Emoadsorbimento

Le tecniche fino ad ora descritte si basano su una rimozione per passaggio di fluidi attraverso una membrana; un’altra opzione di depurazione del sangue è invece l’adsorbimento su cartuccia : si pone la cartuccia in diretto contatto con il sangue attraverso un circuito extra-corporeo. L’adsorbimento è definito come la rimozione di una molecola tramite il suo legame con una superficie adsorbente: il quantitativo e la tipologia della sostanza rimossa dipendono da molte varianti

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come legami a idrogeno, interazioni idrofobiche, interazioni elettrostatiche e legami covalenti.

E’ importante sottolineare che le tecniche fino ad ora descritte si basavano su una rimozione NON SELETTIVA dei mediatori della sepsi, tuttavia sappiamo anche che l’endotossina, che è uno dei principali componenti della parete dei Gram- negativi, è uno degli elementi più rilevanti nella patogenesi della sepsi severa e dello shock settico provocato da questo tipo di batteri: Marshall, Foster et al. 102 hanno dimostrato come alti livelli di attività dell’endotossina sono spesso associati a peggiori outcomes clinici. Sono state quindi elaborate tecnologie terapeutiche in grado di assorbire direttamente l’endotossina, in modo tale da rimuovere lo stimolo primo della sepsi.

Il Toraymyxin®

Il Toraymyxin® è un sistema di emoperfusione extracorporea costituito da fibre di polistirene sulle quali è legata covalentemente la Polimixina B, un antibiotico a struttura polipeptidica ciclica cationica derivato dal Bacillus Polymyxa con capacità di legare e neutralizzare l’endotossina. Il lipopolisaccaride viene rimosso dalla circolazione ematica tramite il suo adsorbimento dalla cartuccia di polimixina-B , la superficie di adsorbimento è molto estesa e questo permette di rimuovere fino al 90% dell’endotossina circolante in un breve periodo di tempo. Infatti il trattamento consiste nella applicazione di due cartucce a distanza di 24 ore l’una dall’altra; ciascun trattamento ha una durata di due ore. Questa tecnica è stata introdotta in Giappone nel 1994 e in Europa 10 anni dopo.

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Figura 15 Toraymyxin®

L'indicazione più comune per PMX-HP è rappresentata dallo shock settico derivato da infezioni con focus primitivo a livello addominale. Infatti, in caso di alterazioni della mucosa intestinale, si può avere la traslocazione batterica nel flusso sanguigno. La conseguente attivazione del sistema immunitario può portare all’insufficienza multiorgano (MOF).

Il ruolo dell’endotossina o lipopolisaccaride (LPS) nella sepsi è ben stabilito con oltre 10.000 pubblicazioni in campo medico. Il LPS è un componente chiave della membrana dei batteri Gram-negativi; quando iniettato per via sistemica sia negli animali che nell'uomo, in modo dose-dipendente, induce aumenti della citochine, compresi TNF-α, IL-6 e IL-8. Le risposte cliniche possono includere iperpiressia, brividi, ipotensione, e, a dosi più elevate, shock, insufficienza d'organo e morte. Numerosi studi hanno dimostrato livelli elevati di LPS circolante anche in pazienti con sepsi provenienti non solo da Gram-negativi, ma anche in pazienti con sepsi da Gram-positivi e in quelli in cui le culture non fanno identificare una fonte microbiologica di sepsi. Il probabile meccanismo dell'endotossinemia in questi casi è la traslocazione della flora microbica intestinale secondaria a ipoperfusione. Gli studi sugli animali a sostegno di questa ipotesi hanno incluso quelli che hanno individuato livelli elevati di LPS in circolo dopo clampaggio aortico al di sopra del tripode celiaco. Elevati livelli di endotossinemia sono stati

56 osservati nell'uomo dopo by-pass cardio-polmonare, nei gravi ustionati, nei trapiantati di fegato e nei pazienti politraumatizzati.

Strutturalmente, l’attività biologica del lipopolisaccaride è legata al lipide A, che è una porzione di questa molecola, altamente conservata nelle varie specie di batteri. In particolare, gli aminoacidi idrofobici della polimixina B interagiscono con gli acidi grassi del lipide A dell’endotossina attraverso legami idrofobici, inoltre i gruppi fosfato del lipide A, carichi negativamente, interagiscono con i gruppi aminoacidici della polimixina B attraverso legami ionici e stabilizzano il complesso.

Figura 16 Interazione tra Polimixina - B e Lipide A

In aggiunta, studi hanno dimostrato che la somministrazione sistemica di polimixina-B riduce la risposta del TNF-α all'endotossina ed è in grado di bloccare anche la formazione di complessi LPS-Proteine leganti il LPS attraverso la sua alta affinità di legame per la molecola LPS.

La polimixina-B è un antibiotico nefrotossico e neurotossico se somministrato per via sistemica, ma nel circuito del Toraymyxin se ne sfrutta comunque l’efficacia e tramite adsorbimento selettivo può potenzialmente interrompere la cascata biologica delle sepsi associate ad alti livelli di endotossina, come ad esempio quelle intra-addominali, spesso causate da Gram-negativi.

57 Queste affermazioni sono state rafforzate dallo sviluppo del saggio di attività endotossinica (EAA), che ha permesso la misurazione accurata dei livelli di attività endotossinica in vivo . Aumenti nella EAA correlano bene con lo stato clinico osservato nei pazienti. I livelli di EEA nei pazienti settici ricoverati in terapia intensiva correlano con outcomes negativi, tra cui il rischio di morte e l’aumento della durata della degenza ospedaliera.

E’ importante sottolineare che gli studi hanno dimostrato persistenti aumenti nei livelli di LPS, come misurato dal EEA fino a 3 giorni dopo lo sviluppo iniziale della sepsi grave. Per di più, l'esposizione totale alle endotossine circolanti, misurata dall'area sotto la curva del grafico dei livelli di EAA tracciato nel corso dei primi 3 giorni di ricovero (carico di endotossina), correla con il grado di insufficienza d'organo totale, che a sua volta è il fattore maggiormente correlato con la mortalità nella sepsi.

Infine, le fluttuazioni circolatorie dei livelli di endotossinemia sono state correlate con gli esiti avversi. Questo ha portato all'ipotesi che sia l'eliminazione di alti livelli di endotossine circolanti che la riduzione delle fluttuazioni dei livelli di endotossina nel corso del tempo, possano essere un target terapeutico potenziale.

Figura 17 Curva EAA-Tempo103

Misurando l’attività endotossinica prima e dopo il trattamento si nota una fluttuazione di questo parametro dovuta alla sua ridistribuzione fra i vari compartimenti, questa osservazione rinforza il razionale di effettuare due trattamenti a distanza di 24 ore l’uno dall’altro.

58 Ad oggi, il trattamento emoperfusivo con polimixina B è stato utilizzato in più di 100.000 pazienti con una bassa incidenza di eventi negativi (<1%) e con un alta tollerabilità; le complicanze più comuni sono rappresentate da ipotensione, trombocitopenia e sviluppo di reazioni allergiche.

Non ci sono prove che la polimixina B entri nella circolazione sistemica in quantità significative nei pazienti trattati.

Recentemente, Tani e colleghi hanno testato la capacità di adsorbimento del dispositivo, riferendo che la cartuccia di Polimixina è in grado di intrappolare circa 300.000 unità di endotossina in una sessione di perfusione standard di 2 ore104. Analogamente, la EAA-J studio ha dimostrato una riduzione media assoluta del 20% nei livelli di EEA (da 0,65 a 0,45) in una coorte non selezionata di pazienti settici che hanno ricevuto il trattamento emoperfusivo con Polimixina.

Altri effetti della PMX

E’ stato osservato anche un meccanismo d'azione secondario del filtro di Polimixina B, ovvero questo rimuove anche alcune cellule infiammatorie come monociti e neutrofili105. E’ improbabile che queste cellule infiammatorie vengano rimosse da un legame con la Polimixina B in modo diretto, ma si crede che queste cellule possano rimanere “fisicamente intrappolate” nelle strette maglie del filtro. Riduzioni nel numero di globuli bianchi sono state osservate in alcuni pazienti trattati. La rimozione di cellule infiammatorie attivate può avere l'effetto secondario di ridurre la circolazione di mediatori infiammatori, come le citochine TNF-α e IL-6. Di conseguenza è possibile ridurre l’enorme attivazione della risposta immunitaria sistemica impedendo o rallentando l’instaurarsi dell' insufficienza multiorgano.

E’ interessante notare che il trattamento emoperfusivo con Polimixina-B è stato anche associato con la diminuzione di fattori circolanti apoptotici, quali Fas, Fas- L, Bax, Bcl-2, e con la riduzione dei livelli di apoptosi a livello tubulare e glomerulare renale. Questo a sua volta si associa con una ridotta infiammazione a livello renale e con un miglioramento della funzione renale stessa106 .

59 Inoltre, PMX-HP è stato applicato in pazienti settici con fonte di infezione diversa dall'addome, infatti Tsushima e colleghi hanno utilizzato questa tecnica nell’ARDS indotta da sepsi. [17].

Trials clinici

EUPHAS e ABDO-MIX

Sono stati condotti numerosi trials con lo scopo di dimostrare che la rimozione dell'endotossina circolante dai pazienti affetti da shock settico addominale potrebbe migliorare il loro esito clinico, in termini di disfunzione d’organo e mortalità. Uno dei più importanti è EUPHAS: Early Use of Polymyxin B Hemoperfusion in Abdominal Septic Shock, uno studio randomizzato multicentrico condotto su 64 pazienti in 10 terapie intensive italiane e i cui risultati sono stati pubblicati su JAMA nel 2009. I principali risultati sono stai l’aumento della Pressione Arteriosa Media, la riduzione della necessità di vasopressori, l’aumento del rapporto PaO2/FiO2, nonché un miglioramento nel SOFA score e nella mortalità a 28 giorno: 32% nei pazienti trattati con PMX contro il 53% del gruppo di controllo. Le critiche fatte a questo studio riguardano il basso numero di pazienti e l’impossibilità di mettere in cieco gli operatori107 _.

D'altra parte, lo studio ABDOMIX condotto in Francia, uno studio clinico controllato randomizzato, non ha dimostrato benefici clinici nell'applicazione di PMX-HP in una coorte di pazienti affetti da shock settico indotto da peritonite in pazienti post-chirurgici. Questo studio in realtà è stato molto criticato per diversi motivi: solo 81 dei 119 pazienti trattati hanno completato entrambi i cicli di Polimixina-B, molti di questi hanno interrotto precocemente il trattamento a causa del clotting della cartuccia, probabilmente per un’anticoagulazione sub-ottimale poiché la percentuale di cartucce che hanno riportato clotting è stata significativamente più alta rispetto a quella riportata dallo studio EUPHAS. Infine il numero di lieviti isolati nei campioni dei pazienti trattati con Polimixina-B era significativamente più elevato rispetto al gruppo di controllo. E’ fondamentale notare che una candidosi peritoneale è una condizione che mette a rischio la vita

60 del paziente influenzandone l’outcome e che non è suscettibile di miglioramento con la tecnica di emoadsorbimento con Polimixina-B.

A causa delle evidenze contrastanti date dagli studi EUPHAS e ABDOMIX per quel che riguarda la sepsi con fonte di infezione a livello addominale e in vista di nuove potenziali indicazioni, la reale applicazione della Polimixina non era chiara, così sono stati lanciati altri due importanti trials: EUPHRATES ed EUPHAS 2.

EUPHRATES

EUPHRATES, studio clinico controllato randomizzato (RCT) a doppio cieco, effettuato su pazienti affetti da shock settico mediato da endotossina. Lo studio è stato condotto negli USA e in Canada e ha confrontato l’utilizzo della terapia con Polimixina B in emoperfusione (Toraymyxin®) con la terapia convenzionale, ha concluso la fase di arruolamento pazienti nel 2016. I criteri di inclusione erano la diagnosi di shock settico e una EAA > 0,6.

I risultati principali dello studio EUPHRATES sono stati presentati al 35° Vicenza Course, il 14 giugno 2017 e sono oggetto dell’articolo in corso di preparazione per la sottomissione a una rivista medica scientifica73_{, ma possiamo anticipare} l’evidenza più importante: lo studio ha dimostrato una riduzione della mortalità del 10% a 28 giorni nei pazienti che presentavano EAA compresa tra 0,6 e 0,9.

EUPHAS 2

Il progetto EUPHAS 2 si ripropone di creare un registro internazionale di raccolta dati sui pazienti affetti da sepsi e shock settico da Gram-Negativi a partenza addominale al fine di valutare l’efficacia e il significato biologico della rimozione dell’endotossina nella pratica clinica. Sono inclusi nello studio tutti i pazienti con sepsi e shock settico e alti livelli di attività endotossinica, determinata attraverso l’Endotoxin Activity Assay (EAA) con valori > 0,6.

61 Il progetto è stato diviso in due fasi:

- Fase I, studio retrospettivo volto a raccogliere i dati di almeno 250 pazienti nelle terapie intensive italiane nei tre anni precedenti

- Fase II, ancora in corso, è uno studio prospettico multicentrico, con raccolta dati online in modo tale da includere sia i dati delle UTI italiane che di quelle europee.

Risultati Fase I

Il registro della Fase I di EUPHAS 2 comprende 357 pazienti in Europa e Asia, provenienti da 57 centri diversi. I dati sono stati raccolti tra il gennaio 2010 e il dicembre 2014. I pazienti inclusi nello studio erano affetti da sepsi e shock settico dovuto a Gram-negativi e hanno ricevuto almeno un ciclo di Polimixina-B (PMX). Lo shock settico è stato diagnosticato in 305 pazienti (85,4 % ). La più comune fonte di infezione era quella addominale (44%), seguita da quella polmonare (17,6%). Dopo 72h dal primo ciclo di PMX, alcune componenti del SOFA score sono migliorate significativamente, in particolare le funzioni cardiovascolare, respiratoria e renale. Inoltre la sopravvivenza a 28 giorni è significativamente aumentata: 75% contro il 39% del gruppo di controllo .

Tutti i pazienti sono stati trattati seguendo gli standard di ogni UTI con infusione di fluidi, vasopressori, ventilazione meccanica, terapia antimicrobica, supporto renale CRRT e/o emodialisi108 .

Fase II

La seconda fase dello studio è ancora in corso. I risultati derivanti da questa fase potrebbero essere utilizzati al fine di identificare una sottopopolazione di pazienti che potrebbe beneficiare del trattamento più di altre109 .

Il limite di questa tecnica è che non è integrata con alcun tipo di CRRT, e quindi una volta rimossa l’endotossina, è necessario ultrafiltrare il paziente per la rimozione delle citochine e degli altri mediatori della sepsi, in aggiunta al supporto renale.

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Questo limite è stato parzialmente superato da Oxiris: una tecnica di depurazione di tipo adsorbitivo che presenta sulla superficie della cartuccia un particolare strato di polyethyleneimine ad elevata concentrazione, una molecola biologicamente attiva, con la capacità di adsorbire l’endotossina. Su questo strato, ve ne è un altro in fase di costruzione con eparina a concentrazione dieci volte superiore a quella usata nelle cartucce di questo tipo, ed è biologicamente attivo. Questo permette un aumentato adsorbimento dell’endotossina, con un minor rischio di clotting della cartuccia. Inoltre Rimmele et al . 95 hanno dimostrato su modelli animali che l’adsorbimento può essere aumentato modificando la polarità della membrana, con aumento della risposta terapeutica in termini di riduzione di supporto vasoattivo, acidosi lattica, miglioramento dell’emodinamica etc.

Ad oggi non ci sono studi comparativi nell’ uomo, tra Oxiris e le altre tecniche ma verosimilmente la selettività della membrana riguarda solo uno strato specifico, mentre la cartuccia potrebbe adsorbire anche numerosi mediatori in maniera non selettiva.

Coupled Plasma Filtration Adsorption (CPFA)

Tutte le tecniche fino ad ora descritte si basano sulla purificazione del sangue. Esiste però un sistema di depurazione extracorporea che associa allo scambio diffusivo-convettivo e all’adsorbimento su cartuccia anche la plasma filtrazione: la Coupled Plasma Filtration Adsorption (CPFA) Il procedimento usa inizialmente un plasmafiltro (Polietersulfone da 0,45 m2 di superficie, dotato di un cut-off di circa 800 kDa) per separare il plasma dal sangue; il plasma attraversa poi una cartuccia di resine idrofobiche (140 mL per 70g, con una superficie adsorbente di circa 700 m2/g) in grado di adsorbire un ampio range di mediatori pro e anti infiammatori; infine il plasma filtrato viene reinfuso nella linea ematica del circuito dove passa attraverso un secondo filtro (in Polisulfone ad alta permeabilità di 1 m2) che provvede alla depurazione per convezione, al bilancio idrico e a quello dell’equilibrio acido-base.

Uno degli aspetti innovativi di questa tecnica è l’applicazione sulla superficie adsorbente del plasma al posto del sangue. Questo aspetto presenta numerosi

63 vantaggi: non presenta problemi di biocompatibilità e soprattutto permette di utilizzare un flusso lento di plasma con conseguente aumento del tempo di contatto tra i mediatori infiammatori e la superficie adsorbente con conseguente massimizzazione dell’adsorbimento110_.

La reinfusione post-diluizione può essere impostata fino a 4 L/h; il flusso del sangue solitamente è tra i 150-180 ml/min mentre il tasso di filtrazione del plasma viene mantenuto tra il 15 e il 20% del flusso di filtrazione del sangue; il trattamento dura 8- 10 ore dopodiché la cartuccia diventa satura.

La resina è in grado di adsorbire un gran numero di mediatori dell’infiammazione, indipendentemente dall’eziologia della sepsi.

Mediatori Adsorbiti

Interleukin 1-β Interleukin 5 Interleukin 6 Interleukin 7 Interleukin 8 Interleukin 10 Interleukin 12p70 Interleukin 16

Interleukin 18

Macrophage inflammatory protein-α (MIP-α) Macrophage inflammatory protein-β (MIP-β)

Tumor necrosis factor-α (TNF-α)

Monocyte chemotactic protein (MCP-1) Epithelial neutrophil activating peptide 78 (ENA-78)

RANTES

Vi sono molte evidenze 111,112 a dimostrazione dell’impatto della CPFA nella terapia dello shock settico: questa tecnica sembra infatti incrementare in modo significativo alcuni parametri dell’emodinamica sistemica e della funzionalità respiratoria (pressione arteriosa media, indice cardiaco, resistenze vascolari periferiche, PaO2/FiO2), con parallela riduzione della terapia di supporto vasoattivo, fino alla totale sospensione.

Inoltre la CPFA sembra migliorare la perfusione splancnica, contribuendo a risolvere lo stato iperdinamico e di vaso paralisi, proprio dello shock settico113 . C. Ronco et al.112 hanno descritto come la CPFA, tramite la rimozione non

64 selettiva di citochine pro e anti infiammatorie, permetta una sorta di immunomodulazione, con significativa attenuazione della risposta di fase acuta e ripristino dell’equilibrio del sistema immunitario. Inoltre la sepsi spesso induce uno stato immunosoppressivo sui macrofagi, che perdono la loro capacità di produrre TNF-α: questo determina una mancata risposta ad eventuali secondari insulti batterici, e spesso porta ad un outcome peggiore: Bellomo, Ronco et al. hanno dimostrano che i macrofagi contenuti nel sangue trattato con CPFA recuperano la loro capacità produttiva e responsiva all’insulto112 .

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