P EDERZOLI , M M ANDRIOLI , L M OLA

Dipartimento di Biologia Animale, Università di Modena e Reggio Emilia, Via Campi, 213/D – 41100 Modena, Italia.

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ESPRESSIONEDIMOLECOLECOINVOLTENELLAREGOLAZIONE

IONICAINBRANCHIOSTOMALANCEOLATUM

EXPRESSIONOFMOLECULESINVOLVEDINIONICBALANCE

OFBRANCHIOSTOMALANCEOLATUM

Abstract – The presence of CFTR, V-ATPase and carbonic anidrase II were demonstrated by

immunocytochemical and bioinformatics studies in Branchiostoma lanceolatum. The physiological role of these molecules and the possible evolutive implications were discussed.

Key-words: Branchiostoma lanceolatum, ATPase, carbonic anidrase, CFTR.

Introduzione – Negli ultimi anni il completamento del progetto genoma sull’anfiosso Branchiostoma floridae Hubbs 1922, ha dato notevole impulso a tutte le indagini di tipo molecolare; ciò, aggiunto alla nota importanza dal punto di vista filogenetico dei cefalocordati, ha reso l’anfiosso un modello sempre più studiato.

E’ noto che tutti i vertebrati possiedono epiteli implicati nel trasporto di elettroliti, spesso contenenti cellule specializzate per tal scopo, come le cellule a cloruri dei pesci. Il nostro obiettivo è valutare quali siano nell’anfiosso i sistemi implicati nella regolazione ionica, mediante indagini immunocitochimiche e bioinformatiche.

Materiali e metodi – Esemplari giovani, non ancora maturi sessualmente, di Branchiostoma lanceolatum Owen 1846 (lunghi circa 1 cm) sono stati prelevati dai sedimenti dell’isola d’Elba e fissati in formalina salata (formalina al 10% con l’aggiunta dello 0,7% di NaCl).I preparati sono stati inclusi in toto in paraffina, tagliati in sezioni di 7 μm e processati con l’immunofluorescenza e col metodo BAS. Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi: anti-V-ATPasi (Santa Cruz, USA, 1:100), anti-banda 3 (o anti-AE1) (Santa Cruz, USA, 1:100 e 1:50), anti-CFTR (Santa Cruz, USA, 1:100) e anti-anidrasi carbonica II (Rockland, USA, 1:100).

Data la disponibilità del progetto genoma di B. floridae, è stata verificata a livello bioinformatico la presenza degli antigeni degli anticorpi scelti in modo da poter confermare l’esito delle indagini immunocitochimiche. La ricerca dei diversi geni è stata effettuata utilizzando il sito web Metazome (http://www.metazome.net/). Le sequenze identificate sono quindi state confermate nel sito dedicato al progetto genoma di B. floridae all’indirizzo http://genome.jgi-psf.org.

Risultati e conclusioni – Tutte le cellule epiteliali dell’apparato digerente post- faringeo degli esemplari esaminati hanno mostrato una marcata immunoreattività (IR) all’anti-CFTR (regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica), mentre meno intensa, sempre nelle stesse cellule, è risultata l’IR per la V-ATPasi (pompa protonica vacuolare) e per l’anidrasi carbonica II. Alcune cellule dell’epidermide sono risultate positive all’anti-CFTR. Nessuna IR è stata rilevata invece per la proteina della banda 3.

40° Congresso della Società Italiana di Biologia Marina Livorno, 26-29 maggio 2009

La ricerca nella banca dati del genoma di B. floridae ha permesso di identificare ortologhi codificanti per le V-ATPasi (115527), anidrasi carbonica (237853) e CFTR (119583) ad indicare la specificità delle reazioni di immunocitochimica realizzate. L’assenza di immunopositività per la proteina della banda 3 non è invece riconducibile all’assenza del gene, poiché il genoma di B. floridae contiene un ortologo del gene AE1 (BRAFLDRAFT_241621) che codifica per la proteina della banda 3. Si può supporre che anche B. lanceolatum abbia un ortologo di questo gene. Tuttavia è interessante notare che le proteine AE1 umana e di B. floridae hanno una identità del 41%, con numerosi tratti poco conservati che potrebbero rendere l’anticorpo utilizzato non capace di riconoscere la proteina AE1 di anfiosso. Non può neppure essere scartata la possibilità che il gene AE1 non sia espresso in tutte le fasi del ciclo vitale di B. lanceolatum, ma la sua espressione sia successiva rispetto agli stadi utilizzati poiché regolata durante lo sviluppo, come suggerito nel pollo (Gabrielli et al., 2004). Ricordiamo infine che l’anfiosso non possiede globuli rossi e/o emoglobina e che quindi effettua scambi gassosi sicuramente anche attraverso la sottile epidermide. È noto che la proteina della banda 3, scambiatore anionico (cloruri/bicarbonati), è presente in diversi tessuti, ma in particolare è caratteristica di tutti gli eritrociti dei vertebrati, escluse lamprede e missine, pertanto tale proteina potrebbe essere espressa nell’anfiosso solamente in altri tessuti, non ancora differenziati negli stadi da noi esaminati, come ad esempio le gonadi.

Ogni metazoo deve risolvere il problema dell’acidificazione, conseguente alle attività metaboliche cellulari, e quindi deve possedere un sistema tampone. In tutti i vertebrati il pH è mantenuto costante attraverso l’escrezione renale di ioni H+; inoltre i pesci utilizzano a questo scopo anche il tessuto branchiale, gli anfibi la pelle. L’anfiosso non possiede tessuto branchiale specializzato né reni differenziati. Pertanto gli unici organi con cui può svolgere la regolazione del pH sono l’eoidermidee l’apparato digerente. Gli ioni H+ possono diffondere spontaneamente attraverso la membrana plasmatica ma possono essere anche eliminati attraverso una pompa protonica, quale ad esempio l’ATPasi vacuolare. Spesso l’espulsione di H+ è accompagnata dall’uscita di Cl-, in cambio dell’entrata di ioni bicarbonato. Perciò la presenza di CFTR (proteina associata ai canali del cloro) e di anidrasi carbonica (enzima che catalizza la rapida conversione di CO2 in bicarbonato), insieme alla pompa protonica potrebbero rappresentare un pool di molecole che regolano meccanismi di scambio ionico coinvolti nel controllo del pH cellulare, localizzati prevalentemente nell’epitelio intestinale dell’anfiosso. Infine, nell’anfiosso, che pure è isosmotico con il mare, la concentrazione ionica deve essere sottoposta a regolazione. L’epitelio, al pari di quanto avviene nei teleostei (Marshall e Singer, 2002), può essere la sede di questa attività.

Ringraziamenti: Si ringrazia l’Istituto per le Scienze Marine HYDRA (Fetovaia, Isola d’Elba) per il

prelievo e la fissazione degli esemplari utilizzati in questa ricerca.

Bibliografia

GABRIELLI M.G., COX J.V., MATERAZZI G., MENGHI G. (2004) – Cell type-specific and developmentally regulated expression of the AE1 exchanger in the chicken chorioallantoic membrane. Histochem Cell Biol., 121: 189-199.

MARSHALL W.S., SINGER T.D. (2002) – Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in teleost fish. Biochem. Biophys. Acta, 1566: 16-27.

40° Congresso della Società Italiana di Biologia Marina Livorno, 26-29 maggio 2009