Famiglia di Bcl (B Cell Leukemia)-2

La regolazione delle via mitocondriale di attivazione dell’apoptosi è regola- ta prevalentemente dai membri della famiglia di Bcl-2. Le proteine di questa famiglia sono altamente conservate nell’evoluzione dei metazoi, con omologhi

ritrovati nei mammiferi, pesci, uccelli e anfibi così come negli invertebrati quali C. elegans, Drosophila e le spugne marine. Sono stati individuati 20 membri di questa famiglia, suddivisi in due gruppi in base alla funzione svolta nell’apoptosi (Reed, 2000):

• componenti pro-apoptotici: Bak, Bax, Bad, Bid, Bim, Bik, Hrk, Bcl-x_S, p193, Bcl-G, Nip3, Nix e altri;

• componenti anti-apoptotici: Bcl-2, Bcl-x_L, Mcl-1, Bfl-1, Bcl-W e altri. La quantità o attività relativa dei membri pro- e anti-apoptotici della famiglia di B cell leukemia/limphoma (Bcl)-2 stabilisce la definitiva sensi- bilità o resistenza delle cellule a diversi tipi di stimoli apoptotici, quali la mancanza di fattori di crescita, l’ipossia, le radiazioni, i farmaci anti-tumorali, gli ossidanti e il sovraccarico di Ca2+(Reed, 2000). Alterazioni nella quantità totale di queste proteine sono state associate con una serie di condizioni patologiche, caratterizzate da accumulo o perdita di cellule; queste condizioni comprendono il cancro, le malattie autoimmuni, l’immunodeficienza associata ad infezione da HIV e il danno da riperfusione durante l’infarto del mio- cardio. Ad esempio, nella maggior parte dei linfomi non-Hodgkin e in altri tumori, il gene di Bcl-2 (anti-apoptotico) risulta attivato e sovra-espresso a seguito di una traslocazione cromosomica (Reed et al., 1996). Analogamente, mutazioni con perdita di funzione sono state identificate per il gene di Bax (pro-apoptotico) in diversi tumori e l’analisi di topi knock-out per il gene di Bax hanno indicato che questo rappresenta un soppressore tumorale in vivo. La trascrizione dei geni di Bax è inoltre indirettamente regolata da p53 (Miyashita and Reed, 1995), che costituisce un ulteriore punto di connessione tra questo soppressore tumorale e l’apoptosi.

Per quanto riguarda la struttura tridimensionale, le proteine della famiglia di Bcl-2 possono essere divise in due sottogruppi: un sottogruppo ha una

struttura simile a quella dei domini di formazione dei pori delle tossine batteriche; queste proteine-canale comprendono sia componenti anti- che pro- apoptotici. Molti di questi fattori possono essere riconosciuti per l’omologia delle sequenze aminoacidiche conservate, che comprendono domini di omologia con Bcl-2 (BH), come BH1, BH2, BH3 e talvolta BH4 (Reed, 2000). L’altro sottogruppo sembra avere in comune solo la presenza del dominio BH3 (vedi fig. 1.8); comprende solo proteine pro-apoptotiche la cui attività di induzione di morte cellulare dipende dalla loro capacità di dimerizzare con i membri anti-apoptotici, funzionando da inibitori di proteine come Bcl-2 e Bcl-xL; in

questo contesto, è stato dimostrato il coinvolgimento del dominio BH3 nel mediare questa dimerizzazione. Questo dominio consiste in una α-elica di 16 aminoacidi che si inserisce in un sito idrofobico sulla superficie delle proteine anti-apoptotiche. Mutazioni nel dominio BH3, che privano questi fattori della loro capacità di legare gli altri membri della famiglia, sopprimono inoltre la loro capacità di indurre l’apoptosi.

Molte proteine della famiglia di Bcl-2 sono costitutivamente localizzate sul- le membrane mitocondriali, mentre altre si distribuiscono su questo organulo in risposta a specifici stimoli. Bcl-2 è una proteina di membrana, localizzata sulla membrana esterna del mitocondrio, sulla membrana del reticolo endo- plasmico e sull’involucro nucleare ed il suo dominio NH2-terminale è esposto

verso il citosol. Come molti altri membri della sua famiglia, Bcl-2 ha un domi- nio idrofobico COOH-terminale che permette la sua inserzione nella superficie citosolica delle membrane intracellulari (Burlacu, 2003). Diversamente, in condizioni normali Bid, Bim e Bad si ritrovano nel citosol; Bid per essere funzionale deve essere attivato dalla caspasi 8 che rimuove i 52 aminoacidi N-terminali ed espone il dominio BH3 e il core idrofobico necessario per il suo inserimento nelle membrane mitocondriali (Reed, 2000). Quest’attivazione da

Figura 1.8: Struttura dei due sottogruppi della famiglia di Bcl-2: 1. sottogruppo caratterizzato dalla presenza di domini di BH, quali BH1, BH2, BH3 e in alcuni casi BH4; 2. sottogruppo caratterizzato dalla presenza del solo dominio BH3. Modificato da (Cory and Adams, 2002).

parte della caspasi 8 rappresenta un punto di connessione tra la via estrinseca e la via intrinseca di apoptosi.

Una caratteristica importante dei membri della famiglia di Bcl-2 è la loro capacità di formare eterodimeri, che suggerisce la presenza di una com- petizione neutralizzante tra queste proteine (Burlacu, 2003). I componenti pro-apoptotici formano complessi oligomerici che si inseriscono nelle mem- brane mitocondriali, provocando la formazione di canali e la fuoriuscita del contenuto mitocondriale. La proteina Bad, nel citosol, viene defosforilata e diviene in grado di formare complessi con le proteine Bcl-2 e Bcl-x_Lantagoniz- zando la loro azione anti-apoptotica; diverse proteine chinasi, come la protein chinasi A (PKA), anche detta Akt, la protein chinasi B (PKB), Raf1, Rsk1 e Pak1 fosforilano Bad inattivandolo e inibendo la sua dimerizzazione con i componenti anti-apoptotici (Reed, 2000). I componenti anti-apoptotici hanno

Figura 1.9: Meccanismi d’azione della famiglia di Bcl-2 a livello mitocondriale.

il compito di inibire i membri pro-apoptotici formando complessi e bloccando il loro inserimento nella membrana mitocondriale. I fattori principali che fuoriescono dal mitocondrio e sono implicati nell’apoptosi sono il citocromo c, le caspasi 2, 3 e 9 , sequestrate nel mitocondrio in alcuni tipi di cellule, l’AIF, una flavoproteina implicata nelle manifestazioni nucleari dell’apoptosi caspasi-indipendente, e Smac, inibitore dell’inibitore dell’apoptosi (IAP) (ve- di fig. 1.9). Tutte queste proteine sono codificate entro il genoma nucleare, trasportate nel mitocondrio e conservate nello spazio tra le membrane interna ed esterna, aspettando un loro rilascio nel citosol per rottura della membrana esterna.