Erucina, infatti, ha mostrato un rilascio di idrogeno solforato lento e di lunga durata.
1.3.4.1 Farmaci antiinfiammatori non steroidei (NSAIDs)
I farmaci antiinfiammatori non steroidei (NSAIDs) sono attualmente una delle classi farmacologiche più utilizzate, nonostante la loro significativa gastrolesività. Il solfuro di idrogeno risulta utile nel ridurre questo effetto avverso ed esplica anche azioni ancillari, come la riduzione dello stress ossidativo. Proprio per questi motivi, sono stati sintetizzati numerosi NSAIDs in grado di rilasciare H2S, ottenuti attraverso l’unione di alcuni di questi principi attivi con il DTT (5-(4-idrossifenil)-3H-1,2-ditiolo-3-tione) [Wallace JL., 2007]. ACS14 è un’aspirina H2S donor, sintetizzata dalla coniugazione del DTT con acido acetilsalicilico. La somministrazione orale di questa aspirina modificata ha portato a una significativa riduzione dei prodotti della cicloossigenasi nel plasma; ha causato anche un abbassamento delle concentrazioni plasmatiche dell’8-isoprostano, un indicatore dello stress ossidativo, e ha migliorato i livelli di GSH in tutto il sistema cardiovascolare. Mentre una somministrazione orale cronica di acido acetilsalicilico provoca nei ratti serie emorragie, questo effetto non si riscontra negli animali trattati con ACS14 e ciò sta ad indicare che tale molecola è dotata di un migliore profilo gastrico [Sparatore A. et al., 2009].
Sono stati individuati anche due farmaci ibridi derivati dal naprossene, ATB-345 e ATB- 436, ottenuti attraverso l’unione rispettivamente con DTT e 4-HBTA. Entrambi questi derivati hanno mostrato effetti antiinfiammatori paragonabili a quelli del naprossene stesso, ma con un profilo gastrico assai migliorato [Wallace JL. et al., 2010].
Infine, è stato descritto anche un analogo del diclofenac in grado di rilasciare idrogeno solforato. Rispetto al diclofenac questo ibrido ha esibito un maggior effetto antiinfiammatorio e una diminuzione della gastrolesività senza, però, influenzare i valori dell’ematocrito [Wallace JL. et al., 2007].
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1.3.4.2 Sartani H
2S donors
Il solfuro di idrogeno gioca un ruolo fondamentale nella regolazione dell’omeostasi cardiovascolare, pertanto non è sorprendente che farmaci ibridi H2S donors siano stati sintetizzati per migliorare il profilo farmacologico di medicinali impiegati nel trattamento delle più comuni malattie cardiovascolari, come l’ipertensione [Martelli A. et al., 2012]. I sartani sono farmaci comunemente utilizzati nei pazienti ipertesi: agiscono sull’ultimo step del sistema renina-angiotensina, essendo antagonisti dei recettori AT1 dell’angiotensina II. Questi principi attivi non sono direttamente connessi all’azione vasorilasciante sulle cellule muscolari lisce vascolari o all’azione antiaggregante piastrinica, ma la loro attività farmacologica può essere sfruttata per migliorare e potenziare gli effetti antiipertensivi oppure per minimizzare i fattori di rischio connessi ad elevati valori della pressione sanguigna. Grazie a queste considerazioni, alcuni sartani sono stati coniugati con DTT in modo da ottenere derivati con attività di H2S donors [Sparatore A. et al., 2008]. Per questi ibridi ci si aspetta che gli effetti antiipertensivi,
31 dovuti all’aumento dell’antagonismo sui recettori AT1, siano correlati anche all’azione vasorilasciante, all’azione antiaggregante piastrinica e all’effetto cardioprotettivo, provocati dal solfuro di idrogeno. Figura 20: Struttura chimica di un sartano H2S rilasciante
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2. SCOPO DELLA RICERCA
L’endotelio rappresenta una fondamentale barriera biologica e meccanica per il mantenimento dell’omeostasi lungo l’intero albero vascolare. Cambiamenti nella sua integrità sono correlati a diverse patologie cardiovascolari, come ipertensione, aterosclerosi, diabete e iperomocisteinemia, ovvero alla particolare condizione clinica chiamata “disfunzione endoteliale” (Cheng HM. et al., 2017).
Negli scorsi anni l’idrogeno solforato è stato visto come uno dei principali fattori coinvolti nella regolazione della funzionalità endoteliale, tanto che molti studi hanno dimostrato che H2S si comporta come un gastrasmettitore vaso-protettivo in queste patologie cardiovascolari (Wang R., 2009).
Grazie alle ormai note conoscenze riguardanti le azioni fisiopatologiche del solfuro di idrogeno a livello di molti sistemi e in particolare a livello del sistema cardiovascolare, l’interesse della ricerca scientifica è quello di sintetizzare nuove molecole capaci di rilasciare tale gastrasmettitore.
Lo scopo del seguente lavoro di ricerca è stato quello di valutare l’attività iperpolarizzante di composti H2S donors di nuova sintesi sulla membrana di cellule di muscolatura liscia vascolare umana (HASMC). L’iperpolarizzazione di membrana infatti, a livello delle cellule di muscolatura liscia vasale, rappresenta un primo “step” nel processo che porta alla dilatazione del vaso, pertanto viste le note proprietà iperpolarizzanti e vasorilascianti esibite dal gastrasmettitore H2S, i tre H2S-donors di nuova sintesi sono stati testati, attraverso il protocollo che impiega la sonda anionica bis-oxolonica DiBac4(3), al fine di verificarne le potenzialità iperpolarizzanti di membrana.
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3. MATERIALI E METODI
3.1 Materiali e metodi per la sperimentazione in vitro su cellule
HASMC
3.1.1 Colture cellulari
In queste procedure sperimentali sono state impiegate, come substrato biologico, cellule di muscolatura liscia di aorta umana (HASMC, human aortic smooth muscle cells, Invitrogen®), opportunamente conservate a una temperatura di -196°C all’interno di un dewar contenente azoto liquido.Durante lo stoccaggio in azoto liquido è stata addizionata al mezzo di coltura una percentuali pari al 10% di dimetil solfossido (DMSO). Infatti, il DMSO è un agente criopreservante, che ha la funzione di ridurre la formazione di cristalli di ghiaccio tra le cellule in sospensione così da evitare l’eventuale danneggiamento delle membrane citoplasmatiche durante la fase dello scongelamento; questa procedura, pertanto, permette di mantenere in totale quiescenza le cellule per anni al fine di conservare intatte le loro proprietà fisiologiche.
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3.1.2 Mezzo di coltura
Per le cellule HASMC il mezzo di coltura utilizzato per mimare l’ambiente fisiologico è un mezzo liquido e sterile preparato a partire dal Medium 231 (Life Technologies®), mezzo base contenente vari componenti utili per la crescita cellulare, come amminoacidi essenziali e non essenziali, sali inorganici, glucosio, ecc.Al momento dell’apertura il mezzo base è stato addizionato di un’aliquota di 5 ml di una miscela antibiotica costituita da penicillina e streptomicina, previa rimozione di un equivalente volume di mezzo di coltura, e di 25 ml di un fattore di crescita denominato SMGS (smooth muscle growth supplement, Life Technologies®), a sua volta costituito da componenti utili ad incentivare la proliferazione cellulare. Il fattore di crescita supplementare (SMGS) è un liquido sterile, che viene fornito dalla ditta in bottiglie da 25 ml, quantità necessaria ad essere addizionata a 500 ml di mezzo di coltura. SMGS si compone di ormoni, estratti di tessuti, insulina e FBS (fetal bovine serum), ingredienti indispensabili per favorire la crescita delle cellule di muscolatura liscia di aorta umana. La miscela antibiotica penicillina/streptomicina e il fattore di crescita supplementare (SMGS) sono opportunamente conservati in congelatore e scongelati al momento del loro utilizzo grazie all’ausilio di un bagno termostatato e aperti sotto cappa a flusso laminare, in modo tale da garantirne la sterilità. Il mezzo di coltura viene preparato anch’esso in ambiente sterile sotto cappa a flusso laminare, è conservato in frigorifero ad una temperatura di 4°C per non più di 4 settimane e ad ogni utilizzo viene preventivamente riscaldato in bagno termostatato fino alla temperatura di 37°C.