Data questa premessa siamo quindi passati all’analisi del tessuto adiposo bianco considerando soltanto il gruppo degli adulti, perchè per il gruppo dei giovani non c’è, al momento, un numero statisticamente significativo di animali per poter procedere all’analisi dei dati. L’analisi dell’espressione genica ha riguardato: leptina e adiponectina (Figura 8), i geni implicati nella sintesi e mobilità dei trigliceridi (Figura 9)
ADULTI GIOVANI
35 e infine i geni noti per il loro coinvolgimento nel fenomeno di transdifferenziazione Bianco-Bruno (Figura 10). In tutti i casi sono stati esaminati sia i depositi adiposi viscerali (epididimale, EPI e perirenale, PERI) che il sottocutaneo (SC).
L’espressione genica di leptina e adiponectina non risulta significativamente diversa in alcuno dei casi esaminati (Figura 8 A, B, C) con l’eccezione del caso del tessuto SC in cui si osserva un aumento di adiponectina nei topi trattati con FLX (Figura 8C).
Figura 8. Espressione dei geni della Leptina e Adiponectina nel tessuto adiposo di topi trattati con Fluoxetina (0.166 g/L, in verde scuro) e di topi di controllo (in bianco). I topi adulti (n=9) sono stati trattati da P50 per 4 settimane. Gli Istogrammi mostrano l’espressione genica di Leptina e Adiponectina nel tessuto adiposo epididimale (A), nel tessuto adiposo perirenale (B) e nel tessuto adiposo sottocutaneo (C). La quantificazione dell’espressione è stata ottenuta tramite Real time PCR (Metodo taqman). I dati sono espressi come media errore standard * t-test P<0.05.
Per quanto riguarda i geni implicati nel turnover dei trigliceridi abbiamo preso in considerazione sia l’espressione di enzimi importanti per la sintesi e l’immagazzinamento degli acidi grassi nel TA: fatty acid synthase (FAS) e la lipoprotein
lipase (LPL), che l’espressione di fattori chiave per la mobilità dei TG: Hormone
A)
B)
36
Sensitive Lipase (HSL) e perilipina (Plin1). In EPI e SC non si osserva alcuna differenza
statisticamente significativa tra trattati FLX e controlli (Figura 9A e C). Tuttavia una tendenza verso una maggiore espressione è presente per molti dei geni analizzati nei topi FLX. Nel tessuto perirenale FAS, LPL e HSL risultano significativamente indotti dalla FLX (Figura 9 B).
Figura 9. Espressione di geni implicati nel turnover degli acidi grassi (FAS, LPL, PLin1 e HSL) nel tessuto adiposo di topi trattati con Fluoxetina (0.166 g/L, in verde scuro) e di topi di controllo (in bianco). I topi adulti (n=9) sono stati trattati da P50 per 4 settimane. Gli istogrammi mostrano l’espressione di geni implicati nel turnover degli acidi
A)
B)
37
grassi nel tessuto adiposo epididimale (A), nel tessuto adiposo perirenale (B) e nel tessuto adiposo sottocutaneo (C). I dati sono espressi come media errore standard * t-test P<0.05.
In figura 10 si può osservare l’espressione dei cosiddetti geni della brownizzazione: - Prdm16 (PR-domain-containing 16): è un coregolatore trascrizionale che
controlla lo sviluppo degli adipociti bruni (Seale et al., 2011). L’aumento di espressione di questo gene in tutti i depositi adiposi bianchi del topo, ottenuta grazie alla creazione di topi transgenici (topi ap2-prdm16), provoca la trasformazione selettiva del grasso sottocutaneo in grasso con fenotipo simile a quello del bruno (Seale et al., 2011).
- CIDEA (cell death-inducing DFFA-like effector A): questa proteina gioca un ruolo fondamentale nell’apoptosi. Inoltre promuove la formazione di gocce di lipidi negli adipociti e può mediare l’apoptosi degli adipociti stessi. Topi che non hanno la forma funzionale della proteina hanno un più elevato indice metabolico e un aumento di lipolisi nel tessuto adiposo bruno;
- UCP-1 (uncoupling protein-1): conosciuta anche come termogenina. È una proteina disaccoppiante che permette di dissipare l’energia sotto forma di calore e non sotto forma di ATP;
- PGC1α (Peroxisome Proliferator - Activated Receptor Gamma Coactivator 1
alpha): coattivatore trascrizionale che induce la biogenesi mitocondriale
nelle cellule. Un recente lavoro ha evidenziato che PGC1A può anche modulare la composizione e le funzioni dei mitocondri. È considerato il centro del metabolismo ossidativo;
- Adrb3 (beta3-adrenergic receptor): media l’attivazione dell’adenilato ciclasi indotta da catecolamine attraverso l’attivazione di proteine G. E’ localizzato principalmente nel tessuto adiposo ed è coinvolto nella regolazione della lipolisi e della termogenesi (Ferrer-Lorente et al., 2005).
- PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor γ): è un recettore nucleare di tipo II che nell’uomo è codificato dal gene PPARG. Forma eterodimeri con RXRs (retinoid X receptors) per regolare la trascrizione di vari geni. E’ indispensabile per il differenziamento e la sopravvivenza degli
38 adipociti sia bianchi che bruni (Lo et al., 2013). Ha inoltre un ruolo cruciale nel metabolismo del glucosio (Jones et al., 2005).
Nel TA EPI risultano significativamente indotti da FLX sia Prdm16 che CIDEA (Figura 10A). Nel TA PERI risulta significativamente aumentata l’espressione di PGC1α e vi è una tendenza spiccata verso l’incremento di PPARgamma (Figura 10B): per gli altri geni non ci sono variazioni. Infine nel TA SC risulta una espressione significativamente più elevata per Prdm16, CIDEA e PPARgamma (Figura 10C).
Figura 10. Espressione di geni della “brownizzazione” (UCP-1. Prdm16, CIDEA, PPARgamma e PGC1α) nel tessuto adiposo di topi adulti trattati con Fluoxetina (0.166 g/L, in verde scuro) e di topi di controllo (in bianco). I topi adulti (n=9) sono stati trattati da P50 per 4 settimane. Gli istogrammi mostrano l’espressione di geni della “brownizzazione” nel tessuto adiposo epididimale (A), nel tessuto adiposo perirenale (B) e nel tessuto adiposo sottocutaneo (C). I dati sono espressi come media errore standard * t-test P<0.05, ** t-test P<0.01.
A)
B)
39 Questi dati suggeriscono che l’espressione genica del TA subisce modifiche in seguito al trattamento con FLX. Queste modifiche vanno nel senso di un maggior turnover dei lipidi e di una tendenza alla brownizzazione.
Ci siamo quindi chiesti se anche a livello istologico si potessero osservare dei cambiamenti. A questo scopo abbiamo utilizzato il TA SC dove le modifiche di espressione erano più numerose e apprezzabili. Sezioni di TA SC sono state quindi colorate con ematossilina-eosina, osservate al microscopio e analizzate a livello morfometrico allo scopo di quantificare le aree di tessuto “TAB-like”. Sono stati analizzati e acquisiti vari campi ottici, è stata quindi ricostruita in maniera digitale l’intera sezione e infine cerchiate e quantificate le aree di interesse. In figura 11A è mostrata un esempio di questo procedimento: al centro la sezione ricostruita e ai lati gli ingrandimenti di due aree, che contengono o prive di adipociti bruni.
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Figura 11. (A) Immagine che mostra una sezione di tessuto adiposo bianco sottocutaneo ricostruita tramite l’utilizzo del programma Gimp 2.0. Ogni foto che compone la sezione è stata acquisita al microscopio, ad ingrandimento 10X. Nei due ingrandimenti viene mostrato il tessuto adiposo bianco (a sinistra)e il tessuto adiposo bruno (a destra). Le due immagini sono state acquisite ad ingrandimento 20X. (B) In verde scuro sono rappresentati i topi adulti, trattati da P50 per 4 settimane (n=9). l’istogramma mostra la percentuale di area interessata dal fenomeno della brownizzazione rispetto all’area totale. I dati sono espressi come media errore standard.
Il confronto statistico, eseguito su un totale di 9 animali (4 controlli e 5 FLX) non ha mostrato differenze significative nella presenza di TAB: si osserva tuttavia una tendenza verso l’incremento nei topi FLX.
41
42
1. I nostri dati indicano che la somministrazione del SSRI (Serotonin Reuptake inhibitor) Fluoxetina (FLX) ha effetti sul peso sia su topi giovani che su topi adulti. Nei topi giovani il minor guadagno di peso osservato a seguito della somministrazione di FLX è accompagnato da una significativa riduzione nell’introito di cibo che non si osserva invece nei topi adulti, dove si può pensare che il bilancio energetico negativo (rispetto ai controlli non trattati) possa essere dovuto ad un incremento della spesa energetica, che al momento non abbiamo per ora potuto adeguatamente valutare. Inoltre e sorprendente come il minor peso guadagnato dai topi in trattamento non si riflette in un minore accumulo di tessuto adiposo ne’ in un minor peso del fegato. Si può quindi ipotizzare che ci possa essere una deplezione a livello di massa magra. 2. Nei topi giovani la glucosio tolleranza e l’insulino sensibilità risulta peggiorata
dal trattamento con FLX. A questo proposito, nonostante gli effetti periferico- metabolici di questo farmaco siano argomento di dibattito in letteratura, vi sono studi che riportano effetti negativi sul metabolismo del glucosio (R. Gomez et al., 2001)
3. La FLX, come l’AA, induce l’espressione della neurotrofina BDNF nell’ipotalamo. 4. Il TA dei topi adulti trattati con FLX presenta un’espressione genica modificata nel senso di un maggiore dinamismo nel deposito e mobilità dei lipidi. C’è inoltre una generale tendenza verso la brownizzazione, ovvero verso l’acquisizione di un fenotipo TAB. Tale dato è in linea l’ipotesi suggerita da Cao (Cao et al.,2011) secondo la quale BDNF è in grado di mediare questo tipo di trasformazione attraverso il sistema nervoso simpatico.
In conclusione, nonostante il trattamento con FLX provochi un peggioramento del metabolismo del glucosio, la facilità di utilizzo e di reperibilità di questo farmaco, unita agli effetti sulla diminuzione del peso corporeo e sul maggiore dinamismo metabolico e termogenico del TA, aprono la strada a ulteriori studi circa il suo utilizzo per la cura/prevenzione di una patologia multifattoriale quale l’obesità.
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