Specificità dell’anticorpo monoclonale mAbH
Come già descritto in Materiale e Metodi, la selezione dell’anticorpo monoclonale mAbH è stata effettuata in immunoistofluorescenza indiretta su sezioni di occhi di larve di Xenopus laevis, usando come anticorpo secondario un anticorpo anti-immunoglobuline di topo coniugato con rodamina. Tale tecnica rivela l’alta specificità di mAbH nei confronti del cristallino. Si può osservare un’intensa fluorescenza nelle fibre del cristallino; le altre componenti dell’occhio, quali la sclerotica, la cornea esterna, la cornea interna, l’epitelio pigmentato e la retina neurale, sono completamente negative. Come controllo negativo, a mAbH è stato sostituito il sopranatante d’altra specificità, proveniente da una precedente fusione. Dopo immunofluorescenza indiretta con tale anticorpo, il cristallino così come le altre strutture oculari risultavano completamente negative. I risultati in immunofluorescenza sono sovrapponibili ai risultati ottenuti in immunoistochimica, dove come anticorpo secondario è stato usato un anticorpo anti-immunoglobuline di topo coniugato con la perossidasi (AEC come substrato) (Fig.23).
Fig. 23. Immunolocalizzazione di mAbH su sezioni di occhio di X. laevis, in
immunoistochimica (A e B) e in immunofluorescenza (C). In B mAbH non reagisce con l’epitelio della lente.
La specificità di mAbH è stata confermata in Western blotting. In Fig. 24, sono mostrati un gel elettroforetico e il rispettivo immunoblot, ibridato con
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mAbH (sopranatante di coltura intero), nei quali, nelle corsie b, c, d, compaiono gli estratti solubili di lente, rispettivamente di Xenopus laevis larvale (st. 50), di Xenopus laevis metamorfosato, e di Xenopus laevis adulto e nella corsia e estratti di vari tessuti sempre di Xenopus laevis. Come si può osservare, mAbH ibridizza positivamente solo con l’estratto solubile di lente, mentre l’estratto solubile proveniente da tessuti diversi dalla lente, anche se
caricato nel gel ad alte concentrazioni (fino a 50 µg totali), non presenta mai
alcuna reattività con l’anticorpo. Inoltre, mAbH è immunolocalizzato in una banda ben distinta di circa 30 KDa.
Fig. 24. Gel elettroforetico (A) e relativo immunoblot (B) (ibridato con mAbH) di estratti di
lente (b,c,d) e di altri tessuti (e) di X. laevis.
Sempre in Western Blott, estratti di lente di rana e tritone risultano negativi a mAbH. Da tali esperimenti risulta che mAbH reagisce solo con estratti solubili di lente di Xenopus laevis.
Risposta all’anticorpo monoclonale mAbH durante lo sviluppo del cristallino
Fino allo stadio 25, l’ectoderma presuntivo e il placode lentogeno sono negativi alla immunoreazione con mAbH. La prima reazione positiva si osserva solo allo stadio 26, in cui è presente una debole immunoreazione a mAbH in alcune cellule situate nella porzione periferica dell’abbozzo lentogeno prospiciente la retina presuntiva e in alcune cellule situate all’interno dell’abbozzo stesso.
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Dallo stadio 29-30, appare molto più estesa la positività a mAbH nella massa di cellule centrali e nella parte posteriore dell’abbozzo della lente prospiciente la retina presuntiva (Fig. 25).
Fig. 25. Ontogenesi del cristallino di X. laevis in immunoistochimica con mAbH, st. 27/29.
Negli stadi successivi, la positività si estende alla zona in cui le cellule dell’abbozzo lentogeno si differenziano nelle fibre del nucleo primario.
Dallo stadio 45 in poi, la lente è completamente differenziata essendo costituita oltre che dall’epitelio della lente e dal nucleo primario, anche da fibre secondarie disposte all’esterno del nucleo primario. La positività a mAbH interessa l’intera lente, escluso l’epitelio. Negli stadi larvali successivi e nell’adulto, il quadro immunoreattivo rimane invariato.
Risposta all’anticorpo monoclonale mAbH durante la rigenerazione del cristallino
Nel processo rigenerativo, sia in immunofluorescenza che in immunoistochimica, la prima positività si osserva intorno allo stadio 3 (secondo Freeman, 1963). L’immunoreazione è localizzata in poche cellule di un’area dell’abbozzo della lente più prossima alla retina, dove si svilupperanno le fibre primarie della lente. Con l’ulteriore differenziamento dell’abbozzo lentogeno (stadio 4), sempre più cellule dell’area delle fibre primarie mostrano una immunoreazione positiva, mentre la parte della vescicola lentogena, prossima alla cornea, che darà l’epitelio della lente, permane negativa.
Dallo stadio 5 precoce, allorché cominciano a differenziarsi le fibre secondarie dalla zona equatoriale, sia le fibre primarie organizzate a costituire il nucleo primario, che le fibre secondarie, mostrano una più intensa immunoreazione. Allo stadio 5 tardivo, l’intensità della
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immunoreazione a mAbH aumenta nell’area delle fibre sia primarie che secondarie, mentre l’epitelio della lente permane negativo (Fig. 26).
Fig. 26. Rigenerazione del cristallino: immunofluorescenza indiretta con mAbH (A) e
corrispondente sezione in ematossilina/eosina (B).
Espressione di pax6 durante lo sviluppo dell’occhio
In accordo con quanto descritto da Hirsch e Harris (1996) e da altri autori (Mizuno et al., 1999) ho osservato che nell’embrione di X. laevis,
pax6 è espresso dallo stadio 28-30 nel cervello anteriore e posteriore e, dopo
lo stadio 42, anche nel midollo spinale; invece nel mesencefalo tale gene è inattivo. Il trascritto di pax6 è presente anche nella retina e nel placode lentogeno. Durante l’ontogenesi, pax6 modifica il suo quadro d’espressione: nella fasi embrionali tardive il cristallino e la cornea non esprimono più
pax6, mentre la retina continua ad esprimerlo a livello dello strato nucleare
interno, e dello strato delle cellule gangliari. Nei successivi stadi larvali, il trascritto di pax6, ad eccezione di una debole positività nel diencefalo e nel cervelletto, è assente nel cervello e nel midollo spinale, mentre permane nella retina neurale.
Il controllo negativo, costituito da una sonda senso per pax6, non ha evidenziato alcuna reazione positiva in ibridazione in situ.
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Fig. 27. Ibridazione in situ: espressione di pax6 in un embrione stadio 28 (A), nell’occhio in
sviluppo (B) e in quello larvale (C). gc, ganglio cerebrale; gr, ganglio retinico.
Espressione di pax6 durante la rigenerazione del cristallino
Nel lotto di controllo, costituito da larve sottoposte a semplice lentectomia attraverso il foro pupillare, già dopo un giorno dall’asportazione della lente, la zona della cornea esterna prospiciente il foro pupillare presenta un’accentuata positività alla sonda antisenso per pax6. Dopo 3 giorni dall’operazione, la positività alla sonda per pax6 diviene ben evidente in tutte le cellule della vescicola lentogena allo stadio 3. Nei giorni successivi (dopo il quinto giorno), quando è in corso il differenziamento delle fibre della lente rigenerante (stadio 4), la positività per la sonda per
pax6 diminuisce gradualmente, fino a scomparire a differenziamento
ultimato (Fig. 28).
Fig. 28. Ibridazione in situ su sezione con sonda antisenso per pax6: rigenerazione della lente
dalla cornea esterna (3gg). La freccia indica un aggregato sferoidale di cellule della cornea in attiva proliferazione; tali cellule esprimono pax6.
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Analisi delle interazioni tissutali responsabili del mantenimento
della capacità lentogena nell’area lentogenica larvale
Esperimento I: Impianto della cornea esterna di larve donatrici allo