Effetti del derivato purinico AIT-082

AIT-082 (4-[[3-(1,6-dihydro-6-oxo-9-purin-9-yl)-1-oxopropyl]amino]benzoic acid) è un analogo stabile della purina ipoxantina, che ha dimostrato di indurre effetti in parte analoghi, ma non totalmente sovrapponibili, a quelli indotti dalla guanosina sia in vitro che in vivo.

AIT-082 ha suscitato inizialmente interesse per la sua capacità di aumentare la memoria in topi in cui era stato indotto un deficit medio di memoria senza indurre effetti avversi (Glasky et al., 1994).

Studi in vitro hanno dimostrato la capacità di AIT-082 di potenziare l’effetto differenziante di NGF sulle cellule PC12 (Middlemiss et al., 1995) e di stimolare il rilascio di adenosina e neurotrofine dagli astrociti (Glasky, 1996; Rathbone, 1999).

In vivo, AIT-082 è anche in grado di proteggere i neuroni ippocampali di ratto dalla tossicità a lungo termine da kainato riducendo la perdita di neuroni e la diminuzione di attività di GAD (glutamic acid decarboxylase) (Di Iorio et al., 2001). E’ stato accertato che AIT-082 è in grado di passare la barriera ematoencefalica con un meccanismo non saturabile mentre viene portato fuori tramite un meccanismo attivo e saturabile (Taylor et al., 2000).

Uno studio su topi dimostra che AIT-082 è in grado di ridurre il tremore indotto da arecolina e oxotremorina diminuendone l’intensità e la durata (Nannan et al., 2007).

Questo composto sembra essere un buon candidato per la cura di malattie neurodegenerative quali il morbo di Alzheimer ed in questo momento è in fase di sperimentazione clinica.

1.5 Differenziazione

La “differenziazione cellulare” è definita come un processo complesso in cui una cellula acquisisce o mostra un nuovo fenotipo stabile senza cambiare il proprio genotipo (Ham et al., 1980). La “differenziazione neuronale” è un tipo di differenziazione cellulare in cui le cellule acquisiscono caratteristiche tipiche delle cellule neuronali come l’eccitabilità elettrica, la presenza di assoni e dendriti e l’espressione di proteine neuronali specifiche. Nello sviluppo embrionale, gruppi di cellule indifferenziate vanno incontro a differenziazione attraverso diversi passaggi, così come i neuroni ad esempio originano dai neuroblasti che a loro volta derivano dalla cresta neurale. La differenziazione neuronale è un evento fondamentale per lo sviluppo del sistema nervoso e per la rigenerazione del tessuto nervoso danneggiato (Buttiglione et al., 2007) che coinvolge diverse vie di trasduzione del segnale (Sànchez et al., 2004) ed è regolata da interazioni cellula-cellula e cellula-substrato. Inoltre partecipano a questo fenomeno una gran quantità di molecole solubili tra cui ormoni, fattori di crescita, citochine, fattori trofici e morfogenici (Lòpez-Carballo et al., 2002).

Una delle caratteristiche più importanti delle cellule differenziate è l’arresto della crescita. Ad esempio, quando le cellule PC12 vengono differenziate con NGF cessano di proliferare ed estendono neuriti.

L’acido retinoico, la forma biologicamente attiva della vitamina A, svolge un ruolo importante nello sviluppo embrionale e nella generazione di diversi organi e sistemi (Lòpez-Carballo et al., 2002) e induce differenziazione neuronale mediante interazione con specifici recettori nucleari (RA e RXR-α, β, γ) che fungono da regolatori trascrizionali (Gangadharan et al., 2002).

Nelle cellule di neuroblastoma SH-SY5Y l’acido retinoico induce inibizione della crescita e differenziazione che si manifesta con la crescita di neuriti (Kim et al., 2000) e con la conversione morfologica delle cellule in un fenotipo simil-neuronale (Ammer e Schultz, 1994).

Uno dei bersagli degli eventi regolatori associati alla differenziazione delle cellule SH-SY5Y indotta da acido retinoico è rappresentato dalle proteine G. E’ stato infatti

Introduzione

31 dimostrato che sei giorni di trattamento con acido retinoico 10 µM aumentano in maniera significativa i livelli di proteine G inibitorie (Giα1 e Giα2) mentre riducono i livelli delle proteine Gsα (Ammer e Schultz, 1994).

Uno studio svolto su cellule SH-SY5Y dimostra che il trattamento a lungo termine con acido retinoico porta ad un notevole aumento dei livelli di AMPc. Questo sembra essere dovuto ad un incremento dell’attività dell’adenilato ciclasi indotta dai recettori delle prostaglandine E1 che vanno incontro ad up-regulation. La riduzione delle proteine Gsα potrebbe servire a bilanciare l’eccessiva produzione di AMPc (Ammer e Schultz, 1994).

Le cellule di neuroblastoma rispondono all’AMPc formando estensioni simili a neuriti ed è stato dimostrato che le sostanze che aumentano i livelli intracellulari di AMPc inducono differenziazione neuronale (Sànchez et al., 2004).

Uno studio recente dimostra come sulle cellule SH-SY5Y la differenziazione con acido retinoico provoca una down-regulation e una ri-localizzazione dei geni inibitenti la differenziazione ID1, ID2 e ID3. Sempre in questo studio è stata dimostrata la capacità dell’acido retinoico di fosforilare Akt sulla Ser-473 già dopo 30 minuti di stimolazione. La stimolazione della via PI3K/Akt sembra essere importante ma non sufficiente ad indurre differenziazione (Lopez-Carballo et al., 2002).

1.5.1 Effetto differenziante dell’adenosina

Come detto precedentemente, l’adenosina esplica il suo ruolo neuroprotettivo in condizioni di ischemia e contribuisce allo sviluppo del sistema nervoso mediante i recettori A1 e A2A. L’attivazione dei recettori A1 e A2A nella linea cellulare SH-SY5Y e nelle colture primarie dei neuroni striatali di ratto promuove la neuritogenesi e la differenziazione mediante l’attivazione della via delle MAPK e l’attivazione della proteina chinasi C (PKC), anche se in modo indipendente l’una dall’altra.

Nelle cellule SH-SY5Y i recettori adenosinici mediano la fosforilazione di ERK-1/2 attraverso la classica via Ras/Raf/MEK/ERK ma l’attivazione di questa via da parte dei recettori A1 è indipendente dalla PKA mentre è mediata dalla PKA nel caso dei recettori A2A, che sono accoppiati positivamente all’adenilato ciclasi. Gli agonisti dei recettori A2A, infatti, aumentano le concentrazioni intracellulari di AMPc che di conseguenza attiva la PKA. Inoltre, in queste cellule la fosforilazione di ERK-1/2 è molto sensibile all’inibizione della PKA e ciò suggerisce che l’attivazione delle MAPK è mediata dai recettori A2A.

L’attivazione di ERK-1/2 potrebbe non essere, però, l’unica via coinvolta nella differenziazione morfologica delle cellule SH-SY5Y. L’attivazione della PKC, infatti, è necessaria per indurre neuritogenesi dopo la stimolazione dei recettori adenosinici.

È stato dimostrato che l’attivazione delle diverse isoforme della PKC da parte degli esteri del forbolo induce crescita dei neuriti in questa linea cellulare.

Dato che gli inibitori di ERK e della PKC sono in grado di annullare l’effetto neuritogenico solo se usati in combinazione, è possibile ipotizzare che queste due vie siano indipendenti l’una dall’altra ma che portino, mediante l’attivazione dei recettori adenosinici, a un risultato simile.

L’effetto neuritogenico ottenuto dalla stimolazione contemporanea dei recettori A1 e A2A è simile a quello ottenuto stimolando uno solo dei due recettori e questa mancanza di sinergismo può essere dovuta alle loro reciproche interazioni antagonistiche.

L’adenosina endogena ha maggior affinità per i recettori A1 rispetto ai recettori A2A e ciò suggerisce che in condizioni basali predominino le funzioni mediate dai recettori A1 mentre in condizioni ipossiche o dopo depolarizzazione, quando si verifica un aumentato rilascio di adenosina, acquisterebbe importanza il ruolo dei recettori A2A. Le interazioni antagonistiche tra i due tipi recettoriali fanno sì che basse e alte concentrazioni di adenosina possano stimolare rispettivamente i recettori A1 e A2A.

Dato che la stimolazione di entrambi i tipi recettoriali produce lo stesso effetto differenziante, sia alte che basse concentrazioni di adenosina possono indurre neuritogenesi.

I difetti della crescita dei neuriti sono stati associati alla malattia di Alzheimer e le mutazioni geniche che coinvolgono la differenziazione neuronale causano diverse malattie come ritardo mentale o eteropatie che portano a morte prematura. Per questi motivi i recettori adenosinici potrebbero essere considerati un target per la cura di queste malattie. (Canals et al., 2005).