Il TGFβ è un membro di una famiglia di proteine multifunzionali strutturalmente correlate, la famiglia del TGFβ, coinvolte nella regolazione dello sviluppo e di importanti processi cellulari, quali proliferazione, differenziamento, adesione, migrazione ed apoptosi (Massagué, 2000). Questa famiglia comprende oltre cinquanta membri, identificati in organismi diversi quali C. elegans, D.
melanogaster e l’uomo, alcuni dei quali sono prodotti da numerosi tipi cellulari, mentre altri
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Il TGFβ è prodotto da numerosi tipi cellulari e regola una vasta gamma di processi biologici, in numerosi tessuti (Massagué, 2006). Una caratteristica che contraddistingue questa citochina è la sua azione cellula-specifica, cioè la sua capacità di esercitare effetti diversi a seconda del tipo cellulare su cui agisce (Barnard, 1990; Massagué, 1992): Il TGFβ provoca un aumento della proliferazione nei fibroblasti (Roberts, 2003) mentre inibisce la proliferazione delle cellule epiteliali (Massagué, 2006), promuove il differenziamento delle cellule neuronali mentre blocca il differenziamento di varie cellule di origine mesenchimale, e, ancora, ha un effetto pro-apoptotico in cellule dell’epitelio prostatico e anti-apoptotico in cellule dell’epitelio mammario (Sanchez-Capelo, 2005). La risposta cellulare al TGFβ dipende da quali vie di segnalazione sono attive nella cellula bersaglio e dalla loro interazione con la via di trasduzione del segnale della citochina.
Nei mammiferi la famiglia del TGFβ può essere suddivisa, sulla base dell’omologia di sequenza, in varie sottofamiglie, che comprendono le proteine morfogenetiche dell’osso (BMP, Bone
Morphogenetic Protein), l’attivina ed il TGFβ. I membri della superfamiglia del TGFβ sono omo-
o eterodimeri, i cui monomeri sono legati da ponti disolfuro, che si formano per maturazione proteolitica di precursori inattivi secreti in forma monomerica nel mezzo extracellulare. I membri della famiglia del TGFβ funzionano come molecole segnale extracellulari che trasducono il segnale mediante l’interazione con specifici recettori di membrana. Tali recettori possiedono un unico segmento transmembrana, sono caratterizzati da un dominio extracellulare ricco in cisteina e da un dominio intracellulare chinasico, situato nel frammento C-terminale, con specificità verso i residui di serina e treonina. Sulla base dell’analisi della sequenza amminoacidica e della caratterizzazione delle proprietà funzionali tali recettori sono stati suddivisi in due sottofamiglie, i recettori di tipo I (TβRI) e i recettori di tipo II (TβRII). Entrambi i tipi di recettore sono glicoproteine ed hanno un peso molecolare rispettivamente di 55 kDa e 70 kDa.
La caratteristica distintiva del recettore di tipo I è rappresentata dalla presenza, immediatamente a monte del dominio catalitico, di una regione altamente conservata costituita da trenta amminoacidi e contenente la sequenza TTSGSGSGLP. In seguito al legame del TGFβ questa regione, chiamata dominio GS, viene fosforilata ed ha un ruolo cruciale nell’attivazione del TβRI. Il recettore di tipo II manca del dominio GS ed è caratterizzato dalla presenza di una regione ricca di residui treonina e serina al C-terminale. Dal punto di vista funzionale TβRII è caratterizzato dall’attività costitutiva del suo dominio catalitico chinasico.
La via di trasduzione del segnale del TGFβ richiede sia i recettori di tipo I che di tipo II. Alcuni studi con recettori chimerici hanno infatti dimostrato che complessi omodimerici, costituiti da recettori di tipo I oppure di tipo II, sono incapaci di generare una risposta cellulare, mentre complessi contenenti i domini citoplasmatici di entrambi i tipi di recettore sono capaci di mediare la segnalazione del TGFβ (Okadome, 1995; Feng, 1995; Vivien, 1995). Il genoma umano codifica
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sette recettori di tipo I e cinque recettori di tipo II, che si appaiano in combinazioni differenti a formare complessi recettoriali per i vari membri della famiglia del TGFβ.
La ricerca, a livello della membrana cellulare, di molecole capaci di legare il TGFβ ha rivelato la presenza di un terzo tipo di recettori, indicati appunto come recettori di tipo III. Tali recettori, a differenza di quelli di tipo I e di tipo II, hanno un dominio intracellulare privo di qualsiasi sequenza che possa essere coinvolta nella trasduzione del segnale. Sembra che la loro funzione sia quella di legare il TGFβ e presentarlo ai recettori di tipo I e II, coinvolti invece nella trasduzione del segnale (Massagué, 2000).
La via di segnalazione del TGFβ (Figura 17) prevede che la citochina si leghi inizialmente a TβRII. Questo legame provoca una variazione conformazionale del recettore che ne permette il riconoscimento da parte di TβRI. In presenza del ligando i due tipi di recettori vengono quindi a trovarsi in stretta prossimità formando un complesso recettoriale eterodimerico. Essendo il ligando un dimero, attorno a ciascuna molecola si possono formare due complessi recettoriali che danno origine quindi ad un complesso eterotetramerico per ciascuna molecola di TGFβ. In seguito alla oligomerizzazione dei recettori, TβRII, costitutivamente attivo, fosforila tre residui di serina e due di treonina nel dominio GS di TβRI, con conseguente attivazione del dominio ad attività serina/treonina chinasica di TβRI. Tale fosforilazione riduce inoltre l’affinità di TβRI per la proteina FKBP12, che agisce come regolatore negativo della via di segnalazione mediata da tale recettore (Wang, 1996). Al tempo stesso, la fosforilazione del recettore ne aumenta l’affinità (Huse, 2001) per gli effettori intracellulari della via di trasduzione del segnale del TGFβ, le proteine Smad, la cui attivazione dipende dalla fosforilazione da parte di TβRI ed ha come risultato la regolazione dell’espressione di un numero elevato di geni (Figura 17).
Figura 17. La via di trasduzione del segnale del TGFβ.
Le proteine Smad, il cui nome deriva dai geni omologhi Sma (Small) e MAD (Mother Against Dpp) presenti rispettivamente in C. elegans e in D. melanogaster (Derynck, 1996), rappresentano una
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famiglia di fattori trascrizionali comprendente otto membri con funzioni differenti tra loro, in grado cioè di regolare l’espressione di geni distinti e mediare risposte cellulari diverse in relazione a interazioni selettive con i recettori del TGFβ, con altre proteine Smad e con co-fattori trascrizionali (Kretzschmar, 1998).
Le proteine Smad consistono di due domini globulari, indicati come MH1 e MH2 (Mad Homology
1 e 2), rispettivamente all’N-terminale e al C-terminale, collegati da una regione flessibile (Figura
18). Il dominio MH1 è responsabile del legame al DNA (Shi, 1998), mentre il dominio MH2 media l’interazione con varie proteine coinvolte nel funzionamento delle Smad (Huse, 2001; Wu, 2001).
Figura 18. Classificazione delle proteine Smad sulla base della struttura e della funzione.
Le proteine Smad sono suddivise in tre gruppi sulla base delle loro caratteristiche strutturali e funzionali: cinque Smad regolate da recettore (R-Smad), una Smad mediatrice comune (Co-Smad) e due Smad inibitorie (I-Smad) (Figura 18).
Le R-Smad comprendono le proteine Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 e Smad8. La loro attivazione richiede che esse vengano fosforilate su due residui di serina, nella sequenza SSXS del dominio C- terminale MH2, dall’attività proteina chinasica del recettore TβRI attivato. Tale modificazione covalente causa un’alterazione strutturale delle R-Smad, abilitandole a formare complessi eterodimerici con Smad4 (Wu, 2001), appartenente alle proteine Co-Smad, prive della sequenza SSXS e dunque non fosforilabili da alcun recettore ma indispensabili per la formazione di complessi trascrizionali funzionali (Shi, 2003).
I recettori di tipo I per il TGFβ e l’attivina fosforilano Smad2 e Smad3, mentre i TβRI per le BMP fosforilano Smad1, Smad5 e Smad8. I diversi membri della famiglia del TGFβ, quindi, in seguito al legame ai loro specifici recettori, trasducono il segnale attraverso R-Smad distinte, inducendo così risposte cellulari differenti mediante l’attivazione di specifiche risposte trascrizionali. Piccoli
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elementi strutturali presenti nei recettori di tipo I e nelle R-Smads sono responsabili di questa specificità d’interazione, come dimostrato dal fatto che la variazione di residui amminoacidici in questi domini è sufficiente a cambiare la specificità della via di trasduzione del segnale (Chen, 1998).
Infine, le proteine Smad Inibitorie (I-Smads), comprendenti le proteine Smad6 e Smad7, differiscono dal punto di vista strutturale dagli altri componenti della famiglia mancando del sito di fosforilazione C-terminale SSXS e possedendo un dominio correlato solo alla lontana ad MH1 (Figura 18). Esse agiscono in opposizione alle R-Smads e alle Co-Smads formando associazioni stabili con i recettori di tipo I attivati e prevenendo, in tal modo, la fosforilazione delle R-Smads da parte di tali recettori. La proteina Smad7 è indotta dalla via di segnalazione del TGFβ e fa quindi parte di un meccanismo di regolazione negativo dipendente dal TGFβ stesso (Nakao, 1997). La proteina Smad6 è traslocata dal nucleo al citoplasma dalla via di segnalazione del TGFβ e funziona anch’essa come regolatore negativo di tale via (Hata, 1997).
Le R-Smad, in particolare Smad2 e Smad3, nel loro stato non fosforilato sono ancorate ai recettori del TGFβ attraverso una proteina di membrana, SARA (Smad Anchor for Receptor Activation) (Wu, 2000). La presenza di questa proteina di ancoraggio risulta necessaria per la localizzazione delle proteine Smad in vicinanza dei recettori e quindi per la loro attivazione. Mutazioni nella proteina di ancoraggio SARA prevengono infatti l’associazione di Smad2 con il recettore inibendo le risposte indotte da TGFβ. Le Smad sono in grado di legarsi al recettore di tipo I attraverso il loop L3 presente nel loro dominio MH2. La presenza di SARA aumenta sia l’efficienza che la selettività della via di segnalazione del recettore favorendo la fosforilazione di Smad2 o Smad3 (Tsukazaki, 1998). In seguito alla fosforilazione da parte di TβRI, attivato da TGFβ, le R-Smad si dissociano da SARA e formano complessi con Smad4. Gli eterodimeri R-Smad/Smad4 traslocano dal citosol al nucleo attraverso l’interazione con le proteine del complesso del poro nucleare (Chen, 2005), a livello del nucleo agiscono quindi come fattori trascrizionali, regolando l’espressione di specifici geni bersaglio. Tali complessi eterodimerici possono legare direttamente il DNA a livello della sequenza CAGAC presente nell’elemento di legame delle Smad, SBE (Smad Binding Element) (Denissova, 2000). Nella maggior parte dei casi, tuttavia, la regolazione dell’espressione genica da parte delle Smad dipende dalla loro associazione in complessi trascrizionali con altri fattori di trascrizione e co-fattori (Massagué, 2000). In relazione ai “partner trascrizionali” con cui le Smad interagiscono, esse riconoscono sequenze regolatrici differenti e modulano quindi l’espressione di geni diversi. I diversi membri della famiglia del TGFβ inducono risposte cellulari distinte attraverso il reclutamento di differenti combinazioni di Smad e co-fattori trascrizionali. Inoltre, poiché la disponibilità di tali fattori può variare a seconda del tipo cellulare e del contesto, queste interazioni possono spiegare la diversità e la specificità delle risposte cellulari al TGFβ in tipi cellulari e contesti differenti. Infine, vari segnali extracellulari possono modulare la via di
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segnalazione del TGFβ (Massagué, 2000), ad esempio mediante l’attivazione di fattori di trascrizione in grado di cooperare con le proteine Smad nella regolazione dell’espressione genica. La specificità della via di trasduzione del segnale è perciò determinata dall’integrazione di segnali diversi a livello dell’attivazione di fattori trascrizionali.
La terminazione del segnale avviene mediante defosforilazione, e conseguente inattivazione, o mediante ubiquitinazione seguita da degradazione proteasoma-dipendente, delle proteine Smad fosforilate, substrato di fosfatasi e ubiquitina-ligasi rispettivamente.
Per concludere, è stato dimostrato che, sebbene la maggior parte delle risposte al TGFβ siano mediate dalle proteine Smad, alcune vie di segnalazione attivate dalla citochina sono indipendenti da tali effettori (Derynck, 2003). Tra le molecole attivate dal TGFβ in maniera indipendente dalle Smad ci sono ERK1/2, p38 MAPK, JNK e PI3K. I meccanismi molecolari attraverso i quali la citochina, legandosi ai propri recettori di membrana, attiva queste vie di segnalazione indipendentemente dal coinvolgimento delle Smad, risultano ancora sconosciuti.