Fattori implicati nella regolazione dei myoFBs

Il TGF-β1 `e considerato il principale fattore implicato nella differenziazione dei myoFBs che promuove l’espressione di αSMA [159, 160], la nuova sintesi di proteine dell’ECM [156] e di numerose componenti del citoscheletro [161].

Il pathway atraverso il quale TGF-β1 regola l’espressione di αSMA coinvolge la reazione a catena delle proteine Smad (Figura 2.1 [157]). Il TGF-β1 attivato `e riconosciuto da due recettori distinti che vengono reclutati in sequenza per mediarne il segnale. Inizialmente viene legato il recettore di tipo II che, dopo fosforilazione, recluta il recettore di tipo I, formando un complesso eterodimerico. Il complesso possiede un’attivit`a serina/treonina ki- nasica e fosforila la Smad3 (Smad2, in alcuni casi) che a sua volta lega Smad4 e trasloca nel nucleo. A questo punto avviene l’amplificazione della trascrizione di diversi geni, tra cui quello dell’αSMA, grazie all’interazione del complesso con i fattori di trascrizione del DNA [162, 163]. L’inibizione di questa cascata di eventi `e determinata dal sequestro di Smad3 esercitato dal fattore citoplasmatico Smad7.

Anche altri fattori intervengono nella regolazione dell’attivit`a dei myoFBs, di cui alcuni cooperano con TGF-β1 mentre altri ne sono antagonisti. Tra i cofattori solubili, il fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF) `e il mediatore meglio studiato, che potenzia l’attivit`a profibrotica del TGF-β1 ed induce la proliferazione dei FBs [164]. La sua attivit`a pleiotropica `e da attribuirsi ai suoi sottodomini strutturali e all’interazione mutualmente esclusiva con altre citochine come l’epithelial growth factor (EGF) ed l’insulin growth factor 2 (IGF-2) [165]. Tra le proteine di membrana va annoverata la galectina-3 implicata nella stimolazione

della differenziazione dei myoFBs in coltura di cellule stellate epatiche [166].

Tra i fattori solubili antagonisti, va ricordata l’IL-1, vista inibire in vitro, l’espressione di αSMA, e quindi la differenziazione dei FBs in myoFBs [167]. Inoltre, la sovraespressione di “IL-1 receptor antagonist” intracellulare sembra avere effetti simili [168]. Un’altra citochina, antagonista al TGF-β1, `e l’interferonγ (INFγ), rilasciato dalle cellule T (risposta Th1) il quale sembra ridurre l’espressione di αSMA in FBs in coltura. Tale effetto sembra mediato dall’attivazione di una proteina repressore YB-1, che trasloca nel nucleo e interferisce con la trascrizione genica indotta da TGF-β1, interferendo con il segnale di Smad 3 e promuovendo la trascrizione di Smad7 [169, 170].

Alcuni fattori sono stati visti indurre il differenziamento dei myoFBs, indipendentemente dal TGF-β1, almeno apparentemente. Esperimenti condotti su topi transgenici, deleti del gene per L’IL-6, mostrano un alterato “woun healing” cutaneo, ed un ridotto numero di myoFBs, indipendentemente dai livelli di TGF-β1 [171]. Similarmente, in altri studi `e stato visto che l’NGF aumenta l’espressione di αSMA, in culture di FBs della pelle e del polmone [172]. Tuttavia, nel 2005 Micera e suoi collaboratori hanno dimostrato in vitro che l’effetto pro-fibrotico dell’NGF su FBs, congiuntivali umani, `e dovuto all’effetto endogeno del TGF- β1, stimolato dall’NGF stesso [173].

2.2.2

Attivit`a dei myoFBs regolata dal sistema immunitario innato

e selettivo.

Disordini con un’evoluzione di tipo fibrotico presentano spesso un’eziologia infettiva, di tipo batterica, virale o funginea che nel tempo si cronicizza. E stato recentemente visto che` patterns molecolari associati ai patogeni (PAMPs), trovati su organismi infettivi, mantengono i myoFBs in uno stato di continua attivazione [174]. Con il nome di PAMPs ci riferiamo a sottoprodotti patogeni come lipoproteine, DNA batterico o RNA a doppio filamento i quali sono riconosciuti da specifici recettori, i PRRs, che sono espressi da un gran numero di cellule

Figura 2.1: Regolazione della trascrizione di αSMA nei myoFBs. L’espresssione di αSMA in myofibroblasts `e mediato dall’attivazione del complesso recettoriale del TGFβ1, attraverso il pathway delle Smad, che porta all’associazione di Smad3 a Smad4, che traslocano nel nucleo. Smad3 riconosce e si lega al DNA a livello del promotore per l’αSMA, coniugato ad altri fat- tori di trascrizione (TF). Fattori antagonisti del TGFβ1, come l’IFNγ, attraverso l’attivazione di YB-1 che inibisce la trascrizione di Smad3 e up-regola l’espressione dell’inibitore Smad7, down-regolano la trascrizione dell’αSMA. TGFβ1 pu`o indurre la trascrizione di αSMA in- dipendentemente dalle Smad, mediante il riconoscimento e il legame dei kru¨ ppel-like factors Sp1/3 all’elemento di controllo del TGFβ1 (TCE) e alla regione ipersensibile del TGFβ1 (THR). Inoltre, mentre il legame di TEF-1 all’elemento genomico MCAT-1 `e cruciale, non lo `e l’interazione dei “serum-response factor” (SRF) con le regioni A,B,C e D degli elementi CArG per la trascrizione di αSMA in myoFBs. (figura da: Hinz, 2007[172])

tra cui i FBs [175].

Le iterazioni tra le PAMPs e i loro recettori rappresentano la prima linea di difesa durante le infezioni e attivano numerose citochine e chemochine proinfiammatorie. Gli stessi FBs possiedono una grande variet`a di questi recettori, inclusi i Toll-like receptors (TLRs), che mediante il riconoscimento di tali ligandi possono attivare direttamente i FBs e promuovere la loro differenziazione in myoFBs e quindi la sintesi di nuovo collagene [174, 175, 176]. Tutto questo suggerisce che inibire i segnali dei TLRs potrebbe rappresentare un nuovo approccio per il trattamento di queste malattie fibrotiche. Un meccanismo, indipendente dal segnale TGF-β1/SMAD3 [177, 178], sono le infezioni da virus come il citomegalovirus CMV, il quale stimola la produzione di anticorpi e il CTGF, che partecipano entrambi nell’attivazione costitutiva dei myoFBs [179, 180]. Tuttavia, anche fattori non infettivi, possono portare all’attivazione dei FBs come nel caso della sclerosi sistemica in cui i FBs assumono il fenotipo di myoFBs costitutivamente attivati [181, 179], similmente ai normali FBs stimolati con TGF- β1. I risultati di una serie di modelli sperimentali, mostrano che in alcuni casi la fibrosi non sempre `e caratterizzata dalla persistenza dell’infiammazione e ci`o significa che i meccanismi che regolano la fibrosi, ad un certo stadio, si separano da quelli dell’infiammazione [182, 145]. In altri studi, `e stato visto che le cellule T, di tipo CD4+, hanno un ruolo importante nella progressione della fibrosi, infatti in modelli animali `e stata dimostrata una forte correlazione tra la patologia fibrotica del fegato con le risposte di cellule Th2/CD4+ (IL-4, IL-5, IL-13 e IL21) [183, 184, 185, 186]. Al contrario, sembra che le citokine rilasciate dalla risposta immunitaria di tipo Th1, come IFNγ e IL-12 abbiano un potente effetto anti-infiammatorio [183, 187]. Ci`o ha indotto a pesare che riuscire a deviare le risposte immunitarie di tipo Th2 in favore di quelle di tipo Th1 potesse ristabilire il giusto equilibrio, necessario per un corretto “wound healing”. Tuttavia, nonostante siano noti molti fattori e meccanismi che influenzano i FBs, siamo ancora lontani da un approccio terapeutico mirato che impedisca la perdita fisiologica del tessuto colpito, probabilmente perch´e non una ma la concausa di pi`u fattori, genetici ed ambientali, cooperano nello stabilire e mantenere i myoFBs sempre attivati.

Patologie fibrosanti ed NGF: finalit`a

del progetto

Per definizione, l’infiammazione `e una reazione locale ad un danno tissutale localizzato, che tenta di risolvere e riparare gli effetti del danno. I fattori che possono dare il via alla risposta infiammatoria sono molteplici ed includono agenti infettivi, fisici, (bruciature, radiazioni, traumi, ecc.), chimici (farmaci, tossine, ecc.) e agenti immunologici come allergeni nel caso di malattie allergiche o autoantigeni nel caso di malattie autoimmuni.

Indipendentemente dalle cause scatenanti, alla risposta infiammatoria acuta partecipano quasi sempre le stesse cellule e fattori solubili e cellulari. Anche quando l’evento infiammatorio si prolunga, come nel caso di persistenza dell’agente causale, la risposta `e identica: la lesione non pu`o essere riparata, con l’acqusizione di un fenotipo cicatriziale alterato e perdita della funzionalit`a dell’organo in questione.

L’NGF `e presente in svariate condizioni patologiche sia come mediatore del dolore sia come immunomodulatore (book: Stampachiacchiere et al., 2008; New Immunology Research Developments) cellulare e di altri mediatori dell’infiammazione come ad esempio il TNF-α, TGF-β1, INF-γ o l’IL-1β [188, 173, 189].