H 2 S-DONORS

In soluzione acquosa, l'H2S è un acido debole; si dissocia in ioni idrogeno e idrosolfuro, che

a sua volta si dissocia in anione idrogeno e solfuro. A pH fisiologico, in accordo con l'equazione di Henderson-Hasselbach, circa il 20% del solfuro totale è indissociato, circa l'80% subisce la prima dissociazione, mentre la seconda dissociazione è trascurabile. Pertanto, in condizioni fisiologiche, coesistono quantità significative di H2S e di idrosolfuro

e entrambe le specie contribuiscono direttamente all'azione biologica dell'H2S (Hughes M.N.

et al. 2009). L'H2S non dissociato è altamente lipofilo; attraversa facilmente le membrane e

penetra in tutti i tipi di cellule. A causa di queste proprietà fisico-chimiche, i sali di idrosolfuro e solfuro sono composti efficaci come generatori di H2S, dopo la protonazione

in soluzione acquosa. L'idrosolfuro di sodio (NaHS), è il sale generante H2S più utilizzato a

45 formazione di H2S (che provoca effetti avversi, come un abbassamento acuto ed eccessivo

della pressione arteriosa), seguita da una rapida eliminazione del gas. Altri sali, come il

solfuro di calcio (CaS), sono stati proposti come possibile alternativa all’NaHS (Li Y.F. et

al. 2009), ma la velocità e il meccanismo di rilascio di H2S dei due sali inorganici sono quasi

equivalenti. I donatori ideali di H2S per uso clinico dovrebbero produrre tale gas con tassi di

rilascio lenti, apportando una concentrazione bassa e di lunga durata (Caliendo G. et al. 2010). Alcuni derivati di polisolfuro organico naturale, tipicamente presenti in diverse specie della famiglia delle Alliaceae, presentano questa caratteristica: agiscono come composti a lento rilascio di H2S e tale proprietà spiega gli effetti positivi promossi dall'aglio nel sistema

cardiovascolare. In particolare, il disolfuro di allile (DADS, Figura 9.) e il trisolfuro di allile (DATS, Figura 9.) dell'aglio rilasciano H2S con una velocità relativamente lenta, tramite un

meccanismo complesso che richiede la cooperazione di tioli endogeni (come il GSH ridotto). Secondo le proprietà di rilascio dell'H2S, sia DADS che DATS causano vasodilatazione

indipendente dall'endotelio (Benavides G.A. et al. 2007). Per quanto riguarda i donatori di H2S di origine sintetica, il derivato fosfinoditionato GYY4137 (morpholin 4-ium 4-

methoxyphenyl morpholino phosphinodithioate, figura 9.) è stato usato come donatore di H2S in un grande numero di studi sperimentali. Questo composto, precedentemente

utilizzato nella chimica industriale per la vulcanizzazione della gomma, si comporta come un donatore di H2S lento, che rilascia H2S spontaneamente, ma molto debolmente, in

soluzione acquosa a pH e temperatura fisiologici, per un tempo prolungato. Il rilascio di H2S

da GYY4137 è fortemente potenziato dal pH acido e ridotto dalle basse temperature (Li L. et al. 2008). Tuttavia, il rilascio di H2S da GYY4137, anche a pH 7,4, è significativamente

migliorato dalla presenza di tioli organici, come la L-cisteina (Martelli A. et al. 2013). GYY4137 induce forti effetti vasorilascianti, antagonizzati dai bloccanti KATP. È interessante notare come l’NaHS abbia mostrato una potenza vasorilasciante inferiore a quella del GYY4137, suggerendo che la presenza prolungata di basse concentrazioni di H2S

può garantire effetti farmacologici migliori rispetto a concentrazioni più alte, seguite da una rapida caduta. Di conseguenza, GYY4137 evoca una lenta riduzione della pressione arteriosa nei ratti ipertesi. GYY4137 è stato utilizzato come donatore di successo di H2S in

molte pubblicazioni scientifiche ed è stato uno strumento farmacologico molto utile per comprendere gli effetti biologici dell'H2S. Ad esempio, l'uso di GYY4137 ha fornito alcune

utili informazioni sul ruolo controverso di H2S e dei donatori di H2S nell'infiammazione.

Nei macrofagi del topo, la somministrazione di alte concentrazioni di NaHS ha aumentato la produzione di mediatori pro-infiammatori, come NO, TNFa, IL-1β e IL-6. Al contrario,

46 GYY4137 ha causato una significativa riduzione di questi mediatori e un concomitante aumento di mediatori antiinfiammatori, come la chemochina IL-10. Questi importanti dati sperimentali suggeriscono che anche gli effetti dei donatori di H2S sui processi infiammatori

sono influenzati dalla cinetica di rilascio di H2S, indicando nuovamente un profilo più

favorevole per i donatori di H2S lenti (Whiteman M. et al. 2010). Per quanto riguarda le

proprietà cardiovascolari di GYY4137, solo recentemente è stata studiata la sua capacità di fornire protezione miocardica contro il danno da ischemia-riperfusione. Il primo meccanismo proposto per la cardioprotezione mediata dal GYY4137, è stata l'attenuazione dello stress ossidativo e dell'apoptosi registrati nei ratti maschi trattati per via intraperitoneale con diversi dosaggi di GYY4137 (5, 12, 25 e 50 mg/kg die) per sette giorni. In ratti sottoposti a occlusione coronarica e riperfusione, GYY4137 è stato in grado di ridurre l'area ischemica e diminuire sia i livelli plasmatici della creatinchinasi, sia i livelli sierici di malondialdeide, mieloperossidasi e superossido. Inoltre, nel miocardio di ratti trattati, GYY4137 ha causato anche un aumento dell'espressione di Bcl-2 e una diminuzione dell'apoptosi, dell'espressione di Bax e dell'attività della caspasi-3 (Meng G. et al. 2015). In ulteriori esperimenti condotti su ratti Wistar maschi trattati per via intraperitoneale per 2 o 7 giorni con GYY4137 (100 mg/kg/48 h) e sottoposti a infarto miocardico acuto indotto dalla legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD), le dimensioni del ventricolo sinistro (LV) non hanno subito variazioni, la fibrosi LV risulta ridotta e i livelli dei peptidi natriuretici atriali e cerebrali (ANP e BNP) e di GMP ciclico risultano notevolmente aumentati. Questo risultato suggerisce un ruolo cardioprotettivo per GYY4137 anche nella fase post-ischemica e questo effetto è dovuto, almeno in parte, alla maggiore attivazione dei peptidi natriuretici endogeni (Lilyanna S. et al. 2015). L'effetto di post-condizionamento di GYY4137 è stato valutato anche in ratti maschi sottoposti a 30 minuti di occlusione coronarica sinistra, 10 minuti di riperfusione con GYY4137 a diverse dosi (6, 26, 133 o 266 μmol/kg) mediante iniezione endovenosa e 2 ore di riperfusione. Alla dose massima di 266 μmol/kg, GYY4137 è stato in grado di ridurre le dimensioni dell'infarto del 47% e al momento della riperfusione del cuore è stata aumentata la fosforilazione di Akt, eNOS e GSK-3β. È interessante notare che la co-somministrazione di GYY4137 e L-NAME (un inibitore della NOS), ha portato ad una minore cardioprotezione e una fosforilazione di eNOS inferiore (Karwi Q.G. et al. 2016). GYY4137 è quindi attualmente visto come un chemiotipo utile per lo sviluppo di nuovi H2S-donors, appartenenti alla classe chimica dei

difosfotionati (Whiteman M. et al. 2015).

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Figura 9. Strutture chimiche dei polisolfuri organici caratteristici della famiglia delle Alliaceae (DADS e DATS) e del donatore di H2S sintetico GYY4137.

Come già riportato, GYY4137 è stato uno dei composti pionieristici tra i donatori di H2S

lenti; tuttavia, esistono una serie di possibili alternative, che, finora, sono state sottovalutate e poco sviluppate. Tioglicina(Figura 10.) e tiovalina (Figura 10.) sono due tioaminoacidi che si comportano come donatori lenti di H2S. Rilasciano H2S in presenza di bicarbonato, a

pH e temperatura fisiologici (Zhou Z. et al. 2012). Anche i composti N-mercapto-derivati (Figura 10.) e derivati del pertiolo(Figura 10.) hanno mostrato proprietà di H2S-donor. In

questi composti, il rilascio di H2S è facilitato dalla presenza di tioli organici, come la L-

Cisteina (Zhao Y. et al. 2011; Zhao Y. et al. 2013). Recentemente, sono stati riportati anche interessanti esempi di donatori di H2S che esibiscono il gruppo gem-ditiolo (Figura 10.).

Questi donatori sono caratterizzati da una soddisfacente stabilità in acqua e mostrano una generazione di H2S relativamente lenta, che è innescata da tioli organici (Zhao Y. et al.

2014). Altre frazioni chimiche che rilasciano H2S, come il ditioletione(DTT,Figura 10.) e

la tioammide, sono donatori di H2S noti; sono stati ampiamente usati per sintetizzare farmaci

multifunzionali, ma sono stati usati raramente come donatori diretti di H2S (Martelli A. et

al. 2012). Per esempio, la 4-idrossibenzotioammide(4-HBTA, Figura 10.), a volte usata come moiety per sintetizzare i farmaci ibridi, mostra un rilascio di H2S più debole in soluzione

acquosa (a pH 7,4), ma la formazione di H2S è incrementata in presenza di tioli organici.

Lievi modifiche strutturali di questa tioammide, come l'inserimento di piccoli sostituenti sull'anello benzenico o la sostituzione dell'anello benzenico con eterocicli, hanno portato ad una serie di composti dotati di percentuali di rilascio di H2S molto diverse. Alcuni composti

sono risultati donatori di basse quantità di H2S; mentre alcuni derivati hanno mostrato tassi

di rilascio paragonabili o addirittura superiori a GYY4137 (Martelli A. et al. 2013). Secondo le proprietà di rilascio dell'H2S, la 4-HBTA ha promosso effetti vasorilascianti sui vasi

sanguigni isolati e ridotto la pressione sistolica nei ratti. 4-HBTA ha causato anche iperpolarizzazione, in maniera concentrazione dipendente, di cellule muscolari lisce

S S DADS S S S DATS O P S- N S O +_H 2N O GYY4137 Me

48 vascolari umane, coerentemente con gli effetti dell'H2S sui canali vascolari del potassio.

Pertanto, il gruppo tioammidico risulta essere molto versatile e può essere una risorsa preziosa per la progettazione di una serie quasi illimitata di donatori di H2S. Inoltre, semplici

modifiche strutturali possono assicurare una prevedibile regolazione dei tassi di rilascio di H2S (Martelli A. et al. 2013). Infine, il composto SG1002(Figura 10.), miscela di diversi

composti di zolfo inorganico, è degno di nota. SG1002 è un presunto H2S-donor, anche se

una dettagliata caratterizzazione chimica del rilascio di H2S non è stata ancora riportata. In

precedenti studi SG1002 ha mostrato effetti cardioprotettivi in modelli murini di malattie cardiache (Kondo K. et al. 2013). SG1002 è stato sottoposto a uno studio di fase I in soggetti sani e in pazienti con insufficienza cardiaca. La somministrazione orale di SG1002 ha comportato un aumento delle concentrazioni plasmatiche di H2S e della biodisponibilità

circolante di NO in soggetti sani e con insufficienza cardiaca, coerenti con le presunte proprietà di rilascio di H2S di questo composto (Polhemus D.J. et al. 2015).

Figura 10. Strutture chimiche dei tioaminoacidi tioglicina e tiovalina e di alcuni composti H2S- donors rappresentativi appartenenti alle classi di N-mercapto, pertiolo e gem-ditiolo. Strutture chimiche della tioammide (4-HBTA), del ditioletione (DTT) e del ciclo-octasolfuro (il composto più abbondante nella miscela SG1002).

SH NH2 O Tioglicina SH O NH₂ L-Tiovalina S H N O O N-mercapto derivato NH COOCH₃ S S OCH₃ O O

Derivato del Pertiolo

HO SAc SAc Derivato Di-acetilato del gem-ditiolo S S S HO DTT HO NH₂ S 4-HBTA S S S S S S S S SG1002

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