Il PDGF è stato per la prima volta identificato come componente del siero responsabile della proliferazione di cellule della muscolatura liscia (Shih, 2006). I PDGF sono dimeri di catene polipeptidiche legati da ponti disolfuro la cui segnalazione è mediata da specifici recettori tirosina chinasici, i PDGFR. Nei mammiferi sono stati identificati nove geni codificanti quattro differenti catene di PDGF: PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C e PDGF-D. È stata dimostrata la presenza di un eterodimero PDGF-AB nelle piastrine umane. Sebbene l’eterodimero PDGF-AB abbia qualche differenza nelle proprietà di segnalazione rispetto agli omodimeri, la sua importanza fisiologica
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resta da chiarire. Inoltre, dato che i pattern di espressione di PDGF-A e PDGF-B sono generalmente non sovrapponibili gli eterodimeri sono probabilmente poco presenti in vivo. I PDGF hanno ruoli cruciali durante lo sviluppo, anche se stanno aumentando le evidenze di funzioni fisiologiche di tali fattori di crescita anche nell’adulto. In generale i PDGF esercitano un effetto mitogenico e anti-apoptotico oltre a promuovere la migrazione cellulare. Tali fattori di crescita risultano perciò in grado di regolare molti processi cellulari sia fisiologici che patologici: svolgono un ruolo importante durante lo sviluppo di alcuni tessuti e organi, durante il processo di riparazione tissutale, ma anche nella progressione tumorale e nel processo di metastatizzazione (Andrae, 2008). Un aumentato signalling del PDGF è stato correlato a differenti malattie e condizioni patologiche suggerendo che antagonisti del fattore di crescita possano essere utilizzati nella terapia di tali patologie. In effetti, molecole che inibiscono il recettore del PDGF sono largamente utilizzate in modelli pre-clinici e in trials clinici nell’uomo. Il PDGF-BB ricombinante è stato inoltre introdotto in clinica per la terapie della riparazione delle ferite (Andrae, 2008).
I PDGF agiscono principalmente come fattori di crescita paracrini oltre a poter essere utilizzati nel
loop autocrino dei tumori: sono infatti generalmente prodotti da popolazioni discrete di cellule e
agiscono localmente inducendo riposte cellulari differenti (Betsholtz, 2004). I pattern di espressione di PDGF e PDGFR sono regolati spazio-temporalmente durante lo sviluppo e in alcune risposte fisiologiche ipertrofiche. L’espressione di PDGF in cellule in coltura è dinamica e responsiva a una moltitudine di stimoli, compreso il PDGF stesso. L’espressione di PDGFR è anch’essa dinamica: è generalmente bassa in cellule mesenchimali in vivo ma aumenta drammaticamente durante i processi infiammatori. I geni PDGF e PDGFR si trovano su cromosomi differenti nei mammiferi e la loro regolazione trascrizionale sembra per la maggior parte indipendente.
I PDGF di mammifero possono essere separati in due classi di proteine che si distinguono per la presenza del “motivo di ritenzione” basico (A e B) o del dominio CUB (C e D) (Figura 19). Tutti i membri hanno un dominio “core”, contenente un insieme conservato di residui di cisteina, necessario e sufficiente per il legame e l’attivazione del recettore.
Figura 19. Classificazione dei PDGF nelle classi I e II sulla base della presenza del “motivo di ritenzione” basico (A e B)
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La biosintesi e il processamento dei PDGF sono controllati a più livelli e differiscono per i diversi PDGF. Non sono presenti in letteratura dati riguardanti una secrezione regolata dei PDGF, che sembrano essere rilasciati costitutivamente (Fruttiger, 2000). PDGF-A e PDGF-B contengono un pro-dominio N-terminale che viene rimosso intracellularmente da furina o proteine convertasi correlate per rendere attivo il fattore di crescita (Fredriksson, 2004). Al contrario di PDGF-A e PDGF-B, che vengono dunque secreti come ligandi attivi, PDGF-C e PDGF-D non vengono processati intracellularmente ma sono secreti come ligandi latenti, condizionalmente inattivi. L’attivazione nello spazio extracellulare richiede la dissociazione del dominio del fattore di crescita dal dominio CUB. Le proteasi responsabili in vivo dell’attivazione dei ligandi C e D non sono state definitivamente identificate anche se è stato dimostrato che l’attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) attiva i dimeri PDGF-CC in vitro (Andrae, 2008).
Una distribuzione spaziale discontinua di fattori di crescita e citochine definisce la loro attività biologica e il loro range di azione. La diffusione del PDGF nell’interstizio dei tessuti è regolata dal legame alle componenti della matrice extracellulare. Per i PDGF-A e PDGF-B tale legame è compiuto dal motivo C-terminale detto “motivo di ritenzione” contenente un’alta proporzione di aminoacidi basici e dunque carico positivamente (Figura 19). Sebbene dunque non necessitino di attivazione proteolitica, il processamento dei ligandi PDGF-A e PDGF-B al loro C-terminale porta alla rimozione del “motivo di ritenzione” che limita il loro campo di azione mediante il legame a proteoglicani. PDGF-C e PDGF-D sono privi del motivo di ritenzione ma i domini CUB sono implicati nelle interazioni proteina-proteina e proteina-carboidrati e regolano, quindi, la distribuzione extracellulare di tali ligandi.
I PDGF inducono effetti biologici mediante interazione con due recettori tirosina chinasici, PDGFR-α and PDGFR-β, che condividono la struttura, costituita da cinque loops immunoglobulinici (Ig) extracellulari e un dominio tirosina chinasico intracellulare (TK). Il legame del ligando promuove la dimerizzazione del recettore che inizia la via di segnalazione. In relazione alla configurazione del ligando e al pattern di espressione dei recettori si possono formare dimeri di recettore differenti (Heldin, 1999). Esperimenti condotti in colture cellulari suggeriscono che le interazioni PDGF-PDGFR possibili siano molte e complesse e includano la formazione di recettori eterodimeri (Figura 20). Esistono tuttavia evidenze funzionali in vivo solo per poche interazioni: PDGF-AA e PDGF-CC sembrano trasdurre il segnale via PDGFR-α e PDGF-BB via PDGFR-β (Figura 20). È probabile che anche PDGF-DD agisca mediante PDGFR-β in vivo, ma ad oggi mancano evidenze per tale interazione. La formazione di eterodimeri di recettori del PDGF avviene
in vivo come dimostrato dall’incrocio di topi mutanti per PDGFR-α e PDGFR-β (Klinghoffer,
2002). La dimerizzazione del recettore causata dal legame del PDGF rappresenta l’evento chiave nell’attivazione del PDGFR. Ognuna delle due subunità del dimero possiede infatti un dominio
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citoplasmatico tirosina chinasico e, nella forma dimerica, ogni subunità è in grado di trans- fosforilare alcuni residui di tirosina presenti nel dominio intracellulare del recettore.
Figura 20. Interazioni PDGF-PDGFR. Ognuna delle catene polipeptidiche del dimero di PDGF interagisce con una
subunità di recettore. La configurazione del recettore attivo è quindi determinata dal dimero di ligando. A sinistra sono mostrate le interazioni dimostrate in vitro. Le linee tratteggiate indicano interazioni deboli o risultati contrastanti. A destra le interazioni che sono state dimostrate importanti durante lo sviluppo dei mammiferi in vivo.
L’autofosforilazione attiva quindi l’attività tirosina chinasica del recettore e fornisce punti di ancoraggio per le molecole coinvolte nel signalling a valle. L’ancoraggio di substrati del recettore e la successiva propagazione del segnale è dovuta a interazione proteina-proteina mediante domini specifici: la maggior parte degli effettori del PDGFR si lega a siti specifici del recettore fosforilato mediante domini SH2 (Src Homology 2). Sia PDGFR-α che PDGFR-β reclutano vie di segnalazione ben caratterizzate quali Ras-MAPK, PI3K e PLC-γ, coinvolte in molte risposte cellulari (Figura 21).
Figura 21. Trasduzione del segnale dei PDGFR. Le frecce indicano legami ai principali pathways di segnalazione e a
effettori secondari.
I recettori del PDGF attivano la via di segnalazione Ras-MAPK principalmente attraverso le proteine adattatrici Grb2 e Shc, che si legano al recettore attivato mediante i domini SH2 e SH3,
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rispettivamente. Il signalling della MAPK attiva la trascrizione genica inducendo stimolazione di crescita cellulare, differenziamento e migrazione (Seger, 1995). L’attivazione della via di segnalazione PI3K/Akt indotta da PDGF promuove la riorganizzazione dell’actina, i movimenti cellulari direzionati, la stimolazione della crescita e l’inibizione dell’apoptosi (Hu, 1995). PDGF attiva inoltre la PLC-γ mediante fosforilazione diretta della proteina catalizzata dal PDGFR. L’attivazione di tale enzima stimola la crescita cellulare e la motilità (Kundra, 1994).
I recettori del PDGF interagiscono inoltre con le integrine portando ad un aumento della proliferazione cellulare, del differenziamento e della sopravvivenza. L’interazione del PDGFR con le integrine favorisce la localizzazione del recettore a livello delle adesioni focali, siti in cui alcune vie di segnalazione iniziano e interagiscono tra loro (Clark, 1995).
Il signalling del PDGF è finemente regolato mediante meccanismi di controllo a feedback negativo (Figura 21). La segnalazione del recettore può essere terminata dalla proteina fosfatasi SHP-2 che lega PDGFR mediante il suo dominio SH2 e defosforila il recettore e i suoi substrati. La via di Ras può essere terminata anche dal legame del suo regolatore negativo, Ras-GAP, a PDGFR-β mediante il suo dominio SH2. L’occupazione del recettore da parte del ligando promuove inoltre l’internalizzazone endocitica di PDGFR: la maggior parte dei recettori internalizzati viene degradata per via lisosomiale, limitando la durata della segnalazione del PDGFR. È stato recentemente osservato il riciclo del recettore PDGFR-β, ma non PDGFR-α in cellule mancanti della fosfatasi TC-PTP, regolatore negativo della fosforilazione di PDGFR-β (Karlsson, 2006). Alcune delle risposte cellulari a PDGF avvengono entro un tempo compreso tra secondi e minuti dall’attivazione del PDGFR e sono indipendenti dall’induzione genica e dalla sintesi proteica. PDGFR-α e PDGFR-β mediano risposte rapide simili ma non identiche: entrambi i recettori stimolano il riarrangiamento dei filamenti di actina, ma solo PDGFR-β promuove la formazione di
ruffles circolari; PDGFR-β provoca una mobilizzazione di ioni calcio molto più efficientemente
rispetto a PDGFR-α; PDGFR-β, inoltre, inibisce la comunicazione giunzionale tra le cellule mediante fosforilazione della proteina delle gap junction connessina 43.
Sebbene i due recettori trasducano il segnale mediante vie simili, lo specifico pathway attivato e il grado di attivazione dello stesso non sono identici. La sostituzione in vivo della subunità di segnalazione intracellulare di un recettore con quella di un altro non è infatti in grado di riepilogare un normale sviluppo, suggerendo che ogni recettore abbia una trasduzione del segnale unica in seguito al legame del PDGF (Andrae, 2008).
Oltre alle risposte rapide post-traduzionali, i PDGFR inducono cambiamenti trascrizionali rapidi che coinvolgono i cosiddetti immediate early genes (IEGs), target diretti di fattori di trascrizione attivati da varie vie di segnalazione. Le risposte mediate dagli IEGs sono probabilmente necessarie per molti degli effetti a lungo termine dei PDGF in vivo e in vitro.