EXPERIMENTAL DESIGN

Il software che è stato utilizzato dall’Università di Genova per l’elaborazione del disegno sperimentale è Matlab con il “chemometrics toolbox” scaricabile dal sito www.chemometrics.it, che permette un’analisi quantitativa e qualitativa.

Come miglior compromesso tra qualità dell’informazione e lavoro sperimentale è stato scelto un disegno fattoriale intero a 2 fattori e 3 livelli [1, 2]. Questo tipo di disegno fornisce informazioni sulla stima dei 2 fattori specificati secondo 3 livelli e delle possibili interazioni dei loro effetti sulla risposta sperimentale.

Le prestazioni del modello sono state calcolate per mezzo del RMSEC (root mean square error in calibration) e del RMSECV (root mean square error in cross validation). Per stimare l’RMSECV, sono stati calcolati

tanti modelli quanti esperimenti eseguiti escludendo ogni volta un esperimento, il cui responso è stato poi predetto.

L’RMSECV è definito come:

N y y RMSECV N i i i

∑

dove yi è il responso sperimentale osservato per l’esperimento i, yi

∧

è il corrispondente responso teorico, stimato mediante il modello applicato e N è il numero degli esperimenti.

Le prestazioni del biosensore sono state valutate misurando le correnti di stato stazionario a +0.45 V per concentrazioni crescenti di glucosio in PBS 0.1 M. Le aliquote di glucosio sono state aggiunte a PBS operando in condizioni idrodinamiche (ω = 200 rpm) e si è misurato il corrispondente valore di corrente. La curva di calibrazione è stata ottenuta, come già descritto nei capitoli precedenti, dai valori di corrente di stato stazionario (IL) a cui viene sottratto il valore di corrente

registrato per la sola PBS (I bianco), IL-Ib, in funzione della concentrazione

di glucosio (mM). La pendenza della parte lineare della curva di calibrazione fornisce la sensibilità del biosensore che è la misura fisica che si è presa in considerazione, come responso sperimentale.

L’elettrosintesi è stata effettuata in condizioni potenziostatiche, in una soluzione contenente GOx, Ni(NO3)2 e Al(NO3)3 in KNO3 (0.3 M), con

un elettrodo di Pt rotante (RDE) al fine di garantire l’omogeneità della sospensione di elettrosintesi e, di conseguenza, una quantità riproducibile di enzima intrappolato.

Per stabilizzare il biofilm HT-GOx su Pt e impedire il rilascio di enzima in soluzione, tutti gli elettrodi sono stati mantenuti per circa 60 minuti in atmosfera satura di vapori di glutaraldeide (GA). Si è optato per tale metodo poichè la reticolazione tra i gruppi amminici dell’enzima e la GA è un sistema di stabilizzazione di facile realizzazione che garantisce

Si è effettuato uno studio preliminare considerando i seguenti fattori: tempo di deposizione (30 - 120 s), concentrazione enzimatica (0.5 - 3.0 mg/mL), rapporto molare Ni/Al (3:1 o 2:1) della soluzione di elettrosintesi per una concentrazione totale di Ni e Al pari a 0.03 M e pH della soluzione di lavoro (5.5-7.0).

Sulla base dei risultati di questo studio e a quelli ottenuti precedentemente tramite analisi monovariata, si è concluso quanto segue: - la concentrazione di enzima nella soluzione di elettrodeposizione è un fattore fondamentale per la sensibilità del biosensore,

- tempi di deposizione più prolungati di 30 s non portano ad alcun miglioramento in termini di sensibilità,

- la sensibilità migliora in PBS a pH 7.0,

- al fine di elettrodepositare una vera fase idrotalcitica, un fattore estremamente importante è, senz’altro, il rapporto molare Ni/Al.

Pertanto, grazie a tali considerazioni, si è deciso di realizzare un experimental design scegliendo come fattori critici solamente la concentrazione enzimatica e il rapporto molare Ni/Al della soluzione di elettrodeposizione.

Più precisamente, si è considerato il rapporto molare Ni/Al nell’intervallo compreso tra 2 e 4 e la concentrazione enzimatica tra 0.3 e 3 mg mL-1, era già stato dimostrato che concentrazioni superiori di GOx non fornivano alcun miglioramento di sensibilità.

Studiando 2 fattori a 3 livelli, si è scelto un disegno fattoriale intero che permette di studiare l’interazione lineare tra i fattori e i loro effetti quadratici. La matrice sperimentale utilizzata è quella in tabella 6.1, i fattori sono codificati da -1 a +1.

Esp No Rapporto molare Ni/Al Concentrazione enzimatica 1 -1 -1 2 0 -1 3 1 -1 4 -1 -0.481 5 0 -0.481 6 1 -0.481 7 -1 1 8 0 1 9 1 1 10 -1 -1 11 -1 -1 12 -1 -1

Tabella 6.1. Matrice sperimentale

Oltre ai nove esperimenti previsti dal disegno fattoriale, tre ulteriori replicati sono stati effettuati al livello inferiore di entrambi i fattori. Il corrispondente progetto sperimentale è riportato nella tabella 6.2, dove il responso è la sensibilità dei biosensori (S106).

Per ogni esperimento è stato costruito un biosensore utilizzando i livelli dei fattori richiesti dal disegno sperimentale ed è stata stimata la sensibilità per ogni esperimento. La trasformazione logaritmica di S106 è stata effettuata poiché l’andamento della sensibilità rispetto alla concentrazione enzimatica non è risultato lineare, ma logaritmico.

Nome Esp Run Order Rapporto molare Ni/Al Concentrazione enzima (mg mL-1) S106 (A mM-1) Log(S10 6₎ N1 8 2 0.3 0.0115 -1.939 N2 12 3 0.3 0.0111 -1.955 N3 11 4 0.3 0.0055 -2.260 N4 4 2 1 0.0783 -1.106 N5 7 3 1 0.0474 -1.324 N6 9 4 1 0.0245 -1.611 N7 5 2 3 0.7100 -0.149 N8 10 3 3 1.2200 0.086 N9 6 4 3 1.2400 0.093 N10 3 2 0.3 0.0131 -1.883 N11 1 2 0.3 0.0124 -1.907 N12 2 2 0.3 0.0135 -1.870

Tabella 6.2 Disegno sperimentale

Per validare il modello, sono stati effettuati tre esperimenti indipendenti al livello intermedio di ogni fattore, in tabella 6.3 vengono riportati i risultati ottenuti:

Nome Exp. Rapporto molare Ni/Al Concentrazione enzima (mg mL-1) S106 (A mM-1) Log(S10 6₎ R1 3 1 0.0458 -1.339 R2 3 1 0.0505 -1.297 R3 3 1 0.0488 -1.312 mean 0.0484 -1.316 sa 0.0024 0.022 c.i. (p=0.95)b 0.006 0.053

a _{deviazione standard,} b _{intervallo di fiducia (probabilità = 0.95)}

Tabella 6.3 Validazione del modello

Y = b₀ + b₁ X₁ + b₂ X₂ + b₁₁ X₁2 + b₂₂ X₂2 +b₁₂ X₁ X₂

dove il responso Y rappresenta il Log(S106) e X_{1, X2} sono rispettivamente il rapporto molare Ni/Al e la concentrazione di enzima. Gli effetti di ogni fattore sono stati studiati sia come termini lineari sia come termini quadratici, mentre l’interazione è descritta dal prodotto dei due fattori.

Il modello risultante è il seguente:

Y = -6.72 – 0.07 X1 + 1.04 X2(***) – 0.010 X12 – 0.23 X22(*) + 0.16 X1X2(**) (* = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.001)

dove X2 è la concentrazione enzimatica con p<0.001, il termine al

quadrato della concentrazione enzimatica è X22 con p<0.05 e

l’interazione del rapporto molare di Ni/Al con la concentrazione enzimatica è X1X2 con p<0.01. Tutte le rappresentazioni riguardanti il

modello sono risultate soddisfacenti sia come “fitting”, sia come “cross- validation” (R2=0.991, deviazione standard dei residui = 0.082, RMSECV = 0.151).

La validazione del modello è stata effettuata sostituendo X1 e X2 con i

valori codificati dagli esperimenti di validazione. Il responso così stimato è stato -1.27 ± 0.15, che non è significativamente diverso dalla media dei valori sperimentali, che è risultata pari a -1.32 ± 0.05. Pertanto il modello può essere usato per valutare il responso nell’intero campo sperimentale. La rappresentazione grafica delle relazioni messe in luce da tale modello, in base ai risultati sperimentali, è riportata in figura 6.1. Come si può osservare il responso migliora con l’aumento della concentrazione enzimatica a causa dell’interazione tra i due fattori; tale effetto è maggiore quando si lavora ad alti rapporti molari di Ni/Al nella soluzione di elettrodeposizione.

Figura 6.1. Rappresentazione grafica delle risposte sperimentali espresse come Log(S106).

I risultati ottenuti grazie al disegno sperimentale sono in accordo con quanto precedentemente osservato.

Più precisamente il valore ottimale per il rapporto molare di Ni/Al è risultato pari a 3 o 4 e per quanto riguarda l’enzima si è riscontrato che una concentrazione di 3 mg mL-1 determina un miglioramento delle prestazioni del biosensore, in termini di sensibilità.

La riproducibilità dei biosensori è pari al 6% ed è stata valutata dalle varianze dei due set di replicati, e cioè gli esperimenti N1, N10, N11, N12 e R1, R2 e R3 riportati, rispettivamente, nelle tabelle 6.2 e 6.3.

BIBLIOGRAFIA

[1] R.G. Brereton, in: Chemometrics, Data analysis for the Laboratory and Chemical Plant, Wiley, p. Chichester, 2003.

[2] G.E.P. Box, W.G. Hunter, J.S. Hunter, in: Statistics for Experiment, An Introduction to Design, Data Analysis and Model Building, Wiley, New York, 1978.

CAPITOLO 7

PLATINATURA

Molte applicazioni richiedono la miniaturizzazione dei biosensori con una conseguente diminuzione della sensibilità di risposta.

Nel tentativo di superare questo problema sono state proposte molte strategie, quali l’introduzione di mediatori del trasferimento elettronico, l’uso di sol-gels come matrici di immobilizzazione enzimatica per aumentare la quantità di biomolecola immobilizzata [1,2] e lo sviluppo di materiali elettrodici porosi.

Per incrementare la sensibilità di corrente, si è pensato di aumentare la superficie elettroattiva con deposizione di nanoparticelle di Pt sulla superficie elettrodica. In tal modo, si dovrebbe depositare una notevole quantità di enzima per unità di superficie elettrodica.

I film di nanoparticelle di platino hanno una struttura mesoporosa ben definita e si possono ottenere per via elettrochimica in diversi modi: in condizioni potenziostatiche, galvanostatiche o con scansioni cicliche del potenziale.

Secondo quanto riportato dalla letteratura [3], gli elettrodi platinati dovrebbero fornire responsi amperometrici 30-40 volte più sensibili di quelli in cui il supporto elettrodico è il platino non trattato.

In questo capitolo vengono descritti i risultati ottenuti in termini di sensibilità nei confronti della risposta al perossido di idrogeno, utilizzando elettrodi sottoposti a platinatura in condizioni potenziostatiche.

voltammogramma ciclico registrato con l’elettrodo immerso in acido solforico.

Avendo verificato un incremento di area elettroattiva, sono stati valutati i parametri ottimali di elettrodeposizione delle nanoparticelle di Pt: potenziale applicato e tempo di deposizione.