3. Materiali e Metodi
3.10 Tecniche di Western Blot
L’attivazione della via delle MAP chinasi è stata studiata mediante l’utilizzo della tecnica del western blot e nello specifico le proteine visualizzate sono state Akt-1, p-Akt-1 e l’actina come controllo interno.
3.10.1 Preparazione dei lisati cellulari
Le cellule sono state staccate in PBS mediante uno scraper, raccolte in una provetta da 15 ml e centrifugate a 397 xg per 5 minuti. Successivamente, è stato eliminato il sovranatante, il pellet è stato risospeso in 50 µl di Lysis Buffer con inibitori di fosfatasi (NaF 1 mM; sodio ortovandato 1 mM) e inibitori di proteasi (Protease inhibitor cockatil, Sigma-Aldrich) e trasferito in un microtubo da 1.5 ml. Il microtubo è stato centrifugato a 10000 xg per 10 minuti a 4°C (SIGMA 4K15C-Bio.Tec.). Sul lisato cellulare così ottenuto è stato effettuato il dosaggio delle proteine utilizzando il metodo Lowry già descritto. I campioni sono stati mantenuti a -20 °C. Il giorno dell’esperimento, al volume del campione contenete la quantità di proteina stabilita, è stato aggiunto un volume equivalente di tampone di caricamento costituito da Tris HCl pH 6.8, 1 M, 0.001 % di blu-bromofenolo, glicerolo al 10 %, SDS al 10 % per denaturare le proteine, e β-mercaptoetanolo al 5 % per ridurre i ponti disolfuro.
3.10.2 Elettroforesi delle proteine in gel di poliacrilamide con SDS (SDS-PAGE)
Questa metodica consente di separare proteine di diverso peso molecolare mediante la loro migrazione attraverso le maglie di un gel di poliacrilamide sotto l’azione di un campo elettrico. Ciò è consentito dalla presenza del sodiododecilsolfato (SDS), un detergente anionico capace di complessarsi alle proteine e di conferire loro una carica netta negativa costante per unità di massa. Ne consegue che esse vengono separate sulla base del loro peso molecolare.
E’ stata effettuata una separazione proteica mediante elettroforesi in verticale su gel di poliacrilamide, secondo il metodo di Laemmli (Laemmli et al., 1970).
I campioni, contenenti uguali quantità di proteine del lisato cellulare (70 µg) e sospesi in buffer di caricamento, vengono caricati su gel di poliacrilamide preparati la sera prima o su gel precast (PAGEr® Precast Gels, Lonza Rockland, U.S.A.). Il gel di
Materiali e Metodi
51 poliacrilamide è un gel dello spessore di circa 1 mm formato da un gradiente discontinuo di due gel a pH e concentrazioni di acrilamide diversi: un gel superiore di impaccamento (stacking gel) e uno inferiore di corsa (running gel), dove avviene la separazione delle proteine. Lo stacking gel è stato preparato al 4 % mentre il running gel al 10 % di acrilamide.
Come marcatori dei pesi molecolari sono stati utilizzati il ColorBurstTM Wide Molecular Weight Range, (Sigma-Aldrich, Milano, Italy).
La corsa elettroforetica è avvenuta in una camera per elttroforesi (PAGErTM Minigel Chamber, LonzaRockland, U.S.A.) riempita con il tampone di corsa costituito da 192 mM glicina, 25 mM Tris e 0.1 % SDS. Alla camera elettroforetica è stato applicato un amperaggio di 10 mA per ogni gel per 30 minuti, al fine di favorire l’impaccamento delle bande nello stacking gel; e successivamente, una corrente di 20 mA per 1 ora e 30 minuti, allo scopo di separare le proteine nel running gel.
Figura 13: PAGErTM Minigel Chamber, Lonza Rockland, U.S.A.
3.10.3 Western Blot
Il metodo consiste nell’elettrotrasferimento di proteine dalla matrice del gel di acrilamide, in cui sono state fatte migrare, ad una membrana di nitrocellulosa. Una volta fissate nella membrana, le proteine possono poi essere analizzate per mezzo di anticorpi specifici diretti contro epitopi antigenici esposti dalle proteine stesse.
Il trasferimento delle proteine dal gel alla membrana di nitrocellulosa è stato effettuato mediante un sistema continuo assemblato in un apposito blottatore (YRDIMES, wealtech corp, Lakeside, GA,USA).
E stato allestito un sandwich costituito, nell’ordine dall’anodo al catodo, da 3 fogli di carta da filtro (Blotting Paper, Sigma-Aldrich), dalla membrana di nitrocellulosa (Trans-Blot® Transfer Medium, BioRad), dal gel di poliacrilamide e da altri 3 fogli di carta da filtro. I fogli di carta da filtro sono stati precedentemente immersi per qualche minuto nel tampone di trasferimento (Tris 49.6 mM, glicina 384 mM, 20 % metanolo e 0,01 % SDS), mentre la membrana di nitrocellulosa è stata pre-idratata in acqua bidistillata.
La procedura di blottaggio viene eseguita applicando una corrente di 300 mA per 1 ora e mezza. Il trasferimento delle proteine dal gel è stato a volte verificato colorando la membrana di nitrocellulosa con Rosso Ponceau (0.1 % Ponceau S (peso/vol) in 5 % acido acetico (vol/vol) (Sigma-Aldrich, Milano, Italy), preparato per una colorazione rapida che si ottiene immergendo la membrana per pochi minuti nella soluzione e poi sciacquandola più volte con acqua bidistillata. Per lo studio di P-Akt1 non è stato utilizzato il Rosso Ponceau poiché l’acido acetico in cui è disciolto potrebbe defosforilare le proteine presenti sulla membrana.
La membrana è stata quindi tagliata in base alla corsa delle proteine, identificabili grazie ai marcatori di peso molecolare, e conservata nella soluzione di blocco (5% di latte scremato in polvere (Euroclone, Pavia, Italia) e 0.05 % Tween-20 (poliossimetilene-sorbitanmonolaurato, Sigma-Aldrich, Milano, Italy) in TBS (12.5 mM Tris HCl e 125 mM NaCl a pH 7.4 in acqua bidistillata), a 4 °C overnight.
Il giorno successivo la membrana è stata incubata con gli anticorpi primari: • Anticorpo monoclonale anti-Akt1 (Santa Cruz Tebu-Bio) (dil 1:1000)
• Anticorpo monoclonale anti- phospho-Akt1 (Santa Cruz Tebu-Bio) (dil 1:1000) • Anticorpo anti-actina (Sigma) (1:30000)
L’incubazione degli anticorpi primari è condotta o a 37°C per un’ora o overnight a 4 °C quando il blocco viene effettuato a temperatura ambiente per 1 ora. Dopo ogni incubazione, una serie di lavaggi permette di rimuovere l’anticorpo legatosi alla membrana in modo aspecifico.
Le membrane sono incubate quindi con l’anticorpo secondario per 60 minuti sempre a 37°C (IgG Anti-mouse coniugato con fosfatasi alcalina o perossidasi) diluito da 1:2000 a 1:50000.
Materiali e Metodi
53 I complessi antigene-anticorpo sono analizzati mediante una reazione di chemioluminescenza. Questa reazione avviene in condizione di semibuio bagnando la membrana con una soluzione di Chemioluminescent AP Substrate (ImmobilonTM Western, Millipore).
I prodotti chemioluminescenti di questa reazione vengono visualizzati tramite autoradiografia su lastre CL-X POSURETM FILM (Thermo Scientific).