Grafico che mostra le frequenze alleliche medie per il polimorfismo di AromC1531T.

- Aromatasi Arg264Cys -

Nell’analisi del polimorfismo non sinonimo Aromatasi Arg264Cys, l’allele AA presenta una frequenza elevata nella popolazione generale, dato riscontrato sia nel gruppo test (93,33%) che controllo (94,34%). Gli alleli minori AG e in particolare l’omozigote GG, cui è associata la sintesi di un’aromatasi dalla ridotta attività enzimatica, presentano una frequenza estremamente bassa e nel gruppo test è pari a 0 per quanto riguarda l’allele GG (Grafico 4.5).

SNP di Aromatasi Arg264Cys 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Test Controllo Aromatasi Arg264Cys AA Aromatasi Arg264Cys GG-AG

Grafico 4.5. Grafico che mostra le frequenze alleliche medie per il polimorfismo di Arom Arg264Cys.

Discussione

I recenti progressi della biologia molecolare e la decodifica del genoma umano permettono, oggi, di valutare la presenza di mutazioni ed alterazioni nell’espressione di geni coinvolti nel metabolismo e nell’azione dei farmaci.

La farmacogenetica è il campo dell’epidemiologia che studia l’associazione tra i fattori genetici e la probabilità dei pazienti di rispondere ad un medicinale o di sviluppare effetti collaterali in seguito aIla sua somministrazione (Dodson et al. 2009). Negli ultimi anni, questa disciplina ha subito un notevole sviluppo assieme alla farmacogenomica, branca della farmacologia che analizza il DNA/RNA al fine di identificare e sviluppare nuove molecole farmacologiche (Di Paolo et al. 2004 e Shastry 2006).

Un possibile ruolo dei fattori genetici nella patogenesi delle lesioni osteonecrotiche dei mascellari è stato proposto in letteratura.

Poiché soltanto una minoranza di soggetti che utilizzano BPs sviluppano necrosi ossea a livello delle ossa mascellari, è possibile che variazioni individuali di geni coinvolti nel metabolismo dei farmaci o nell’omeostasi ossea possano conferire una suscettibilità o una resistenza a sviluppare tale complicanza. Così l’ONJ potrebbe essere dovuta a un insieme di fattori, ambientali e genetici. La suscettibilità genetica potrebbe essere conferita da molteplici geni con piccole variazioni (De Gobbi et al. 2006).

Più recentemente, Sarasquete e collaboratori, approfondendo tale aspetto, hanno dimostrato che alterazioni genetiche (nella fattispecie polimorfismi di singoli nucleotidi) nel gene del citocromo P450-2C (CYP2C8) sono associate con un rischio aumentato di

caso-controllo su un campione di pazienti con mieloma multiplo trattati con BPs per via endo-venosa (Sarasquete et al. 2008).

Il presente studio rappresenta una delle prime applicazioni di analisi farmacogenetica volta all’identificazione di fattori di rischio per lo sviluppo di lesioni osteonecrotiche indotte da BPs.

Il campione preso in esame includeva 88 pazienti oncologici in terapia con acido zoledronico, suddivisi in due gruppi (test e controllo) a seconda che, rispettivamente, avessero sviluppato o meno lesioni osteonecrotiche.

L’età media è risultata essere di 67,3 anni nel gruppo controllo e di 70,5 anni nel gruppo test. Questi dati risultano conformi a quelli forniti dalla letteratura, che indica una frequenza maggiore nei soggetti di età superiore a 65 anni, con un range variabile dai 37 agli 85 anni (Woo et al. 2006); ciò è condizionato dalle co-morbidità correlate all’avanzamento dell’età, sia sistemiche che del cavo orale (Vescovi 2007).

L’analisi della patologia primaria ha evidenziato una prevalenza di pazienti affetti da carcinoma mammario e mieloma multiplo all’interno di entrambi i gruppi, test e controllo. Per quanto riguarda la distribuzione delle altre patologie si ha la completa omogeneità tra i due gruppi di pazienti. La patologia di base non è ritenuta essere un fattore determinante per l’insorgenza delle lesioni, ma la prevalenza di alcune patologie è puramente associata alla migliore prognosi che queste presentano (Coleman 2004) e alle eventuali terapie farmacologiche concomitanti utilizzate per il controllo delle stesse (Dodson et al. 2009). Inoltre, le lesioni osteonecrotiche hanno una incidenza maggiore nei soggetti affetti da patologia neoplastica poiché sono loro somministrate elevate posologie di BPs (Bertoldo et al 2007).

La durata del trattamento con acido zoledronico è superiore nel gruppo test (29,13 mesi) rispetto al controllo (19,46 mesi). Questi dati sembrano essere in accordo con quanto si ritrova in letteratura: nello studio condotto da Bamias e collaboratori nel 2005, si riporta che la durata media di esposizione ai BPs era stata di 30,3 mesi e 19 mesi, rispettivamente nel gruppi test e controllo (Bamias et al. 2005).

Il rischio di sviluppare ONJ aumenta progressivamente con il numero di dosi assunte ed è determinato dalla lunga emivita del farmaco stesso (Li 2003). Infatti, ogni dose aggiuntiva di zoledronato è associata con un aumento del rischio di osteonecrosi del 10% (Ortega et al. 2007).

All’interno del campione di pazienti inclusi nel presente studio, sono stati analizzati polimorfismi PvuII e XbaI del recettore ER-1 e del gene che codifica per l’espressione dell’aromatasi, enzima coinvolto nella regolazione del metabolismo osseo.

L’analisi dei polimorfismi di PvuII non ha evidenziato alcuna differenza significativa tra i gruppo test ed il gruppo controllo. In particolare la frequenza del genotipo TT, a cui è associata una maggiore espressione del recettore estrogenico, non differisce in modo significativo tra i due gruppi. Risultati analoghi sono stati ottenuti nell’analisi dei polimorfismi di XbaI, anche in questo caso la frequenza dell’allele GG, a cui è associata una maggiore attività da parte degli estrogeni sul tessuto osseo, non presenta differenze significative tra il gruppo test ed il controllo.

La frequenza di questi genotipi (TT per PvuII e GG per XbaI) all’interno del gruppo test è stata confrontata con le frequenze possedute dalla banca dati della Divisione di Farmacologia e Chemioterapia del Dipartimento di Medicina Interna dell’Università

gli SNP, differenze statisticamente significative. I risultati ottenuti per i polimorfismi del recettore ER-1 escludono un loro possibile ruolo nel meccanismo patogenetico delle ONJ indotte da BPs, ma non degli estrogeni.

A livello tissutale, il complesso dell’aromatasi P450 svolge, infatti, un ruolo essenziale nella modulazione dell’azione degli estrogeni, essendo responsabile della loro formazione, a partire dagli androgeni. Gli estrogeni sono tra i fattori regolatori dell’omeostasi del tessuto osseo. In particolare, essi hanno un’azione inibitoria sulle funzioni delle cellule osteoclastiche, riducendo di fatto il riassorbimento osseo.

D’altro canto, il meccanismo patogenetico delle lesioni osteonecrotiche provocate dai bifosfonati sembra proprio basarsi sull’effetto pro-apoptotico del farmaco sulle cellule osteoclastiche. Estrogeni e bifosfonati sembrano avere, dunque, un’azione sinergica.

Un polimorfismo nella regione 5’-non codificante di CYP 19, il gene codificante per tale enzima, si è rivelato in grado di influenzare la densità minerale ossea (BMD) e l’attività dell’enzima stesso. In particolare all’allele minore TT (prevalenza media nella popolazione caucasica del 22.6%) è stata associata un’elevata attività dell’aromatasi ed elevati livelli di BMD (Zarrabeita et al. 2004 e Enjuanes et al. 2006).

L’analisi di tale polimorfismo (C1531T), nel gruppo di soggetti che hanno sviluppato ONJ, ha evidenziato una maggiore frequenza dell’allele TT, pari al 36,67%, rispetto alla popolazione controllo, dove la frequenza era del 16,98%. Questa differenza risulta statisticamente significativa (p=0.037). Dati analoghi ai limiti della significatività sono stati ottenuti anche quando tale frequenza è stata confrontata con le frequenze possedute dalla banca dati

(23.38%). Quindi, nei soggetti affetti da ONJ si ha una maggiore espressione dell’enzima aromatasi a livello tissutale, che determina una maggiore concentrazione locale di estrogeni.

È, perciò, possibile ipotizzare un ruolo del polimorfismo C1531T nella patogenesi delle lesioni osteonecrotiche, in quanto all’azione pro-apoptotica svolta dai BPs si aggiungerebbe un maggior effetto degli estrogeni determinato dalla prevalenza dell’allele TT.

L’aromatasi presenta anche un polimorfismo non sinonimo Arg264Cys, la cui presenza influenza direttamente l’attività enzimatica. In particolare, i soggetti omozigoti GG presentano una ridotta attività aromatasica (Ma et al. 2005). L’analisi di questo polimorfismo nella popolazione in esame non ha mostrato, però, differenze statisticamente significative tra il gruppo test e il gruppo controllo. In entrambi i gruppi si ha la prevalenza del genotipo AA, cui è associata una elevata attività aromatasica e una maggiore conversione degli androgeni in estrogeni. Quindi, alla luce di questo risultato, sembra improbabile che tale polimorfismo sia coinvolto nella patogenesi dell’ONJ.

Conclusioni

La terapia con bifosfonati nei pazienti oncologici si è rivelata estremamente efficace nell’ottenere benefici in termini di riduzione dell’incidenza di eventi scheletrici e paliazione del dolore osseo, garantendo perciò un notevole miglioramento della qualità di vita di questi soggetti.

I bifosfonati sono farmaci generalmente ben tollerati, tuttavia negli ultimi anni sono comparse segnalazioni sempre più numerose di un grave effetto avverso, lo sviluppo di lesioni osteonecrotiche a carico delle ossa mascellari (ONJ).

L’ONJ indotta da BPs presenta aspetti clinici simili alla ‘ phossy jaw ‘, patologia altamente invalidante che colpiva gli addetti alla lavorazione del fosforo bianco nelle fabbriche di fiammiferi londinesi, alla metà del XIX secolo. Le lesioni possono variare da piccole lesioni endodontico-parodontali ad ampie aree di esposizione ossea con interessamento dei tessuti molli orali e peri- orali.

Spesso, nonostante si attuino terapie mediche e chirurgiche, non si riesce ad ottenere la guarigione di queste lesioni e possono permanere esiti altamente invalidanti per il paziente. Perciò, la prevenzione e l’identificazione dei fattori di rischio diventano fondamentali per contenere il problema. Negli ultimi anni, i clinici hanno tentato di definire linee-guida per la prevenzione e la gestione dell’ONJ indotta da BPs, tuttavia non esistono ancora opinioni univoche a riguardo.

La patogenesi dell’osteonecrosi da bifosfonati non è stata a oggi compresa in modo certo. L’ipotesi patogenetica più accreditata vede la causa primaria dello sviluppo di tali lesioni nell’azione dei

BPs sulle cellule osteoclastiche. Il farmaco ha un effetto pro- apoptotico su queste cellule e ciò provoca una riduzione e un ritardo del fisiologico processo di rimodellamento e guarigione del tessuto osseo, che espone il tessuto a sovrainfezioni batteriche da parte della ricca flora del cavo orale. Ogni intervento iatrogeno, come avulsioni dentarie e interventi di chirurgia sulle ossa mascellari, costituisce un fattore di rischio in quanto crea una ferita ossea che non tende a guarire e si infetta facilmente evolvendo in osteomielite e quindi osteonecrosi.

Il presente studio si basa su questa teoria patogenetica. I risultati ottenuti ci permettono di formulare l’ipotesi che il polimorfismo dell’aromatasi C1531T possa avere un ruolo nell’incrementare il rischio di sviluppo di osteonecrosi ma ulteriori studi saranno necessari per validare tale ipotesi.

Questo lavoro rappresenta una delle prime analisi farmacogenetiche nello studio dell’osteonecrosi dei mascellari indotta da BPs e può rappresentare il punto di partenza per ulteriori sperimentazioni. Lo scopo è quello di comprendere meglio il processo patologico alla base di questo evento avverso e sfruttare questa maggiore comprensione nella ricerca di strategie preventive più efficaci. In particolare, la speranza è quella di arrivare ad utilizzare una semplice analisi genetica, da effettuare su un campione di sangue prelevato dal paziente prima di intraprendere la terapia con bifosfonati, per identificare quei soggetti a rischio di sviluppare osteonecrosi e concentrare su di essi un’attenzione maggiore al fine di prevenire o individuare precocemente le lesioni.

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Ringraziamenti