Alcuni Autori hanno voluto identificare la presenza di alterazioni del proteoma mitocondriale coinvolte negli eventi cardioprotettivi (Wong et al, 2010).
È noto che il fosfatidil inositol 3 kinase (PI3-kinase) gioca un ruolo chiave nelle segnalazioni del precondizionamento, portando alla fosforilazione ed inattivazione della glicogeno sintasi chinasi GSK-3β (Tong et al, 2002)
È noto che la fosforilazione della Ser9 della GSK-3β prima dell'ischemia riduce la dimensione dell'infarto dopo ischemia-riperfusione (I/R) nel cuore e l’inibizione a breve termine di GSK-3β con agenti farmacologi imita gli eventi di cardioprotezione che si verificano nel precondizionamento. È stato inoltre dimostrato che l'aggiunta di inibitori di GSK-3β all'inizio della riperfusione riduce le dimensioni dell’infarto in cuori di ratto (Gross et al, 2004). È stato suggerito che l’inibizione GSK-3β da parte di fosforilazione della Ser9 riduce l’apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale in cardiomiociti (Juhaszova et al, 2004).
Wong e collaboratori (2010) hanno ipotizzato che sia il precondizionamento, sia l’inibizione farmacologica di GSK-3β portino ad una serie di modifiche nel proteoma mitocondriale, alcune delle quali non saranno coinvolte nella cardioprotezione. Tuttavia, concentrandosi sulle alterazioni al proteoma comuni nel precondizionamento e nell’inibizione farmacologica di GSK-3β, è possibile individuare modifiche che potrebbero essere coinvolte nella cardioprotezione.
Per individuarle, Wong e collaboratori (2010) hanno utilizzato cuori di Langendorff di topi, divisi in 3 gruppi e trattati come segue:
• gruppo di controllo: perfusione per 55 minuti con buffer di equilibrazione, • gruppo sottoposto a precondizionamento: 15 minuti di equilibrazione, quindi
trattamento con 4 cicli composti da 5 minuti di ischemia, seguiti da 5 minuti di riperfusione
• gruppo trattato farmacologicamente: perfusione per 45 minuti con buffer di equilibrazione quindi trattamento per 10 minuti con inibitore farmacologico della GSK-3β: AR-A014418 (GSK Inhib VIII)
Il proteoma cardiaco e la cardioprotezione
Dopo questi trattamenti preliminari, entrambi i 3 gruppi sono stati sottoposti a 20 minuiti di ischemia e quindi perfusi per 120 minuti.
È stato confermato il dato secondo cui l’inibizione della GSK-3β è cardioprotettiva nei topi, misurando il recupero della pressione ventricolare sinistra dopo riperfusione di 120 minuti e comparandolo con lo stesso parametro rilevato alla fine del trattamento di equilibrazione. Il gruppo precondizionato ed il gruppo trattato con inibitore della GSK- 3β esibivano un recupero della pressione ventricolare sinistra di oltre il 50 %; il gruppo di controllo esibiva un recupero del 33% circa. Inoltre è stata misurata la percentuale di necrosi cardiaca nei 3 gruppi, la quale era significativamente inferiore sia nei gruppi precondizionati sia in quelli trattati con inibitore di GSK-3β rispetto al controllo (Wong et al, 2010).
Infine sono stati misurati i livelli di lattato al termine del trattamento di ischemia di 20 minuti, nei 3 gruppi, rilevando che i livelli erano significativamente inferiori rispetto al controllo sia nel gruppo precondizionato, sia nel gruppo trattato con inibitore della GSK-3β. Il lavoro di Wong e collaboratori ha quindi confermato il dato già noto in letteratura secondo cui il trattamento di precondizionamento migliora il recupero funzionale, riduce le dimensioni dell’infarto e diminuisce la produzione di lattato durante l’ischemia e che tali effetti si ottengono anche con l’inibizione della GSK-3β. Dal momento che l’effetto cardioprotettivo si è manifestato sia nel gruppo precondizionato, che nel gruppo trattato farmacologicamente con inibitore di GSK-3β, è stato logico ipotizzare che le variazioni comuni nel proteoma dei due gruppi fossero coinvolte nel meccanismo cardioprotettivo.
Wong e collaboratori hanno quindi identificato cinque proteine che avevano lo stesso andamento nei 2 gruppi: la subunità Va e VIb della citocromo c ossidasi, il fattore 6 di accoppiamento dell’ATP sintasi, la subunità 6 del complesso citocromo bc1 (o complesso III) ed il citocromo c . Di queste cinque proteine, le prime quattro elencate erano presenti in quantità maggiore rispetto al gruppo di controllo, mentre i livelli dell’ultima proteina elencata erano diminuiti . (Fig.15).
Fig. 15- Proteine che mostrano lo stesso andamento sia nel gruppo precondizionato,
che nel gruppo trattato con inibitore della GSK-3β. (Tratto e modificato da Wong et al 2010)
È stato indagato inoltre, se una modifica post-traduzionale come la fosforilazione potesse essere associata con questa alterata espressione proteica osservata nei due gruppi rispetto al gruppo di controllo. Effettivamente nel lavoro di Wong e collaboratori è stato riscontrato un aumento della fosforilazione della subunità Va della citocromo c ossidasi, della subunità VIb della citocromo c ossidasi e del citocromo c rispetto al gruppo di controllo (Wong et al, 2010). I dati riportano un aumento della fosforilazione del citocromo c, il che sembrerebbe produrre un incremento della sua degradazione, poichè esso è diminuito nel gruppo precondizionato ed in quello trattato con inibitore della GSK-3β (Fig.16). Non è stato invece trovato un incremento della fosforilazione della subunità 6 del complesso citocromo bc1 né del fattore 6 di accoppiamento dell’ATP sintasi.
In conclusione, i risultati di questo studio dimostrano quindi che il precondizionamento e il trattamento con l’inibitore della GSK-3β modificano il proteoma mitocondriale rispetto al gruppo di controllo; in particolar modo viene alterata l’abbondanza delle subunità costituenti i complessi della catena di trasporto elettronica mitocondriale (Wong et al, 2010).
Il proteoma cardiaco e la cardioprotezione
Fig. 16 - D) Aumento della fosforilazione della subunità Va della citocromo c ossidasi;
E) Aumento della fosforilazione della subunità VIb della citocromo c ossidasi F) Aumento della fosforilazione del citocromo c rispetto al gruppo di controllo
G): dimuzione della quantità di citocromo c nel gruppo precondizonato e in quello trattato con inibitore di GSK-3β
5 Conclusione
Dai dati raccolti in letteratura in questo lavoro di tesi, si possono trarre alcune conclusioni:
• il mitocondrio delle cellule cardiache è sicuramente uno dei bersagli chiave sia del danno cellulare, sia dei meccanismi coinvolti negli eventi di protezione cellulare.
• La continua evoluzione delle strategie di proteomica consentirà di conoscere in futuro in modo più esatto le modifiche al proteoma ed il loro significato in termini di cardioprotezione.
• Le tecniche più utilizzate per lo studio del proteoma prevedono la separazione delle proteine mediante elettroforesi 2D e identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa.
• Molte sono le alterazioni che si verificano a carico del proteoma mitocondriale cardiaco. La maggior parte di queste necessita ancora di una completa delucidazione, sia per quanto riguarda il meccanismo con cui si verificano, sia per quanto riguarda il ruolo funzionale dell’alterazione.
• Cx43, PKCε e AKT sono state localizzate a livello mitocondriale. È stato visto che PKCε fosforila ALDH2 determinando una minor produzione dei ROS. Inoltre PKCε interagisce e forma complessi con un grande numero di altre proteine. PKCε fosforila ERK attivandolo.
• AKT ed ERK fosforilano ed inibiscono la GSK-3β. L’inibizione di GSK-3β interferisce con l’apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale. GSK-3β fosforila la proteina proapoptotica BAX impedendone l’attivazione.
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