonatas (≥ 98 proc.), DMSO-d6, D2O ir CDCl3 (naudojami 1H BMR susintetintų medžiagų tyrimui), dichlormetanas (≥ 99 proc.), dietileteris – iš Sigma-Aldrich (Buchs, Šveicarija); di-tert-butildikar-bonatas (≥ 99 proc.), natrio sulfatas (≥ 99 proc.), p-toluensulfoninės rūgšties monohidratas (98,5 proc.) – iš ReagentPlus (Buchs, Šveicarija), bevandenis metanolis (99,8 proc. su molekuliniu sietu, H2O ≤ 0,005) iš Acros Organics (Geel, Belgija); etilacetatas (≥ 99,0 proc.), kalio vandenilio oksisulfatas (≥ 98 proc.) – iš Fluka (Buchs, Šveicarija); toluenas (99,8 proc.) ir 2-pro-panolis įsigyti iš Biosolve BC (Valkenswaard, Olandija). Reakcijų eigos ir susidarančių produktų stebėjimui skirtos TLC (plonasluoksnės chromato-grafijos) silikagelio 60F254 (20×20) plokštelės bei TLC aliuminio oksido 60F254(20×20) plokštelės įsigytos iš MerckGA (Damštadas, Vokietija).
Kiekybinei veikliųjų medžiagų analizei naudojamas ESC gradientinio švarumo eliuentas acetonitrilas (ACN), įsigytas iš Biosolve BC (Valkens-waard, Olandija); ultragrynas vanduo paruoštas „Milli-Q“ vandens valymo sistema (Bedfordas, JAV). Trifluoracto rūgšis (≥ 99,0 proc.) ir skruzdžių rūgštis (FA) (≥ 99,0 proc.) įsigytos iš ReagentPlus (Buchs, Šveicarija), etanolis (96,3 proc.) – iš AB „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva).
Nešiklių gamybai naudojamas karbopolis 980 ir karbopolis 981 įsigyti iš kompanijos Lubrizol (Klivlendas, JAV), hipromeliozė ir metilceliuliozė padovanoti kompanijos Shin-Etsu Organics (Tokijas, Japonija). Natrio šarmo ir druskos rūgšties tirpalai, naudojami pH reikšmių koregavimui, įsigyti iš šių kompanijų: natrio šarmas (≥ 99,0 proc.) – iš VWR International (Liutervortas, Didžioji Britanija), o koncentruota druskos rūgštis (37,0 proc.) – iš Sigma Aldrich (Šteinhaimas, Vokietija). Emulsinis pagrindas „Basalis“, naudojamas palyginamiesiems skvarbos į (pro) odą tyrimams, įsigytas LSMU vaistinėje (Kaunas, Lietuva).
2.3. Naudota aparatūra ir įrengimai
DMAE-ALA sintezės darbams naudota IKA kaitinamoji maišyklė su termostatu (Štaufenas, Vokietija), vietinių meistrų iš stiklo pagamintas Dean-Stark aparatas. Cheminių reakcijų stebėjimas atliktas chromatografine sistema HTS PAL – LC10A – API 150 Ex (CTC, Analytics AG, Cvingenas, Šveicarija). Naudojant chromatografinę sistemą Applied Biosystems QStar Pulsar (Ilinojus, JAV), nustatyta galutinio produkto struktūra. Darbe nau-dota Biosystems QStar Pulsar sistema, sudaryta iš skrydžio trukmės masių spektrometro (TOF) su MALDI II šaltiniu, turbo jonų šaltiniu, nanopurkš-tuvo zondu, Gilson FC203B frakcijų rinktuvu (Midletonas, JAV), Varian 602 vakuuminio siurbliu ir Dell kompiuterio su QStar programine įranga.
Elementinė analizė atlikta Thermo finnigan CHNS analyzer (FLASH EA 1112 series) (Milanas, Italija) įrenginiu. 1H BMR spektrai užrašyti Varian
Unity Inova (Varian Medical Systems, Inc., Palo Alto, JAV) spektrometru.
Kokybinis ir kiekybinis 5-ALA nustatymas mėginiuose atliktas dviem chromatografinėmis sistemomis:
1 chromatografinė sistema. ESC-ŠSD sistema sudaryta iš Waters 2695 modulio (Waters, Milfordas, JAV), susidedančio iš 2 siurblių, automatinio injektoriaus, degazatoriaus ir termostato, sujungtų su Alltech 3300 ŠSD (Grace Division Discovery Sciences, Dyrfildas, JAV). Siekiant išanalizuoti smailių vienalytiškumą, papildomai prie sistemos prijungtas 996 PDA detektorius (Waters, Milfordas, JAV). Šia sistema išvystyti ir praktiškai pritaikyti du metodai (A ir B), skirti 5-ALA nustatymui ir jos kiekio apskaičiavimui odos mėginių ekstraktuose. Gauti duomenys apdoroti kom-piuterine programine įranga Waters Empower 2.0 (Milfordas, JAV).
2 chromatografinė sistema. UESC-MS/MS sistema sudaryta iš Waters Acquity® ultra chromatografinės sistemos (Waters, Milfordas, JAV), susidedančios iš dviejų siurblių, automatinio injektoriaus, degazatoriaus ir termostato, sujungtų su trigubu kvadrupolio spektrometru su Z-Spray jo-nizacijos šaltiniu (Waters, Milfordas, JAV). Pradinėse šio metodo vystymo stadijose prijungiamas UV Waters detektorius, kurio pagalba įvertintas izobarinių ir neizobarinių sistemą teršiančių jonų buvimas odos mėginiuose. Ši sistema naudojama DMAE-ALA grynumui nustatyti. Naudojant šią aparatūrą, išvystytas metodas, skirtas 5-ALA ir DMAE-ALA kiekio nusta-tymui odos mėginių ekstraktuose.
Wissenschaftlich-Technische Werkstätten GmbH, Vilenhaimas, Vokietija); gelių nuodžiūvis (drėgmės netektis padidintos temperatūros poveikyje) matuotas MLS-A drėgnomačiu (Kern & Sohn GmbH., Balingenas, Vokietija); reologinės savybės ištirtos Carri-med CLS100 reometru (TA Instruments, Ešbornas, Vokietija).
Veikliųjų medžiagų skvarbos į (pro) odą eksperimentams in vitro naudota dvi įrangos sistemos, parengtos pagal analogiškų tyrimų gaires [50].
1-oji skvarbos pro odą tyrimams sistema. LSMU Klinikinės farma-cijos katedroje naudota sistema, sudaryta iš termostatinės cirkuliacinės van-dens vonelės (Grant GD120, Grant Instruments Ltd, Keimbridžas, Didžioji Britanija), peristaltinio siurblio Masterflex® L/S® su daugiakanale siurblio galva (Cole-Parmer Instrument Co., Ilinojus, JAV) ir Bronaugh tipo pra-takiųjų difuzinių celių, pagamintų iš politetrafluoretileno.
2-oji skvarbos pro odą tyrimams sistema. Ženevos universitete nau-dota įranga, sudaryta iš plastikinės vonelės, termostato Thermostat Ma-gicontrol (Prodac International, Citadella, Italija), magnetinės maišyklės IKA MIDI MR 1 (Štaufenas, Vokietija) ir Franz’o celių. Jontoforetiniams bandymams Franz‘o celės pakeistos į dvišakes modifikuotas Franz‘o celes ir prie Ag/AgCl elektrodų prijungtas elektros srovės šaltinis APH 1000 M (Kepco; Flushing, Niujorkas, JAV).
2.4. Tyrimų metodai 2.4.1. DMAE-ALA sintezė
Darbo metu išvystyto naujo provaisto 2-(dimetilamino)-etil-5-amino-4-oksopentanoato sintezės metodiką sudarė 3 stadijos.
1 stadija: 5-(tert-butoksikarbonilamino)-4-oksopentanoinės rūgšties sintezė.
Reakcijos esmė – 5-ALA protekcija (apsaugojimas) N-tert-butiloksi-karbonilo(Boc) grupe (reakcijos procesas pavaizduotas 2.4.1.1 paveiksle).
CH3 CH3 O CH3 O O O O C H3 CH3 CH3 N H2 O OH O + NH OH O O C H3 O CH3 C H3 O
2.4.1.1 pav. 5-(tert-butoksikarbonilamino)-4-oksopentanoinės rūgšties
Pirmoje provaisto sintezės stadijoje pritaikytas modifikuotas Berko-vitch G ir kt. mokslininkų [17] metodas. 1 ekv. (0,01 mol, 2 g) 5-ami-nolevulino rūgšties ir 6 ekv. (0,06 mol, 6 g) natrio vandenilio karbonato įdėta į apvaliadugnę kolbą ir užpilta bevandeniu metanoliu taip, kad 5-ALA sudarytų 0,1 M koncentraciją tirpale. Visa tai atlikta azoto atmosferoje. Vėliau pridėta 2 ekv. (0,024 mol, 5,5 ml) di-tert-butildikarbonato. Šis mi-šinys paveiktas ultragarsu 6 valandas azoto atmosferoje. Vėliau nufiltruotas NaHCO3, išgarintas metanolis, o aliejinis produktas ištirpintas vandenyje. Šis tirpalas praplautas dietileteriu (3×30 ml); taip pašalintas di-tert-butil-dikarbonato perteklius. Surinktas vandeninis tirpalas rūgštintas KHSO4 iki pH = 2 vertės ir plaunamas etilacetatu (3×25 ml). Surinktas etilacetato sluoksnis džiovintas, pridedant Na2SO4, kuris vėliau nufiltruotas; etilace-tatas išgarintas. Produkto susidarymo ir grynumo stebėjimui naudota tir-piklių sistema izopropanolis:vanduo (2:1). Dėmių ryškinimas atliktas ninhidrino tirpalu.
2 stadija. Dean – Stark reakcija (2-(dimetilamino)-etil-5-[tert-butoksi-karbonil)amino]-4-oksopentanoato sintezė).
Reakcijos esmė – prie Boc- fragmentu apsaugotos 5-ALA prijungti DMAE molekulę ir sudaryti reakcijos eigai reikalingą tarpinį produktą (reakcijos procesas pavaizduotas 2.4.1.2 paveiksle).
NH OH O O C H3 O CH3 O C H3 O H N CH3 CH3 + NH O O O O N CH3 CH3 O C H3 CH3 CH3 2.4.1.2 pav. (2-(dimetilamino)-etil-5-[tert-butoksikarbonil)amino]-
4-oksopentanoato sintezės reakcija
3 stadija: 2-(dimetilamino)-etil-5-amino-4-oksopentanoato sintezė. Reakcijos esmė – Boc apsauginės grupės pašalinimas ir galutinio produkto gavimas (reakcijos procesas pavaizduotas 2.4.1.3 paveiksle).
NH O O C H3 CH3 C H3 O N CH3 CH3 O O C H3 OH C H3 C H3 N H2 O O N CH3 CH3 O + + CO2
2.4.1.3 pav. Apsauginės grupės pašalinimo reakcija
Šiame darbo etape 1 ekv. (0,33 mmol, 100 mg,) 2-(dimetilamino)-etil-5-[tert-butoksikarbonil)amino]-4-oksopentanoato (antros stadijos metu susidariusio tarpinio produkto) ištirpinta dichlormetane, kad susidarytų 0,07 M koncentracija. Apvaliadugnė kolba su šiuo tirpalu atšaldyta ledo vonioje iki 0°C. Vėliau 50 ekv. trifluoracto rūgšties (0,02 mol, 1,3 ml) sulašinta maišant į atšaldytą tirpalą. Po 10 min. reakcijos mišinys maišytas 30 min. kambario temperatūroje. Mišinys išgarintas, naudojant rotacinį garintuvą 35 °C temperatūroje. Iš gauto aliejinės konsistencijos produkto iškristali-zuotas 2-(dimetilmino)-etil-5-amino-4-oksopentanoatas. Gautas aliejinis produktas ištirpinamas 2 ml metanolio ir, intensyviai maišant, sulašintas į kolbą su dietileteriu, atšaldytu iki –30 °C temperatūros. Kolba įdedama į šaldytuvą 30-iai minučių į –30 °C temperatūrą, kol pastebėti besiformuo-jantys kristalai. Vėliau siekiant pagreitinti kristalų formavimąsi, kolba su mišiniu 10 minučių paveikta ultragarsu. Sukristalinus dalį galutinio pro-dukto, DMAE-ALA tirpale susmulkinta lazdele, nupilant pašalintas die-tileterio tirpalas. Galutinis produktas išdžiovintas, gauti gelsvi higroskopiški milteliai.
2.4.2. DMAE-ALA sintezės, struktūros ir grynumo stebėjimo metodai 1
H BMR spektrai užrašyti 300 MHz dažnio spektrometru Varian Unity Inova (Varian Medical Systems, Inc., Palo Alto, JAV). Pavyzdžiai analizei paruošti, tirpinant 5 mg analizuojamos medžiagos mėginį 0,7 ml tūryje atitinkamo tirpiklio, turinčio deuterį savo struktūroje (šiuo atveju naudojami DMSO-d6, D2O bei CDCl3 tirpikliai). 1H BMR užrašyti spektrai analizuoti MestRenova 7.0 programine įranga.
tirpik-lyje). Tiriamajame mėginyje siekta sudaryti optimalią 1–100 µg/ml koncen-traciją ir neviršyti maksimalios smailės intensyvumo ribos (t. y. 3,0e6
). DMAE-ALA grynumas ir homogeniškumas nustatytas didelės raiškos masių spektrometrinės analizės metodu. Kelių miligramų DMAE-ALA kiekis ištirpintas nedideliame kiekyje metanolio ir ištirtas, esant teigiamai elektros srauto jonizacijai.
Susintetintos medžiagos elementinė analizė atlikta Ženevos universi-teto Neorganinės, analitinės ir taikomosios chemijos katedroje deginimo metodu, ištiriant C, H, N elementus. Elementinė analizė atlikta Thermo finnigan CHNS analyzer (FLASH EA 1112 series) (Milanas, Italija) apa-ratu, kuriame DMAE-ALA sudegintas. C, H, N elementų procentinės kon-centracijos nustatytos IR analizės metodu.
2.4.3. Odos paruošimas in vitro eksperimentams
Eksperimentams naudota žmogaus arba kiaulių oda, paruošta pagal standartizuotus protokolus. Kiaulių oda pasirinkta kaip homogeniškas ir pagal struktūrą artimas žmogaus odai šaltinis. Jos atitikimas žmogaus odai yra patvirtintas anksčiau atliktais tyrimais [50].
1-asis odos paruošimo metodas. In vitro skvarbos į (pro) odą tyrimams LSMU Klinikinės farmacijos katedroje naudojama 30–40 metų baltaodžių moterų oda, gauta plastinės krūtų mažinimo operacijos LSMU Plastinės ir rekonstrukcinės chirurgijos klinikoje metu. Aliuminio folijos apvalkale oda laikyta –20°C temperatūroje [76] ne ilgiau kaip 6 mėnesius iki eksperimentų atlikimo pradžios. Tyrimams su žmogaus oda gautas Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas (2008-11-05, Nr. BE-2-53).
