Espressione di Xdach durante lo sviluppo

Per clonare il gene dachshund in Xenopus ho utilizzato la “Rapid Amplification of cDNA Ends” (RACE); tale tecnica è una PCR che consente di amplificare sequenze nucleotidiche comprese tra una regione interna nota e l’estremità (5’ o 3’) del gene di interesse.

Per designare i due oligonucleotidi da utilizzare come primers interni, ho confrontato le sequenze dei geni dachshund di Drosophila, pesce zebra, pollo, topo e uomo con il programma ClustalW alignment; inoltre, tale programma è in grado di creare alberi filogenetici radicati, calcolati tramite l’algoritmo di neighbour-joining clustering, in cui la lunghezza di ogni ramo è proporzionale alla distanza evolutiva. In base a questo confronto ha messo in evidenza numerose regioni che presentavano un’elevata similarità di sequenza nucleotidica; due di queste regioni, di circa 20 nucleotidi e localizzate in prossimità del DACHbox-N, erano identiche nel topo, nel pollo e nel pesce zebra. Tali sequenze nucleotidiche sono state utilizzate per designare i due primers, chiamati dachshund up e dachshund down. L’efficacia di questi primers è stata valutata in RT-PCR, eseguita su RNA totale isolato da omogenati di retine larvali di X. laevis, tessuto in cui

dachshund è espresso ad alti livelli negli altri Vertebrati. Tale PCR ha

prodotto due amplificati, come evidenziato dalla corsa elettroforetica su gel d’agarosio all’1%; i prodotti di PCR ottenuti sono stati clonati e sequenziati. I due cDNA, lunghi rispettivamente 350 e 506 nucleotidi (Fig. 51), avevano, come atteso, un’alta similarità di sequenza con la regione localizzata in prossimità del DACHbox-N del gene dach del topo e del pollo; quindi ho designato i primers specifici, dach forward e dach reverse, per la RACE 5’ e 3’ scegliendoli all’interno delle sequenze dei due cDNA precedentemente sequenziati.

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Fig. 51. A. Confronto tra le sequenze dei geni dachshund 1 di topo e di pollo. B. RT-PCR. Per la PCR-RACE ho utilizzato il kit SMART RACE della Clontech, che prevede una prima fase di sintesi di cDNA in seguito a retrotrascrizione e una seconda fase di amplificazione delle estremità del gene. Nella prima fase, vengono prodotte due distinte popolazioni di cDNA, una che presenta una specifica sequenza di 25 nucleotidi (inserita utilizzando l’oligo SMART II) all’estremità 5’, l’altra che presenta la stessa sequenza all’estremità 3’ (inserita utilizzando l’oligo 3’ CDS). Successivamente, si amplificano le estremità del gene che si vuole clonare utilizzando l’oligo UPM (universal primer mix, presente nel kit), complementare alla specifica sequenza di 25 nucleotidi, posta al 5’ di una popolazione di cDNA e al 3’ dell’altra, e i due oligo gene-specifici dach forward e dach reverse precedentemente designati.

A

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Nella 5’ PCR-RACE, i primer dach reverse e UPM consentono di produrre un frammento di 927 nucleotidi, mentre i primer dach forward e UPM, utilizzati nella 3’ PCR-RACE, amplificano due frammenti di 1346 e di 1190 nucleotidi. Il prodotto di PCR ottenuto nella 5’-RACE presentava una regione di sovrapposizione con i prodotti di PCR della 3’-RACE e sfruttando la presenza di tale regione è stato possibile dedurre le sequenze di due cDNA di 2273 e di 2117 pb. Successivamente, è stato possibile amplificare i due cDNA “full-lenght” utilizzando due primers localizzati, uno in prossimità del 5’ (dach 10 forward) e l’altro in prossimità del 3’ (dach 2200 reverse).

I prodotti di PCR sono stati clonati nel vettore pDrive. Le sequenze dei due cloni sono state depositate in banca dati (EMBL) con il nome di XdachA (ac: AJ555469) e XdachB (ac: AJ555540); il primo contiene una “open reading frame” (ORF) che si estende dal nucleotide 259 al 2088 e codifica per una proteina di 610 amminoacidi, il secondo è caratterizzato da una ORF che va dal nucleotide 259 al 1932 e codifica per una proteina di 558 amminoacidi. XdachA e XdachB hanno una sequenza identica, fatta eccezione per una regione di 156 nucleotidi, assente in XdachB. Anche in altri Vertebrati, sono presenti più forme del gene Dach (Dach1 e Dach2 nel topo e nel pollo, DachA, DachB e DachC nel pesce zebra), e come XdachA e

XdachB sono caratterizzate da una notevole similarità di sequenza.

Il confronto con le sequenze amminoacidiche delle proteine Dach degli altri Vertebrati, compiuto con il programma ClustalW alignment, evidenzia che le proteine putative codificate dai due cDNA di Xenopus presentano un’elevata similarità con le proteine codificate dai geni Dach1 di topo (circa 70%) e di pollo (circa 60%), e una bassa similarità con le proteine dac di

Drosophila (circa 30%) e di Zebrafish (circa il 50%). Le proteine della

famiglia dachshund sono proteine nucleari che contengono due domini conservati chiamati DACHbox-N, in quanto localizzato in prossimità dell’estremità amino-terminale, e DACHbox-C localizzato in prossimità dell’ estremità carbossi-terminale; il DACHbox-N contiene un dominio di legame al DNA, avente una struttura α/β compatta (Kim et al., 2002), mentre il DACHbox-C, caratterizzato dalla presenza di α-eliche ad avvolgimento- avvolto, media l’interazione con altre proteine. Le due proteine DACH di

Xenopus presentano un’elevata similarità (circa il 95%) a livello del

DACHbox-N con le proteine DACH conosciute, (Fig. 52) e una bassa similarità (circa il 30%) a livello del DACHbox-C. Per compiere test funzionali, che prevedono l’inattivazione o la sovraespressione, ho clonato i geni XdachA e XdachB nel vettore di espressione CS2+.

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Fig. 52. Confronto delle sequenze aminoacidiche del Dachbox-N (A). Relazioni filogenetiche

tra i geni dach conosciuti (B).

Xenopus DachA ---LPGKPVYSTPSPVENIPQNNECRMVELRGAKVASFTVETCELICL Xenopus DachB ---LPGKPVYSTPSPVENIPQNNECRMVELRGAKVASFTVETCELICL murine Dach1 ---SCGPLPGKPVYSTPSPVENTPQNNECKMVDLRGAKVASFTVEGCELICL chicken Dach1 ---LPGKPVYSTPSPVENTPQNNECKMVDLRGAKVASFTVEGCELICL medaka olDach ---AKPVYATASPVESTPQNNECKLVEVKGAKLASFTVKDRELICL zebrafish DachC ---LPHKPVYSTPSPVENTPQNNECKMVEVRGAKLASFTVNGNELICL murine Dach2 ---TNTNECRMVDMHGVKVASFLMDGQELICL zebrafish DachA ---VHNNECKMVEVHGVKVASFTVDGQELICL zebrafish DachB ---TTNECKIVEVHGVKVASFSVDGQELICL Drosophila dac HHASPLELMAAAHHHVPPRSYNSPPPISTSDPSANECKLVEYRGQKVAAFIISNETMLCL **** ** * *** * ***

Xenopus DachA PQAFDLFLKHLVGGLHTVYTKLKRLEISPVVCNVEQVRILRGLGAIQPGVNRCKLISRKD Xenopus DachB PQAFDLFLKHLVGGLHTVYTKLKRLEISPVVCNVEQVRILRGLGAIQPGVNRCKLISRKD murine Dach1 PQAFDLFLKHLVGGLHTVYTKLKRLEITPVVCNVEQVRILRGLGAIQPGVNRCKLISRKD chicken Dach1 PQAFDLFLKHLVGGLHTVYTKLKRLEITPVVCNVEQVRILRGLGAIQPGVNRCKLISRKD medaka olDach PQAFDVFLKHLVGGLHTVYTKLKRLDITPVVCNVEQVRVLRGLGAIQPGVNRCKLISRKG zebrafish DachC LQAFDLFLKHLVGGLHTVYTKLKRLEITPVVCNVEQVRILRGLGAIQPGVNRCKLISRKD murine Dach2 PQVFDLFLKHLVGGLHTVYTKLKRLDISPVVCTVEQVRILRGLGAIQPGVNRCKLITRKD zebrafish DachA PQVFDLFLKHLVGGLHTVYTKLKRLDICPVVCTVEQVRILRGLGAIQPGVNRCKLITRKD zebrafish DachB PQVFDLFLKHLVGGLHTVYTKLKRLDINPVVCTVEQVRVLRGLGAIQPGVNRCKLISRKD Drosophila dac PQAFELFLKHLVGGLHTVYTKLKRLDIVPLVCNVEQVRILRGLGAIQPGVNRCKLLCCKD * * ******************** * * ** ***** **************** *

Xenopus DachA FETLYNDCTNA---SSRPGRPPKRTQSVTSSDNPHIMPH--- Xenopus DachB FETLYNDCTNA---SSRPGRPPKRTQSVTSSDNPHIMPH--- murine Dach1 FETLYNDCTNA---SSRPGRPPKRTQSVTSPENSHIMPH--- chicken Dach1 FETLYNDCTNA---SSRPGRPPKRTQSVTSPENSHIMPH--- medaka olDach FETLYNDCTNA---SSRPGRPPKRTQSVTSTENPHIMPH--- zebrafish DachC FEVLYNDCTNA---SSRPGRPPKRTQNVTSPDSPHVLPH--- murine Dach2 FETLFTDCTNARRKRQM---TRKQAVNSSRPGRPPKRSLG-VLQDNARLLPH--- zebrafish DachA FETLYNDCTNA---SSRPGRPPKRSLGVAMQDSSRLLPH--- zebrafish DachB FEALYNDCTNA---SSRPGRPPKRSYGASVQESPRILHH--- Drosophila dac FDILYRDCTTARCLSIKPPESNSLQFRSSRPGRPPKRGPVGLSLPPTHLSQHPQLKKHRL * ** *** * **********

A

B

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Analisi dell’espressione genica

Ho analizzato l’espressione dei geni dach in ibridazione in situ e in RT- PCR sia su embrioni (dallo stadio 12 allo stadio 34) (Nieuwkoop e Faber, 1956) che su larve (dallo stadio 50 allo stadio 56).

Per le ibridazioni in situ ho usato una sonda antisenso, diretta contro una regione condivisa dai geni XdachA e XdachB. Come descritto in Materiali e Metodi, tale sonda era coniugata con digoxigenina e la sua presenza era messa in evidenza con un anticorpo anti-DIG coniugato con la fosfatasi alcalina, con BM purple come substrato; i tessuti positivi alla sonda presentavano una colorazione blu.

Ibridazioni in situ

Su embrioni

In whole mount (Fig. 53), la prima espressione dei geni dach si osserva allo stadio di neurula tardiva (st. 22) nella regione anteriore delle vescicole ottiche. Allo stadio 24, i geni Xdach sono espressi nella regione mediale del prosencefalo e nel territorio presuntivo della retina neurale. Dallo stadio 30, l’espressione di Xdach si estende al romboencefalo e alla parte più interna della coppa ottica; a questo stadio è anche evidente un’elevata espressione nella vescicola otica che ormai è completamente separata dall’epidermide. Allo stadio 34 l’espressione dei geni dach permane costante nel cervello e nella retina, mentre la presenza dei trascritti diminuisce nella vescicola otica; inoltre a questo stadio sul fianco dell’embrione si evidenzia una leggera ma circoscritta positività alla sonda nella regione del pronefro e del dotto di Wolff.

Per una più precisa localizzazione del segnale, alcuni embrioni, dopo l’ibridazione in situ whole mount, sono stati disidratati in alcool, inclusi in

paraffina e tagliati al microtomo in sezioni seriate di 7 _{µm di spessore. Allo}

stadio 22 risulta evidente la positività alla sonda per Xdach sull’intera vescicola ottica; a questo stadio risulta positivo anche il placode lentogeno ancora largamente in contatto con l’ectoderma, ma già chiaramente delaminato in una parte più esterna, negativa alla sonda, e una parte più interna, rivolta verso la vescicola ottica, positiva a Xdach (Fig. 54). A stadi di sviluppo più tardivi (st. 34), quando iniziano i primi processi di differenziamento e la conseguente stratificazione delle cellule retiniche, il

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trascritto per Xdach si localizza nella parte anteriore della coppa ottica; a questo stadio, l’abbozzo del cristallino, che si è appena distaccato dall’ectoderma e incomincia a sintetizzare le sue proteine specifiche (cristalline), è negativo alla sonda (Fig. 54).

Fig. 53. Ibridazione in situ whole mount: analisi dell’espressione dei geni Xdach su embrioni