Valutazione del profilo cardioprotettivo di un nuovo isotiocianato H2S-donor in un modello sperimentale ex-vivo di ischemia/riperfusione miocardica.

UNIVERSITÀ DI PISA

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Magistrale in Farmacia

Tesi di Laurea

VALUTAZIONE DEL PROFILO CARDIOPROTETTIVO DI UN NUOVO

ISOTIOCIANATO H

S-DONOR IN UN MODELLO SPERIMENTALE

EX-VIVO DI ISCHEMIA/RIPERFUSIONE MIOCARDICA

Relatori:

Prof. Vincenzo Calderone

Dott.ssa Lara Testai

Correlatore:

Candidato:

Dott.ssa. Valentina Citi

Lorenzo Flori

I

1. INTRODUZIONE ... 1

1.1. BIOSINTESI DI H2S ... 3

1.2. CATABOLISMO H2S ... 7

1.3. DEFICIT DI H2S ENDOGENO NELLE PATOLOGIE CARDIACHE ... 9

1.4. RUOLO DI H2S NELLE PATOLOGIE CARDIACHE ... 10

1.4.1. DANNO DA ISCHEMIA/RIPERFUSIONE (I/R) ... 10

1.4.1.1. FASE ISCHEMICA... 11

1.4.1.2. FASE DI RIPERFUSIONE ... 13

1.4.1.3. MECCANISMI ENDOGENI DI CARDIOPROTEZIONE ... 17

1.4.2. ARITMIE CARDIACHE ... 20

1.4.3. FIBROSI MIOCARDICA ... 21

1.4.4. IPERTROFIA CARDIACA ... 22

1.4.5. INSUFFICIENZA CARDIACA ... 23

1.4.6. CARDIOMIOPATIA DIABETICA ... 24

1.5. MECCANISMI MOLECOLARI DI CARDIOPROTEZIONE DA PARTE DI H2S ... 25

1.5.1. AZIONE ANTIOSSIDANTE ... 26

1.5.2. EFFETTO ANTI-INFIAMMATORIO ... 27

1.5.3. H2S NELLA MODIFICAZIONE PROTEICA ... 29

1.5.4. PRESERVAZIONE DELLA FUNZIONE MITOCONDRIALE ... 29

1.5.5. AZIONE PRO-ANGIOGENICA ... 30

1.5.6. RIDUZIONE DEI MECCANISMI APOPTOTICI NEI CARDIOMIOCITI ... 31

1.5.7. CORRELAZIONE TRA NO E H2S (CROSS TALK) ... 33

1.5.7.1. INTERAZIONE CHIMICA TRA H2S E NO ... 33

1.5.7.2. RUOLO DI INTERAZIONE H2S-NO NEL SISTEMA CARDIOVASCOLARE (CVS) ... 34

1.5.8. REGOLAZIONE DI CANALI IONICI ... 38

1.5.8.1. CANALI DEL POTASSIO SARCOLEMMATICI E MITOCONDRIALI REGOLATI DA ATP (sarc-KATP E mito-KATP) ... 39

II

1.5.8.4. CANALI DEL Na+ VOLTAGGIO-DIPENDENTI ... 43

2. INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE ... 44

2.1. H2S-DONORS ... 44

2.2. ISOTIOCIANATI ... 49

3. SCOPO DELLA RICERCA ... 53

4. MATERIALI E METODI ... 54

4.1. ANIMALI ... 54

4.2. PROTOCOLLO 1: VALUTAZIONE DEL FLUSSO CORONARICO SU CUORE ISOLATO E PERFUSO ALLA LANGENDORFF. ... 54

4.2.1. ANALISI DEI DATI ... 56

4.3. PROTOCOLLO 2: ISCHEMIA/RIPERFUSIONE SU CUORE ISOLATO E PERFUSO ALLA LANGENDORFF ... 57

4.3.1. ANALISI DEI DATI ... 60

5. RISULTATI E DISCUSSIONE ... 61

1

1. INTRODUZIONE

I processi cellulari iniziano solitamente con il legame di un neurotrasmettitore o di un fattore umorale ad un recettore situato sulla membrana cellulare. L’interazione ligando-recettore genera il rilascio di un secondo messaggero capace di modulare l’attività cellulare. La scoperta dell’ossido nitrico (NO), il quale presenta un meccanismo di segnalazione indipendente dal recettore di membrana, ha permesso di ampliare la dottrina convenzionale riguardo la trasduzione del segnale intracellulare. Un altro importante gas endogeno, studiato dai ricercatori in molti campi scientifici, è il monossido di carbonio (CO). Queste nuove scoperte hanno portato alla necessità di classificare NO e CO per distinguerli dai classici neurotrasmettitori e fattori umorali dando così origine alla famiglia dei gas trasmettitori. Il solfuro di idrogeno (H2S) era conosciuto, fino a poco tempo fa, esclusivamente come un gas

tossico dall’odore di uova marce. Recentemente, però, con l’avanzamento delle tecnologie scientifiche, è stato possibile scoprire che H2S prende parte ad una serie di processi

fisiopatologici in molti tipi di cellule. Il metabolismo e le funzioni fisiologiche di H2S

permettono la sua classificazione come gas trasmettitore endogeno insieme all’ossido nitrico (NO) e al monossido di carbonio (CO).

I gas trasmettitori presentano una serie di caratteristiche comuni che permettono una corretta classificazione:

• Sono piccole molecole gassose capaci di attraversare liberamente le membrane biologiche.

• Hanno funzioni specifiche ben definite a concentrazioni fisiologicamente rilevanti. Per esempio, NO e CO partecipano entrambi alla vasodilatazione e trasmissione sinaptica nel sistema nervoso centrale.

• I loro effetti cellulari possono essere o non essere mediati da secondi messaggeri. • Devono avere specifici target cellulari e molecolari (Wang R. 2002).

Tutti e tre i gas, a concentrazioni appropriate, svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione di svariate funzioni fisiologiche. Ad esempio, inibiscono la contrazione della muscolatura liscia intestinale, agiscono sul sistema cardiovascolare causando vasodilatazione, promuovono l’angiogenesi ed esercitano un ruolo chiave nella cardioprotezione. Infine, sono coinvolti nella modulazione dei processi di sepsi esercitando

2 effetti protettivi diminuendo l'infiammazione (Kasparek M.S. et al. 2007; Li L. et al. 2009; Baumgart K. et al. 2009).

Negli ultimi anni, le ricerche si sono concentrate principalmente sullo studio delle proprietà di H2S osservando che il nostro organismo ne produce piccole quantità, contribuendo

all’omeostasi generale di alcuni organi e in particolar modo del sistema cardiocircolatorio (Figura 1.). Lo studio approfondito di questo più recente gas trasmettitore ha reso possibile la formulazione di un quadro più dettagliato riguardo le sue caratteristiche chimiche e biologiche (Tabella 1.) (Wagner F. et al. 2009).

Tabella 1. Caratteristiche fisiochimiche e biologiche di H2S (Wagner F. et al. 2009).

Figura 1. Storia del solfuro di idrogeno (H2S) come regolatore fisiologico dell'omeostasi cardiovascolare.

Tossicologia ambientale gas tossico dal caratteristico odore di uova marce

Fonti endogene sintetizzato in vari tessuti da enzimi specifici: Cistationina β sintasi (CBS), Cistationina γ liasi (CSE), 3-mercaptopiruvato solfotranferasi (3-MST) utilizzando come principale substrato la L-Cisteina

Cinetica di eliminazione Emivita di pochi minuti; i metaboliti comprendono tiosolfato, solfito, solfato

Meccanismi d’azione

Azione antiossidante, mantenimento normale funzionalità mitocondriale, riduzione apoptosi cardiomiociti, attività antiinfiammatoria, azione pro-angiogenica, regolazione canali ionici, incremento produzione NO

3

1.1. BIOSINTESI DI H

S

H2S è un acido debole e per questo, in soluzione acquosa, si dissocia in H+ e anione HS-,che

a sua volta può dissociarsi in H+ e anione solfuro (S2-):

H2S ↔ H+ + HS- ↔ 2H+ + S2-

A pH e temperatura fisiologici, circa il 20% dell’H2S totale è presente nella sua forma

indissociata, mentre il restante 80% è costituito dalla forma dissociata HS- (Dorman D.C. et al. 2002; Dombkowski R.A. et al. 2004). Pertanto, in condizioni fisiologiche, quantità significative di H2S e HS- coesistono ed entrambe le specie contribuiscono direttamente

all'azione biologica dell'H2S. Al contrario, i livelli dell’anione S2- sono trascurabili, in quanto

un'apprezzabile dissociazione dell'HS- richiederebbe valori di pH superiori a quelli fisiologici. A causa della sua elevata lipofilicità, l'H2S attraversa liberamente le membrane

biologiche e penetra in tutti i tipi di cellule conferendogli un elevato potenziale biologico (Li L. & Moore P.K. 2008). HS-, che rappresenta la specie prevalente, si comporta da nucleofilo legandosi a centri metallici di varie molecole biologiche, come il sito di legame dell'emoglobina per l’ossigeno. Questo comportamento chimico, insieme ad altri risultati catabolici, può portare ad un sostanziale abbassamento della concentrazione di solfuro nel corpo (Hughes M.N. et al. 2009).

L'H2S endogeno può essere prodotto nei tessuti dei mammiferi sia mediante vie enzimatiche

sia attraverso trasformazioni non enzimatiche. Il metodo non enzimatico, meno importante dal punto di vista quantitativo, procede attraverso la riduzione non enzimatica dello zolfo elementare (S0_{) ad H}

2S utilizzando elementi riducenti ottenuti dall'ossidazione del glucosio.

Oltre ad H2S, attraverso questa reazione, si ottiene anche il lattato; prodotto principale della

degradazione del glucosio:

2 C6H12O6 + 6 S0 + 3 H2O → 3 C3H6O3 + 6 H2S + 3 CO2

Tuttavia, dai dati sperimentali, emerge che per 2 molecole di glucosio consumato si formano 6 H2S e 2 CO2; la mancanza di una molecola di CO2 è probabilmente correlata all'escrezione

4 efficaci. Ad esempio, i portatori di elettroni NADH e NADPH sono probabilmente coinvolti in questo processo. Infatti, NADH, NADPH e glutatione (GSH) hanno dimostrato capacità stimolanti nella produzione di H2S in lisati cellulari eritrocitari umani (Searcy D.G. & Lee

S.H. 1998; Wang R. 2002).

Per quanto concerne la via enzimatica, i livelli basali della produzione di H2S nei tessuti dei

mammiferi sono determinati dall’attività di tre enzimi chiave (Figura 2.) e la loro distribuzione, come confermato da recenti studi, risulta essere tessuto-specifica:

Figura 2. Struttura dei tre enzimi responsabili della maggiore produzione, dal punto di vista quantitativo, di H2S.

• Cistationina β sintasi (CBS), è localizzato nel citoplasma ed è espresso principalmente nel fegato, rene, cervello, ileo, utero, placenta e isole pancreatiche ed è il principale responsabile della produzione di H2S nel sistema nervoso centrale. Questo enzima

piridossal-5’-fosfato dipendente utilizza la L-cisteina come substrato principale per la produzione di H2S, portando anche alla formazione di una molecola di L-serina (Schema

1.) (Porter P. et al. 1974; Chen X. et al. 2004; Kamoun P. 2004).

L-Cisteina

L-Serina

Schema 1. Biosintesi di H2S regolata dell’enzima CBS.

H

S

+ CBS

5 L’importanza di questo enzima nella produzione di H2S è supportata dal fatto che, in un

modello murino, la delezione genetica di CSE provoca una significativa diminuzione della concentrazione di H2S nel sangue e negli organi del sistema cardiovascolare (CV), che è

accompagnata da ipertensione e riduzione delle risposte vasorilascianti (Yang G. et al. 2008).

• Cistationina γ liasi (CSE), anch’essa di localizzazione citoplasmatica, è particolarmente espresso a livello del sistema cardiovascolare dove rappresenta l’enzima chiave nella produzione di H2S. Quantità ridotte di tale enzima sono state riscontrate anche in fegato,

rene, ileo, aorta toracica, vena porta, utero, placenta e ancora più debolmente nel cervello. (Kaneko Y. et al. 2006; Patel P. et al. 2009; Stipanuk M.H. & Beck P.W. 1982). Questa seconda via enzimatica prevede la trasformazione di 2 molecole di L-cisteina nel dimero L-cistina (amminoacido solforato ottenuto per reazione ossidativa). Questo dimero è poi suddiviso in tiocisteina, piruvato e NH3 attraverso una reazione mediata da

CSE. A sua volta, la tiocisteina può subire due diversi processi: uno non enzimatico, con conseguente formazione di L-cisteina e H2S, o una reazione CSE-dipendente con un

composto tiolico R-SH (come cisteina o glutatione), con conseguente produzione di H2S

e CysS-R (Schema 2.) (Yamanishi T. & Tuboi S. 1981).

6 • 3-mercaptopiruvato solfotransferasi (3-MST), a differenza di CBS e CSE è localizzato sia a livello citoplasmatico che mitocondriale (approssimativamente 2/3 di 3- MST sono situati all’interno dei mitocondri) (Wagner F. et al. 2009; Lavu M. et al. 2011). Questa terza via coinvolge anche l'enzima cisteina aminotransferasi (CAT), che catalizza la reazione tra L-cisteina e α-chetoglutarato (α-KG), portando alla formazione di Lglutammato e 3-mercaptopiruvato (3-MP); quest’ultimo composto può essere poi desolforato dalla 3-MST producendo piruvato e H2S. In alternativa, quando sono

disponibili ioni solfito (SO32-), il 3-MP può essere convertito in piruvato e tiosolfato

(S2O32-), che a sua volta reagisce con il GSH nella sua forma ridotta per produrre H2S,

SO32- e glutatione ossidato (GSSG) (Schema 3.) (Kuo S.M. et al 1983; Shibuya N. et al.

2009a).

Schema 3. Biosintesi di H2S regolata dall’enzima 3-MST.

Recenti studi hanno dimostrato che il 3-MP (substrato dell’enzima 3-MST) può essere prodotto anche a partire dalla D-cisteina mediante l’intervento di un enzima noto come D-amminoacido ossidasi (DAO) (Schema 4.). DAO è localizzato nei perossisomi, mentre il 3-MST si trova principalmente nei mitocondri (Shibuya N. et al. 2009b). I mitocondri e i perossisomi, che sono organelli cellulari essenziali nei mammiferi, scambiano vari metaboliti e enzimi attraverso una forma specifica di trasporto vescicolare e sono di solito in stretta vicinanza l'uno con l'altro se non direttamente in contatto fisico tra loro. 3-MST e DAO possono quindi produrre H2S mediante

7

Schema 4. Percorsi di biosintesi di H2S (evidenziata la via di formazione del 3-MP a partire dalla D-cisteina).

1.2. CATABOLISMO H

S

Per quanto riguarda i processi responsabili della "distruzione" di H2S, è interessante notare

che l'H2S è una specie riducente che può essere facilmente consumata da una varietà di agenti

ossidanti circolanti (Whiteman M. et al. 2005; Chang L. et al. 2008).

Un importante percorso del catabolismo dell'H2S (probabilmente il principale) opera nei

mitocondri. In particolare, è stato recentemente osservato che nel fegato di ratto, i mitocondri possono ossidare efficacemente l'H2S, con tassi di consumo di ossigeno circa quattro volte

più bassi di quelli osservati per l'ossidazione del substrato fisiologico succinato. Il meccanismo di ossidazione procede attraverso diversi passaggi enzimatici, mediati da chinone ossidoreduttasi, S-deossigenasi e S-transferasi e, nel complesso, porta alla formazione di tiosolfato (S2O32-). Il tiosolfato viene inoltre biotrasformato dalla rodanasi a

solfito (questa reazione richiede anche la presenza di cianuro, che viene convertito in tiocianato), che a sua volta viene ossidato a solfato (SO42-) dalla solfito ossidasi (SO)

(Schema 5.) (Goubern M. et al. 2007; Hildebrandt T.M. & Grieshaber M.K. 2008).

8 Nei mitocondri:

2HS

_2O

S

O

H

O

S

O

CN

SCN

SO

SO

SO

Schema 5. Catabolismo dell’H2S a livello mitocondriale.

Sebbene il solfato inorganico sia il principale prodotto stabile del catabolismo dell'H2S, non

può essere considerato un bio-marker affidabile per un’accurata valutazione quantitativa della produzione di H2S nel sangue dei mammiferi. Infatti, gli ioni solfato possono anche

essere generati da altre fonti, come l'ossidazione diretta della cisteina da parte della cisteina deossigenasi e l'ossidazione dei solfiti prodotti da altre fonti (Li L. et al. 2009). Inoltre, a causa della natura chimica dell'H2S, l'ordine di grandezza delle sue concentrazioni

plasmatiche, riflette la somma della specie non dissociata (H2S) e dei suoi congeneri

dissociati: HS- (la specie più abbondante a pH fisiologico) e anioni solfuro (S2-), (le cui quantità sono trascurabili a pH fisiologico) (Olson K.R. 2009). Sono anche noti altri meccanismi, coinvolti nel catabolismo dell'H2S: la sulfemoglobina risulta dalla reazione tra

H2S e metaemoglobina e può essere vista come un possibile bio-marker di H2S plasmatico

(Schema 6.) (Kurzban G.P. et al 1999).

Nel sangue:

H

S

Metaemoglobina Sulfemoglobina

Schema 6. Catabolismo dell’H2S a livello ematico. rodanasi

SO ossidazione

9 Un via alternativa, che opera solo nel citosol cellulare e coinvolge quantità minori di H2S, è

la metilazione di H2S da parte della tiolo S-metiltransferasi (TSMT) per produrre

metanotiolo e quindi dimetilsolfuro (Schema 7.) (Furne J. et al. 2001).

Nel citosol:

H

SCH

-SH CH

-S-CH3

Schema 7. Catabolismo dell’H2S a livello citoplasmatico.

1.3. DEFICIT DI H

S ENDOGENO NELLE PATOLOGIE

CARDIACHE

La scoperta della CSE nel cuore del ratto e l'identificazione dell'H2S come importante

modulatore rappresentano un fondamentale passo avanti nello studio del ruolo dell'H2S nella

funzionalità cardiaca. L'aumento delle evidenze sperimentali ha dimostrato che la variazione dei livelli endogeni di H2S è rilevante nel contesto di malattie cardiache. In recenti studi

clinici, è stato rilevato che i livelli di H2S plasmatici erano significativamente diminuiti nei

pazienti con malattia coronarica rispetto a quelli in soggetti di controllo angiograficamente normali. Inoltre, è stato evidenziato che i livelli di H2S plasmatici in pazienti con angina

instabile erano significativamente inferiori rispetto a quelli con angina stabile (Jiang H.L. et al. 2005). In aggiunta, studi successivi mostrano che i pazienti con insufficienza cardiaca avevano una marcata riduzione dei livelli circolanti di H2S rispetto ai controlli di età

corrispondente (Polhemus D.J. et al. 2014). Ulteriori studi condotti con modello sperimentale animale dimostrano inoltre che la produzione endogena di H2S è

significativamente ridotta in molte altre malattie cardiache, tra cui ischemia miocardica, infarto miocardico (MI), fistole artero-venosa indotta o spontanea e ipertensione spontanea o indotta (Liu Y.H. et al. 2012). Questi risultati suggeriscono che la malattia cardiaca può compromettere la sintesi endogena di H2S, che può a sua volta esacerbare ulteriormente lo

stato di malattia. Questi risultati sono prove evidenti che supportano il coinvolgimento di H2S endogeno nel mantenimento delle funzioni fisiologiche basali del cuore (Shen Y. et al.

2015).

10

1.4. RUOLO DI H

S NELLE PATOLOGIE CARDIACHE

maggior parte dei disturbi cardiaci. Prove crescenti hanno rivelato che l'H2S migliora la

funzionalità cardiaca e le complicanze cardiache in diverse condizioni patologiche, come lesioni miocardiche causate da ischemia/riperfusione (I/R), infarto miocardico, aritmia cardiaca, ipertrofia cardiaca, fibrosi miocardica e insufficienza cardiaca (Figura 3.) (Shen Y. et al. 2015).

Figura 3. Effetti cardioprotettivi dell'H2S in diverse patologie cardiache (Shen Y. et al. 2015).

1.4.1. DANNO DA ISCHEMIA/RIPERFUSIONE (I/R)

L'ischemia acuta del miocardio è una delle principali cause di morbilità nella società occidentale e, nonostante i recenti progressi nella terapia, rimane una delle principali cause di mortalità (Lloyd-Jones D. et al 2010). Infatti, il ridotto apporto di sangue coronarico, porta alla morte cellulare e alla perdita di cardiomiociti, con conseguenze gravi e spesso irreversibili sulla funzionalità miocardica. L’angioplastica è l’approccio primario per ottenere riperfusione immediata ed è il trattamento definitivo per la malattia coronarica occlusiva per ridurre l'entità dell'infarto miocardico. Senza riperfusione, l'intera area coinvolta dall’occlusione coronarica diventa necrotica. Sebbene un intervento di riperfusione tempestiva possa ridurre le dimensioni dell'infarto e migliorare i tassi di sopravvivenza, l'insorgenza di lesioni e quindi il danno tissutale possono aumentare dopo il

11 ripristino del normale flusso sanguigno. L'ischemia miocardica innesca una cascata di lesioni tissutali che possono essere esacerbate dalla riperfusione (Vinten-Johansen J. et al. 2007).

La necrosi e l'apoptosi sono due forme di morte cellulare nel miocardio che sono state associate con ischemia e riperfusione. Sebbene sia stato ben documentato che la necrosi, come forma principale di morte dei cardiomiociti, porta rapidamente alla distruzione di un ampio numero di cellule dopo ischemia miocardica e riperfusione, l'induzione dell'apoptosi nel miocardio, innescata principalmente durante la riperfusione, può contribuire indipendentemente all'estensione della morte cellulare (Zhao Z.Q. & Vinten-Johansen J. 2002).

I meccanismi metabolici che innescano la morte cellulare sono differenti nella fase ischemica e nella fase riperfusiva (Figura 4.).

1.4.1.1. FASE ISCHEMICA

• Diminuzione di ATP.

Per mantenere l'omeostasi cellulare, l'uso intracellulare di ATP e fosfati ad alta energia è di fondamentale importanza. Il metabolismo energetico cellulare dipende dall'acetil-CoA, che viene generato tramite glicolisi o beta-ossidazione degli acidi grassi liberi e viene quindi metabolizzato attraverso il ciclo di Krebs, che fornisce un’elevata resa di ATP. I cardiomiociti sono ricchi di mitocondri perché all'interno del miocardio viene consumata una grande quantità di ATP necessaria a garantire il funzionamento dei normali processi fisiologici e questa richiesta di ATP può essere soddisfatta solo dal metabolismo aerobico. Quando il cuore è esposto all'evento ischemico, i vasi arteriosi si dilatano significativamente per aumentare il flusso sanguigno coronarico fino a tre-cinque volte sopra i livelli basali e per fornire più ossigeno possibile e mantenere il fabbisogno aerobico. Tuttavia, a causa della mancanza di vie metaboliche anaerobiche sufficienti a compensare il drastico calo energetico, l'assenza di una fornitura di ossigeno adeguata porta all'esaurimento dell'ATP intra-miocardico in un breve periodo di tempo, rendendo il miocardio molto suscettibile al danno ischemico (Sanada S. et al. 2011).

12 • Abbassamento del pH intracellulare.

La glicolisi anaerobica prevale nel miocardio ischemico, l’acido lattico che si forma non è più in grado di essere convertito in acetil-CoA a causa della mancanza di ossigeno e quindi si accumula nella cellula causando una rapida diminuzione del pH intracellulare. Entro alcuni minuti, questo calo si traduce in arresto contrattile e rigonfiamento cellulare. Inizialmente, per tamponare questa diminuzione del pH, l'eccesso di H+ viene escreto dall’antiporto Na+_/H+_{, che a sua volta causa un sostanziale afflusso di Na}+ _{nella cellula (Pike}

M.M. et al. 1993). Nel frattempo, la deplezione intracellulare di ATP inattiva gradualmente gli scambiatori ATP-dipendenti come la pompa Na+_/K+ _{ATP-asi e l'escrezione di Ca}2+

ATP-dipendente, con conseguente sovraccarico di Na+ _{e Ca}2+ _{all’interno della cellula (Marban E.}

et al. 1987). Questo accumulo generale di Na+ porta al blocco dell’antiporto Na+/H+ (che in condizioni normali espelle H+ dalla cellula facendo entrare Na+) causando un’ulteriore riduzione di pH che andrà a sommarsi a quella causata dall’accumulo di acido lattico (Sanada S. et al. 2011).

• Overload di Ca2+_.

Il massiccio aumento di Na2+ all’interno della cellula, non è responsabile soltanto dell’abbassamento del pH, ma causa anche un blocco o un’inversione dell’antiporto Na+/Ca2+ con conseguente accumulo di Ca2+ intracellulare. L’aumento delle concentrazioni intracellulari di Ca2+ è inoltre accentuato dai canali di membrana voltaggio dipendenti del Ca2+ (VOC) attivati da una parziale depolarizzazione causata dal massiccio accumulo di Na+ nella cellula. In condizioni normali il Ca2+ verrebbe subito espulso dalla cellula grazie ad un meccanismo di trasporto attivo ATP-dipendente selettivo per questo catione bivalente e mediante l’antiporto Na+_/Ca2+ _{precedentemente analizzato, ma, a causa della deplezione di}

ATP questi meccanismi vengono meno. Gran parte del Ca2+ _{accumulatosi nella cellula viene}

poi immagazzinato nei mitocondri con conseguente depolarizzazione di membrana (overload di Ca2+_).

• Produzione di ROS (Reactive Oxygen Species).

Durante l'episodio di ischemia, la concentrazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) mostra un comportamento bifasico: nei primi minuti, viene prodotta una piccola quantità di ROS, mentre dopo 20-25 minuti si forma una concentrazione di ROS drammaticamente più alta. L'esaurimento dell'ATP, insieme ad elevati livelli di Ca2+ intracellulare e ROS, porta la

13 cellula a un declino graduale e irreversibile della sua integrità (Halestrap A.P. et al. 1998; Halestrap A.P. et al. 2004; Solaini G. & Harris D.A. 2005).

Questi cambiamenti sono anche accompagnati da una successiva attivazione di proteasi intracellulari, come la Calpaina, che causa l’insorgenza di fragilità strutturale, portando a necrosi e attivazione della cascata apoptotica. Ognuno di questi fattori può verificarsi in pochi minuti, ma procedono gradualmente, rallentati da un basso pH intracellulare. Questo concorda con l'osservazione che la riossigenazione entro 5 minuti evita danni cellulari irreversibili, mentre se l’ischemia si protrae per più di 15 minuti vengono colpite gradualmente le strutture intracellulari causando danni irreversibili (Mauser M. et al. 1985).

1.4.1.2. FASE DI RIPERFUSIONE

• Ripristino della produzione di ATP.

Una pronta riperfusione e riossigenazione determina un rapido ripristino dei substrati essenziali per la generazione di ATP, come glucosio o acidi grassi liberi. Questi fattori sono cruciali per la prevenzione di ulteriori lesioni ischemiche e per il restauro dell’omeostasi cellulare; tuttavia, possono anche contemporaneamente causare danno da riperfusione (Skyschally A. et al. 2009a).

• Stabilizzazione del pH fisiologico.

La rapida riattivazione della produzione di ATP fino a valori fisiologici permette il ripristino delle funzionalità degli scambiatori ATP-dipendenti. Tra questi, il più importante è sicuramente la pompa Na+/K+ ATP-asi che favorisce lo smaltimento del Na+ accumulatosi dentro la cellula durante la fase ischemica. Questo scenario porta alla riattivazione dell’antiporto Na+_/H+ _{permettendo l’eliminazione di H}+ _{e il ripristino dei valori fisiologici}

di pH (Sanada S. et al. 2011).

• Overload di Ca2+_.

Questa massiccia fuoriuscita di H+, che nelle fasi iniziali della riperfusione porta ad una rapida normalizzazione di pH, causerà un massiccio ingresso di Na+ che andrà a sommarsi a quello non ancora completamente smaltito, accumulatosi durante la fase ischemica. Questa situazione si traduce in un ulteriore accumulo di Ca2+ _{dovuto al blocco o all’inversione}

14 dell’antiporto Na+_/Ca2+ _{e all’ingresso di ulteriore Ca}2+ _{attraverso i canali voltaggio}

dipendenti di tipo L (Schäfer C. et al. 2001). Le cellule, provate da una lunga ischemia, non sono in grado di ristabilire rapidamente l’omeostasi del Ca2+ intracellulare. Solo dopo 30-60 minuti di riperfusione avviene una graduale ripresa dell’escrezione e il reimmagazzinamento ATP-dipendente di Ca2+ nel reticolo sarcoplasmatico.Nel frattempo, questo accumulo di Ca2+ nei primi stadi della riperfusione, unito alla rapida normalizzazione del pH intracellulare, è responsabile di una serie di fenomeni che accelerano il danno cellulare: attivazione di lipasi, nucleasi e proteasi che minano la struttura cellulare (in particolar modo viene attivata la Calpaina, proteasi Ca2+ dipendente, la cui azione destrutturante della membrana cellulare era inibita dall’abbassamento del pH) (Inserte J. et al. 2011; Kitakaze M. 2010).

• Produzione di ROS (Reactive Oxygen Species).

L’improvvisa riossigenazione permette di ripristinare il normale funzionamento della catena respiratoria mitocondriale. Questa attivazione, provoca un rapido recupero del metabolismo aerobico fondamentale per la ripresa della produzione di ATP, avendo però, come conseguenza, un accumulo di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e dell’azoto, in particolare di anione superossido (O2-). Fisiologicamente, il superossido diventa perossido di idrogeno

(H2O2) tramite la Superossido Dismutasi (SOD), ed è successivamente inattivato dalle

catalasi mediante trasformazione in H2O e O2 (Gross E.R. et al. 2004). Tuttavia, l’ischemia

può aver compromesso i meccanismi antiossidanti della cellula e, se i mitocondri non sono in grado di eliminarli, la cospicua generazione di ROS, genera radicali ossidrilici molto instabili e quindi capaci di danneggiare le strutture cellulari, gli enzimi e le proteine di membrana (Taga R. & Okabe E. 1991). Questi eventi, insieme alla liberazione di citochine pro-infiammatorie e catecolammine, producono cellule più suscettibili alla morte o a disfunzioni contrattili del miocardio immediatamente dopo l'inizio della riperfusione (Sekili S. et al. 1993). Inoltre, l’alterata regolazione intracellulare di Ca2+ _{e ROS può propagarsi a}

cellule adiacenti attraverso giunzioni gap diffondendo ulteriormente la lesione (Rodríguez-Sinovas A. et al. 2007).

• Apertura del poro MPTP (Mitochondrial Permeability Transition Pore).

MPTP è un poro ad alta conduttanza, ancorato tra la membrana mitocondriale esterna e la matrice mitocondriale. Quando è assemblato, consente la connessione tra il citoplasma e la matrice mitocondriale stessa (Hunter D.R. et al. 1976). È formato da un riarrangiamento del

15 canale anionico voltaggio-dipendente, situato nella membrana mitocondriale esterna, con il trasportatore del nucleotide adenina e il traslocatore proteico (TSPO), situato nella membrana mitocondriale interna e la ciclofillina D nella matrice mitocondriale (Crompton M. & Andreeva L. 1993; Griffithsn E.J. & Halestrap A.P. 1993; Heusch G. et al. 2010). Si ritiene che durante l'ischemia l'MPTP sia chiuso, dal momento che il poro è fortemente inibito dal basso pH (<7) (Halestrap A.P. 1991). Effettivamente la rapida energizzazione dei mitocondri durante la riperfusione porta ad un assorbimento elettrogenico di Ca2+, precedentemente accumulato nel citosol durante l'ischemia. Questo fattore, insieme all'aumento della produzione di ROS e al recupero del pH neutro, promuove l'apertura di MPTP (Skyschally A. et al. 2008; Kim J.S. et al. 2006; Kimura Y. et al. 1992).L'apertura di un singolo poro in un mitocondrio è sufficiente a causare la sua depolarizzazione immediata, e quindi l'ulteriore apertura di MPTP, dal momento che la sua attivazione è innescata dalla depolarizzazione (Scorrano L. et al. 1997). Come conseguenza dell’apertura di MPTP, tutti i piccoli soluti di peso molecolare <1,4 kDa si equilibrano attraverso la membrana interna; al contrario, le molecole più grandi (cioè le proteine) rimangono intrappolate nella matrice, esercitando una pressione osmotica che porta all'assorbimento di acqua e al conseguente gonfiore della matrice (Ryu S.Y. et al. 2010; Zoratti M. et al. 2005). Sebbene il dispiegamento delle creste consenta alla matrice di espandersi senza rottura della membrana interna, quella esterna si rompe e porta al rilascio di proteine pro-apoptotiche, confinate nello spazio intermembrana, come il citocromo c (Bernardi P. 1999; Doran E. & Halestrap A.P. 2000; Martinou J.C. & Green D.R. 2001). Vi è una crescente evidenza che il tempo di apertura di MPTP è strettamente correlato all'entità del danno. Infatti, gli inibitori dell'apertura dei pori (come la ciclosporina A) proteggono il cuore dalle lesioni e, per questo, molte strategie di precondizionamento mirano ad inibire l'apertura di MPTP (Javadov S.A. et al. 2003; Griffiths E.J. & Halestrap A.P. 1993; Skyschally A. et al. 2010; Piot C. et al. 2008).

16

Figura 4. La figura A rappresenta schematicamente i processi durante l'evento ischemico. L'evento ischemico causa una deplezione nella produzione di ATP (1) inibendo la pompa Na+_/K+_{-ATPasi (2)} e portando all'aumento della concentrazione di Na+ _{(3). L'alta concentrazione intracellulare di Na}+ _è responsabile del blocco o dell’inversione dell’antiporto Na+_/Ca2+ _{e causa l'apertura dei canali} voltaggio-dipendenti del Ca2+ _{(4-5) provocando un sovraccarico di Ca}2+_{. Inoltre, l'elevata} concentrazione intracellulare di Na+ _{inibisce l'antiporto Na}+_/H+_{, con conseguente acidosi} intracellulare (6). In condizioni fisiologiche l'accumulo di Ca2+ _{nella matrice mitocondriale sarebbe} un segnale di apertura di MPTP, ma, nella condizione ischemica, il pH acido inibisce l'attivazione di tale poro (7). La figura B rappresenta schematicamente i processi durante l'evento di riperfusione. La riperfusione promuove il ripristino dei livelli di ATP (1), l'attività di Na+_/K+_{-ATPasi viene ripristinata} (2), con la conseguente normalizzazione degli elettroliti intracellulari (3). Il pH fisiologico, unito agli alti livelli di Ca2+_{, provoca l'apertura di MPTP (4), con conseguente attivazione di percorsi} proapoptotici. (Citi V. et al. 2018).

A

17

1.4.1.3. MECCANISMI ENDOGENI DI CARDIOPROTEZIONE

• Precondizionamento Ischemico (IPreC).

Brevi episodi transitori di I/R (tipicamente di 2-5 minuti) conferiscono al miocardio una maggiore resistenza contro un successivo e prolungato episodio grave di I/R. Questo fenomeno è noto come IPreC ed è riconosciuto come uno dei più potenti meccanismi cardioprotettivi endogeni. IPreC è stato descritto per la prima volta nei cuori di cane, e successivamente confermato in altre specie, compresi gli esseri umani (Murry C.E. et al. 1986; Yellon D.M. & Downey J.M. 2003; Kloner R.A. & Rezkalla S.H. 2006; Heusch G. 2013). In particolare, in questo complesso meccanismo sono riconosciute due fasi distinte di IPreC: una precoce, la "classic IPreC", che si protrae fino a 3 ore dopo lo stimolo, e una ritardata, la "second window of IPreC", che inizia circa 24 ore dopo lo stimolo di attivazione e si protrae fino a 3 giorni (Edwards R.J. et al. 2000; Bianes C.P. et al. 2003). La “classic IPreC” è dovuta al coinvolgimento di biomolecole già esistenti che agiscono come effettori, comprende reazioni che vengono completate in un breve periodo di tempo, come l'attivazione di canali ionici, la fosforilazione/attivazione di enzimi esistenti o il rapido turnover/traslocazione di sostanze,mentre la fase ritardata comporta reazioni che richiedono tempo, come la modulazione genomica con espressione di proteine canale, proteine recettoriali, enzimi o immunotrasmettitori (Hausenloy D.J. & Yellon D.M. 2007; Minamino T. 2012).

• Postcondizionamento Ischemico (IPostC).

Più recentemente, è stato dimostrato che brevi cicli intermittenti di riocclusione coronarica (tipicamente di 30 secondi) e riperfusione (30 sec), durante il primo minuto di riperfusione, dopo un grave evento ischemico, riducono la dimensione dell'infarto di circa il 40% nei cuori canini. Come osservato per IPreC, anche l'IPostC è stato confermato in molte altre specie di mammiferi (Skyschally A. et al. 2009b; Staat P. et al. 2005). Attualmente i meccanismi coinvolti nell’IPostC non sono stati completamente compresi, ma sono state osservate riduzione della produzione di ROS, del sovraccarico di Ca2+ mitocondriale e della liberazione di fattori pro-infiammatori (Heusch G. 2013; Zhao Z.Q. et al. 2003; Sun H.Y. et al. 2005).

18 • IPreC e IPostC remoti (ReIPreC, ReIPostC).

Recenti studi evidenziano che brevi cicli intermittenti di ischemia degli arti hanno fornito una protezione significativa durante l'infarto miocardico, preservando la funzionalità cardiaca e riducendo le aritmie tipiche della riperfusione (Schmidt M.R. et al. 2007). Analogamente, è stato osservato anche che brevi periodi di ischemia degli arti riducono il danno cardiaco dopo un periodo ischemico, inibendo lo stress ossidativo (Li C.M. et al. 2006). Ancora, gli episodi di ischemia renale, nel primo minuto di riperfusione, riducono la dimensione dell'infarto miocardico nei ratti (Kerendi F. et al. 2005). Questi fenomeni sono chiamati ReIPreC e ReIPostC (precondizionamento ischemico remoto e postcondizionamento ischemico remoto) e consistono in brevi episodi di I/R applicati a un organo distante dal cuore, prima o dopo un'ischemia prolungata, e permettono l’instaurarsi di fenomeni di cardioprotezione (Zhao Z.Q. 2010; Thielmann M. et al. 2013). Sebbene i meccanismi molecolari alla base di ReIPreC e ReIPostC non siano ancora compresi perfettamente (la maggior parte degli studi sono in gran parte osservazionali), questi fenomeni sono stati chiaramente osservati in molte specie di mammiferi, tra cui ratti, conigli e maiali, e necessitano probabilmente del trasferimento di fattori o segnali protettivi attraverso percorsi umorali e/o neuronali (Vinten-Johansen J. & Shi W. 2013).

• Precondizionamento farmacologico (Ph-PreC).

Una procedura clinica di IPreC, che anticipa un infarto del miocardio, è quasi impossibile da applicare, dal momento che l'esordio dell'infarto non può essere previsto. Al contrario, una strategia cardioprotettiva clinica basata su IPostC è concettualmente fattibile in pazienti con infarto miocardico acuto, ma mostra molti rischi e difficoltà (Yang X.C. et al. 2007). Comunque, la definizione delle vie di segnalazione di IPreC e IPostC apre la strada allo sviluppo farmacologico di strategie per imitare questa protezione con farmaci in grado di attivare le stesse vie mitocondriali (Fig. 2). L'IPreC, così come IPostC, che recluta vie di segnalazione analoghe, è mediato da numerosi fattori endogeni, tra cui l’adenosina, l’acetilcolina, la bradichinina, gli oppioidi e molecole gassose, come NO e H2S (Liu G. et

al. 1991; Yao Z. & Gross G.J. 1993;Zhang W.M. et al. 1996; Schulz R. et al. 1998). Inoltre, l'IPreC e l'IPostC sono coinvolti nell'attivazione di isoenzimi della proteina chinasi C (PKC) che a volte esercitano ruoli opposti sia nei normali stati di segnalazione che nella malattia, e probabilmente di altre chinasi, come RISK (chinasi di riperfusione e salvataggio lesioni), GSK3B (glicogeno sintasi chinasi 3 beta) e STAT3 (trasduttore di segnalazione e attivatore della trascrizione 3) (Heusch G. et al. 2008; Murriel C.L. & Mochly-Rosen D. 2003). Per

19 quanto riguarda la PKC, le isoforme ε e δ svolgono ruoli opposti nella cardioprotezione. In particolare, l'attivazione di PKCε media meccanismi di cardioprotezione, mentre l'attivazione di PKCδ favorisce la maggior parte delle lesioni indotte dall’ischemia miocardica (Chen L. et al. 2001). Evidenze sperimentali mostrano che PKCε attiva l'ALDH2 mitocondriale (aldeide deidrogenasi 2), che rimuove i prodotti di perossidazione lipidica proteggendo così le funzioni mitocondriali (Chen C.H. et al. 2008). Inoltre, ulteriori studi, hanno riferito che la traslocazione di PKCε può essere considerata come un ulteriore meccanismo di protezione: la fosforilazione diretta dei componenti di MPTP inibisce l'apertura del poro (Ping P. et al. 1997; Baines C.P. et al. 2002). Al contrario, l'inibizione di PKCδ durante la fase di riperfusione è cardioprotettiva. Effettivamente, l'attivazione di PKCδ innesca la piruvato deidrogenasi chinasi mitocondriale, inibendo così sia la piruvato deidrogenasi che la rigenerazione di ATP (Churchill E.N. et al. 2005). Inoltre, l'attivazione di PKCδ induce una perfusione insufficiente dei cardiomiociti dopo l'evento ischemico, portando così ad ulteriori lesioni tissutali (Ikeno F. et al. 2007). Tuttavia, il ruolo di PKC per la cardioprotezione nei mammiferi è ancora controverso. Ricercatori hanno riferito che l'inibitore della PKC, Staurosporina, non ha impedito l'IPreC nei suini (Vahlhaus C. et al. 1996). Inoltre, dopo alcune prove incoraggianti in cui la PKCδ veniva inibita all'inizio della riperfusione mostrando una riduzione del danno tissutale, lo studio clinico poi non ha mostrato alcun beneficio significativo (Mochly-Rosen D. & Grimes K. 2011). Oltre agli isoenzimi PKC, sono state proposte altre diverse proteine chinasi come mediatori della cardioprotezione. Ad esempio, STAT3 è stato recentemente identificato nei mitocondri e la sua espressione è correlata alla riduzione del danno miocardico da parte di IPreC e IPostC. Coerentemente, la delezione di STAT3 o la sua inibizione ha impedito la cardioprotezione mediata dalle strategie di condizionamento (Boengler K. et al. 2010; Heusch G. et al. 2011). Ancora una volta, diversi tipi di canali del potassio, presenti nelle membrane mitocondriali interne e simili a quelli presenti nella membrana plasmatica di diversi tipi di cellule, sono stati suggeriti come triggers ed effettori finali nella cardioprotezione. Attualmente, i canali al potassio ATP-sensibili e calcioattivati sono coinvolti nella regolazione del volume mitocondriale, del potenziale di membrana, del pH e dell'apoptosi (Inoue I. et al. 1991; Siemen D. et al. 1999). Un altro target interessante è rappresentato dalla connessina-43 (Cx43), una proteina transmembrana che consente la comunicazione diretta tra il citoplasma delle cellule adiacenti attraverso la formazione di giunzioni gap; è stata descritta nei mitocondri ed è stato dimostrato il suo coinvolgimento nel meccanismo di IPreC (Stowe D.F. et al. 2013). Interessante, come la Cx43 contribuisca all'assorbimento di potassio

20 mitocondriale, formando strutture simili a un emicanale o modulando i trasportatori ionici esistenti (Boengler K. et al. 2005; Miro-Casas E. et al. 2009; Boengler K. et al. 2013). Degna di nota è anche la possibilità che la connessina-43 possa essere coinvolta nella cardioprotezione indotta dal diazossido (attivatore dei canali KATP), perché, in topi con

deficit di connessina-43, il diazossido è privo di effetti benefici (Heinzel F. et al. 2005).

1.4.2. ARITMIE CARDIACHE

Le aritmie cardiache sono un problema importante nella terapia dell’I/R coronarica e costituiscono un grave rischio di morte improvvisa dopo occlusione di tali arterie (Pourkhalili K. et al. 2009). Le cause primarie delle aritmie indotte da I/R sono considerate i metaboliti endogeni, come i ROS, il Ca2+, la trombina e il fattore attivante piastrinico, prodotto e accumulato nel miocardio durante la riperfusione. Recenti studi hanno riscontrato che la riperfusione con NaHS, dopo ischemia, attenuava le aritmie nel cuore isolato e perfuso alla Langendorff e migliorava la funzione cardiaca durante I/R. Questi effetti potrebbero essere bloccati dalla Glibenclamide, bloccante del canale del potassio ATP sensibile (KATP),

indicando che l'effetto cardioprotettivo dell'H2S contro le aritmie durante la riperfusione

dipende, almeno parzialmente, dall'apertura del canale KATP (Zhang Z. et al. 2007). Ulteriori

ricerche hanno anche scoperto che il blocco della sintesi endogena di H2S aumenta sia la

durata delle aritmie indotte da I/R sia la gravità delle aritmie. Inoltre, il precondizionamento con 100 μM di NaHS attenua le aritmie nel cuore isolato, aumenta la vitalità cellulare e migliora la funzione cellulare nei cardiomiociti durante I/R. Questi effetti potrebbero essere mediati della proteina chinasi C (PKC) e dai canali KATP del sarcolemma (Bian J.S. et al.

2006). La Cx43 è la principale connessina ventricolare dei mammiferi e ha dimostrato di avere una stretta associazione con i fenomeni aritmici (Roell W. et al. 2007). Alcuni ricercatori hanno rilevato che l'H2S ha migliorato l'espressione di Cx43 nel tessuto cardiaco,

indicando che l'H2S endogeno può svolgere un ruolo importante nella regolazione della

funzionalità cardiaca e delle aritmie influendo anche su questo target (Huang J.L. et al. 2012). Inoltre, è stato osservato che una riduzione della produzione di H2S durante l'ischemia

può causare una sovrastimolazione della funzione β-adrenergica che è strettamente legata all'incidenza delle aritmie ventricolari (Yong Q.C. et al. 2008). L’applicazione esogena di H2S modula la funzione β-adrenergica proteggendo il cuore dalle aritmie cardiache. Sulla

21 cardioprotettivo e antiaritmico per quei pazienti con cardiopatia ischemica cronica il cui livello di H2S plasmatico è ridotto (Shen Y. et al. 2015).

1.4.3. FIBROSI MIOCARDICA

La fibrosi cardiaca è caratterizzata da un accumulo netto di proteine della matrice extracellulare nell'interstizio cardiaco e contribuisce alla disfunzione sistolica e diastolica in molti disturbi cardiaci (Qi G.M. et al. 2014). Sebbene l'attivazione e la proliferazione dei fibroblasti siano importanti per il mantenimento dell'integrità cardiaca e della sua funzionalità dopo la lesione, lo sviluppo di tessuto cicatriziale fibroso nella zona dell'infarto, spesso porta a complicanze croniche e insufficienze funzionali (Camelliti P. et al. 2005). Alcuni studi hanno evidenziato che la fibrosi cardiaca e l'apoptosi nell'insufficienza cardiaca cronica (CHF) sono state invertite dalla somministrazione di H2S, che ha evidenziato una

diminuzione dello stress ossidativo e proteolitico (Mishra P.K. et al. 2010). Inoltre, ulteriori ricerche, hanno rivelato che l'H2S previene marcatamente lo sviluppo della fibrosi cardiaca

e diminuisce il contenuto di collagene nel tessuto inibendo l'attività di Ang-II intracardiaco (Huang J.L. et al. 2012). È noto che più canali del potassio sono espressi in fibroblasti ventricolari cardiaci, per cui la loro modulazione può avere grande importanza nella fibrosi cardiaca (Li G.R. et al. 2009). È stato osservato che H2S, potenzialmente, modula la fibrosi

cardiaca inibendo la corrente di K+ a grande conduttanza Ca2+-attivata (BKCa), la corrente

transitoria esterna di K+ (Ito) e la corrente interna di K+,Ba2+-sensibile(IKir), indipendente

dai canali KATP, portando a diminuzione della proliferazione e soppressione del fattore di

crescita trasformante-β1 (TGF-β1) responsabile della trasformazione miofibroblastica atriale (Sheng J. et al. 2013). Studi recenti dimostrano che la terapia con H2S attenua

significativamente la fibrosi cardiaca indotta da ischemia, nei ratti con insufficienza cardiaca cronica (Wang X. et al. 2011). È stato inoltre dimostrato che il trattamento con H2S inibisce

sostanzialmente i fibroblasti cardiaci stimolati da Ang-II, come evidenziato dalla riduzione dell'espressione di collagene α-SMA e di tipo I e dalla soppressione efficace del fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF). Gli effetti benefici dell'H2S, almeno in parte, sono

stati associati ad una diminuzione funzionale dell'asse di segnalazione Nox4-ROS-ERK1/2 e ad un aumento dell'espressione dell'eme ossigenasi-1 (HO-1) (Pan L.L. et al. 2013).

22

1.4.4. IPERTROFIA CARDIACA

L'ipertrofia cardiaca, generalmente considerata un meccanismo di compensazione efficace, può mantenere o addirittura aumentare la gittata cardiaca. Tuttavia, a lungo termine, l'ipertrofia persistente porterà a dilatazione cardiaca, diminuzione della frazione di eiezione e successiva insufficienza cardiaca (Indolfi C. et al. 2002). L'ipertrofia patologica di solito si verifica in risposta ad un sovraccarico pressorio cronico o volumetrico, o a seguito di infarto miocardico. Un gran numero di esperimenti confermano che l'H2S gioca un ruolo

positivo nella protezione del cuore contro l'ipertrofia cardiaca. Alcuni esperimenti hanno dimostrato che l'H2S potrebbe migliorare la funzione cardiaca e limitare l'apoptosi delle

cellule miocardiche nel modello di ipertrofia indotta da isoproterenolo (ISO), riducendo l'espressione di Nox4 e la produzione di ROS nei mitocondri (Lu F. et al. 2013). Il trattamento di topi con solfato di sodio (Na2S) porta a una minore ipertrofia cardiaca e

dilatazione del ventricolo sinistro nonché a una migliore funzione ventricolare sinistra dopo l'induzione di insufficienza cardiaca in un modo dipendente da tioredoxina-1 (Trx1) (Nicholson C.K. et al. 2013). Inoltre, la terapia farmacologica con H2S, durante

l'insufficienza cardiaca, serve a mitigare il rimodellamento ventricolare sinistro patologico e ridurre l'ipertrofia miocardica, lo stress ossidativo e l'apoptosi. In un modello di ratto con ipertrofia cardiaca indotta dall'endotelina (proteina che costringe i vasi sanguigni provocando un aumento della pressione arteriosa), è stato rilevato che il trattamento con H2S

potrebbe ridurre l'indice di massa ventricolare sinistro e il contenuto di collagene miocardico e migliorare l'ipertrofia cardiaca (Yang F. et al. 2014). In un altro modello ipertrofico indotto dalla coartazione dell'aorta addominale, è stato evidenziato che la somministrazione esogena di H2S sopprime significativamente lo sviluppo di ipertrofia cardiaca e riduce notevolmente

i livelli di Ang-II nel tessuto cardiaco, suggerendo che H2S svolga un ruolo fondamentale

nello sviluppo dell'ipertrofia cardiaca indotta da sovraccarico pressorio (Huang J.L. et al. 2012). È interessante notare che recenti studi hanno dimostrato che la somministrazione di omogenato di aglio preparato a fresco, capace di generare H2S dopo interazione con proteine

cellulari, può attivare il fattore di trascrizione nucleare eritroide-2 (Nrf2) attraverso la via PI3K/AKT e attenuare l’ipertrofia cardiaca e lo stress ossidativo attraverso l'aumento del sistema di difesa antiossidante in ratti insulino-resistenti alimentati con fruttosio (Padiya R. et al. 2014).

23

1.4.5. INSUFFICIENZA CARDIACA

L’insufficienza cardiaca (HF) è una sindrome eterogenea che può derivare da una serie di stimolazioni patologiche, tra cui ipertensione cronica, infarto del miocardio o ischemia associata a malattia coronarica. La patogenesi dell'HF non è stata ancora completamente chiarita e gli attuali trattamenti per l'HF non sembrano essere così efficaci. La terapia con H2S ha recentemente dimostrato di migliorare l'insufficienza cardiaca indotta da ischemia in

un modello murino. L'iper-espressione cardiaca della CSE nei topi ha comportato un aumento della produzione di H2S endogeno e una protezione profonda contro l'insufficienza

cardiaca indotta da ischemia con significativa diminuzione della mortalità (Calvert J.W. et al. 2010). Al contrario, la delezione genetica della CSE in modelli murini di scompenso cardiaco ha mostrato un peggioramento della funzionalità miocardica e una maggiore dimensione dell'infarto (Kondo K. et al 2013). In un modello di scompenso cardiaco indotto dall'ipertensione, è stato dimostrato chiaramente che l'H2S ha rallentato la progressione verso

un rimodellamento avverso del ventricolo sinistro e indotto l'angiogenesi nel miocardio (Kondo K. et al 2011). Altri protocolli sperimentali hanno anche mostrato che la terapia con H2S attenua il rimodellamento e la disfunzione ventricolare sinistra nel contesto

dell'insufficienza cardiaca creando un ambiente pro-angiogenico (Polhemus D.J. et al. 2013). In un altro modello di insufficienza cardiaca indotta da sovraccarico pressorio, i topi trattati con Na2S hanno evidenziato fattori di pro-angiogenici avanzati, come le

metalloproteinasi di matrice-2 (MMP-2) e fattori anti-angiogenici soppressi, tra cui MMP-9 (Givvimani S. et al. 2013). L'H2S svolge anche un ruolo protettivo nell’insufficienza

cardiaca congestizia (CHF) indotta da sovraccarico volumetrico mediante l'espressione di proteine e l'espressione di mRNA per HO-1 (Zhang C.Y. et al. 2013). Altro target interessante sembra essere il sistema renina-angiotensina cardiaca locale (RAS), necessario per lo sviluppo di insufficienza cardiaca e il rimodellamento ventricolare sinistro. Recenti studi hanno dimostrato che il trattamento con NaHS potrebbe proteggere dall'insufficienza cardiaca isoproterenolo-indotta, sopprimendo i livelli di renina locale attraverso l'inibizione sia dell'infiltrazione mastocitaria che della degranulazione della renina, suggerendo un nuovo meccanismo per la cardioprotezione mediata da H2S contro l'insufficienza cardiaca

(Liu Y.H. et al. 2014). È stata inoltre riscontrata una marcata inibizione dell’apoptosi cardiaca e un rilevante miglioramento dei disordini mitocondriali con NaHS, che hanno portato alla cardioprotezione in un modello di insufficienza cardiaca. Ulteriori studi hanno anche dimostrato che NaHS diminuisce il rilascio del citocromo c dai mitocondri al

24 citoplasma, migliora i disordini mitocondriali e aumenta i livelli di mRNA e di proteine in un modello di ratto con insufficienza cardiaca indotta (Wang X. et al. 2011). Tutti questi studi illustrano che il percorso CSE/H2S svolge un ruolo fondamentale nella conservazione

della funzionalità cardiaca nell'insufficienza cardiaca.

1.4.6. CARDIOMIOPATIA DIABETICA

La cardiomiopatia diabetica (DCM) è un processo patologico che si verifica indipendentemente dalla malattia coronarica e dall'ipertensione, con conseguenti anomalie strutturali e funzionali del miocardio che portano a HF (Asghar O. et al. 2009). Il crescente aumento di dati ha dimostrato che l'H2S svolge un ruolo positivo nella regolazione del danno

miocardico diabetico. Uno studio recente ha mostrato che sia i livelli plasmatici di H2S che

la sua attività di sintesi plasmatica sono significativamente ridotti nei ratti con diabete indotto da streptozotocina (STZ) (Dutta M. et al. 2014). Inoltre, è stata rilevata una riduzione marcata di H2S nel plasma di pazienti diabetici di tipo 2 rispetto ai controlli sani (Jain S.K.

et al. 2010). Questi risultati suggeriscono il coinvolgimento di H2S nei processi patologici

diabetici. Recenti studi evidenziano che l'H2S esogeno esercita un effetto protettivo contro

la lesione indotta da elevati livelli di glucosio (HG) inibendo l'attivazione dei percorsi MAPK e ERK1/2 e prevenendo lo stress ossidativo nei cardiomioblasti di ratto (cellule H9c2) (Xu W. et al. 2013). Ulteriori studi riportarono anche che GYY4137, noto H2S-donor,

probabilmente protegge le cellule H9c2 dalla citotossicità indotta da HG mediante attivazione della via del segnale AMPK/mTOR (Wei W.B. et al. 2014). Inoltre, l'H2S può

ridurre lo stress ossidativo indotto da HG attivando la via Nrf-2/ARE e può esercitare effetti antiapoptotici nel diabetico inibendo i percorsi di JNK e MAPK e attivando la via di segnalazione PI3K/AKT (Zhou X. et al. 2015). È interessante notare i risultati di un recente studio, i quali dimostrano che la somministrazione di omogenato di aglio crudo in ratti alimentati con fruttosio favorisce l’attivazione del Nrf2 che a sua volta aumenta il livello di H2S, attiva la via PI3K/AKT e attenua l'ipertrofia cardiaca e lo stress ossidativo attraverso

l'aumento dei sistemi antiossidanti di difesa (Padiya R. et al. 2014). In un altro studio, utilizzando un modello di diabete indotto da STZ nei ratti, è stato dimostrato un importante potenziale terapeutico dell'H2S nella DCM. Hanno scoperto che la somministrazione

giornaliera di NaHS ha effetti antinfiammatori, antiossidanti e antiapoptotici e inibisce il declino della funzione cardiaca nel gruppo STZ + NaHS. Inoltre, ulteriori studi hanno

25 riscontrato che la somministrazione esogena di Na2S attenua la lesione da I/R miocardica

nei topi diabetici, suggerendo i potenziali effetti terapeutici dell'H2S nel trattamento di un

attacco cardiaco nel contesto del diabete di tipo 2 (Peake B.F. et al. 2013).

1.5. MECCANISMI MOLECOLARI DI

CARDIOPROTEZIONE DA PARTE DI H

S

Molti autori hanno dimostrato le proprietà cardioprotettive dell'H2S nella lesione da I/R

miocardica. Nell'ultimo decennio, il crescente interesse nell'esaminare i meccanismi di segnalazione che coinvolgono l'H2S in I/R ha parzialmente chiarito il suo ruolo, fornendo

nuove strategie farmacologiche nella gestione dell'ischemia miocardica (Figura 5.) (Citi V. et al. 2018).

Figura 5. Principali ruoli di H2S nella cardioprotezione.

26

1.5.1. AZIONE ANTIOSSIDANTE

Le specie reattive dell'ossigeno determinano lo stress ossidativo che contribuisce al danno miocardico dopo la lesione da I/R promuovendo la morte cellulare. A basse concentrazioni, i radicali liberi sono molecole di segnalazione endogena che diventano deleteri se la loro quantità diventa eccessiva (Dhalla N.S. et al. 2000). La loro produzione è principalmente legata alla catena respiratoria mitocondriale, al citocromo P450, al metabolismo dell'acido arachidonico, all'attivazione dei neutrofili e ai meccanismi antiossidanti difettosi (Ferrari R. et al. 1998;Kukreja R.C. & Hess M.L. 1992). In condizioni patologiche, un'elevata quantità di ROS ha effetti dannosi attraverso diversi processi: le ROS influenzano la trascrizione del gene che porta ad un aumento dei livelli di NF-kB e ossidano i lipidi di membrana portando alla perdita della sua integrità e della funzione cellulare (Elahi M.M. et al. 2009; Girotti A.W. 1985). Inoltre, i ROS possono ossidare direttamente specifici residui amminoacidici (cioè residui sulfidrilici o metioninici) di proteine fondamentali che possono essere alterati e inattivati (Davies K.J. et al. 1987). Nel processo di I/R miocardica, l'elevata quantità di ossigeno durante la riperfusione, sebbene necessaria per prevenire un grave danno cardiaco, è nota per produrre un eccesso di ROS che può anche interagire con le proteine del reticolo sarcoplasmatico inducendo un aumento intracellulare della concentrazione di Ca2+ mitocondriale (Kloner R.A. et al. 1983). Questo evento provoca l'apertura dell’MPTP, con conseguente rilascio di citocromo c e altri mediatori pro-apoptotici che conseguentemente portano alla morte cellulare (Tsutsui H. et al. 2009). Poiché l'H2S è un agente antiossidante,

molti studi hanno dimostrato la sua utilità nella prevenzione dello stress ossidativo, nell'attenuazione del danno cardiaco dopo la lesione da I/R e nella limitazione della morte cellulare. Alcuni ricercatori hanno dimostrato che l'H2S è in grado di proteggere le colture

primarie di neuroni dalla morte causata dallo stress ossidativo indotto con la somministrazione di glutammato. L’attività della gammaglutamil-cisteina sintetasi aumenta dopo esposizione a H2S, con conseguente sovraregolazione di cisteina e del suo trasporto

migliorando i livelli di GSH (Kimura Y. & Kimura H. 2004). Oltre al GSH e alla regolazione dell'assorbimento della cisteina, l'H2S ha esercitato il suo effetto antiossidante tramite i

canali del potassio sensibili all'ATP (KATP) e canali del Cl- nelle cellule neuronali HT22 in

un modello di stress glutammato-ossidativo: la citoprotezione dell'H2S è stata soppressa dal

trattamento con glibenclamide (un bloccante del canale KATP) e dal trattamento con

5-nitro-2-(3-fenilpropilammino) acido benzoico (NPPB) (un bloccante dei canali del Cl-). Inoltre, è stato riportato un effetto sinergico poiché la cosomministrazione di glibenclamide e NPPB

27 ha ulteriormente ridotto la citoprotezione mediata da H2S, dimostrando che i due canali sono

coinvolti nella mediazione degli effetti di questo gas trasmettitore (Kimura Y. et al. 2006). Ulteriori ricerche evidenziano che l'H2S è un agente antiossidante di per sé, che agisce come

scavenger delle ROS limitando lo stress ossidativo (Whiteman M. et al. 2004). Uno studio recente ha dimostrato l'effetto antiossidante dell'H2S anche nel tessuto cardiaco:

l'insufficienza cardiaca è stata indotta nei topi attraverso 60 min di occlusione dell'arteria coronaria sinistra seguita da riperfusione di 4 settimane in cui è stato somministrato Na2S

esogeno 100 μg/kg. Il trattamento ha promosso la cardioprotezione determinando il recupero della funzionalità del ventricolo sinistro, la riduzione dello stress ossidativo e la protezione mitocondriale, con un meccanismo d'azione mediato dal Nrf-2. Nrf-2 è un potente fattore di trascrizione antiossidante che si trova normalmente nel citosol, ma dopo stimoli ossidativi traspone nel nucleo, dove aumenta la trascrizione delle proteine antiossidanti attraverso il suo legame con gli elementi di risposta antiossidante (ARE), portando alla riduzione dell’apoptosi e all’aumento della biogenesi mitocondriale. Ulteriori ricerche hanno anche riferito che l'esposizione a H2S ha promosso l'aumento della traslocazione nucleare di Nrf-2

e una maggiore espressione di altri importanti agenti antiossidanti (cioè eme-ossigenasi-1 e tioredossina) (Calvert J.W. et al. 2010). Più recentemente, è stato dimostrato che NaHS attenuava la produzione di ROS in un modello in vitro di ipossia/riossigenazione nei cardiomiociti del ratto, inibendo l'attività del complesso IV mitocondriale e aumentando l'attività della superossido dismutasi (Sun W.H. et al. 2012). Ulteriori indagini sono state condotte nel 2014: topi CSE knock-out sono stati sottoposti a 45 minuti di ischemia miocardica e 24 ore di riperfusione. L’Na2S è stato somministrato durante la riperfusione e

il gruppo di topi CSE knock-out ha avuto un più alto livello di stress ossidativo, disfunzione di eNOS e un danno miocardico da I/R elevato rispetto al gruppo di controllo (King A.L. et al. 2014).

1.5.2. EFFETTO ANTI-INFIAMMATORIO

La risposta infiammatoria è programmata per ridurre il danno cellulare e facilitare la riparazione dei tessuti, ma d'altra parte può portare ad un ulteriore danno a causa di detriti cellulari e citochine pro-infiammatorie (Frangogiannis N.G. et al. 2002). Questo processo può essere molto dannoso in quelle cellule caratterizzate da un lento turnover, come le cellule cardiache. In effetti, la riduzione dell'infiammazione durante la lesione I/R miocardica ha dimostrato di essere una strategia utile per limitare la dimensione dell'infarto

28 e promuovere il recupero della funzionalità cardiaca. Uno dei meccanismi di cardioprotezione mediata dall'H2S in pre- e post-condizionamento comporta la riduzione dei

processi infiammatori: H2S ha dimostrato di inibire l'adesione leucocitaria in un modello di

ratto con edema indotto da carragenina. Il pretrattamento con NaHS ha ridotto significativamente l'infiltrazione dei leucociti; azione invertita dalla glibenclamide, bloccante del canale KATP, suggerendo il coinvolgimento di tali canali nella risposta

infiammatoria (Gemici B. & Wallace J.L. 2015; Fiorucci S. et al. 2006; Wang Y. et al. 2009). L'infiltrazione dei leucociti rappresenta una fase precoce del processo infiammatorio che porta alla produzione di radicali liberi e proteasi che possono danneggiare il miocardio. L'infiltrazione dei leucociti è stata valutata misurando l'attività mieloperossidasica ed è stato dimostrato che il trattamento con H2S nei 10 min precedenti alla riperfusione in un modello

suino di I/R miocardica ha ridotto l'attività mieloperossidasica (Sodha N.R. et al. 2009). Inoltre, in un modello di occlusione dell'arteria coronaria per 60 minuti seguiti da 120 min di riperfusione nei suini Yorkshire, la somministrazione di H2S prima e durante la

riperfusione è stata in grado di prevenire la traslocazione del fattore NF-kB nucleare, portando a una riduzione della quantità di mediatori pro-infiammatori. Tra questi, gli autori hanno riportato una diminuzione significativa di IL-1β e IL-6, che sono dannosi per la funzione miocardica, IL-8 fisiologicamente coinvolto nell'adesione dei neutrofili e TNF-α che può esacerbare diversi effetti infiammatori. Inoltre, la lesione del miocardio da I/R è responsabile dell’aumento della produzione di ROS e dell'effetto pro-apoptotico (Hennein H.A. et al. 1994; Kukielka G.L. et al. 1995; Oh G.S. et al. 2006). L'H2S mostrava una duplice

capacità di attenuare l'infiammazione inibendo la extravasatio di neutrofili e leucociti e riducendo le citochine infiammatorie responsabili della produzione di radicali liberi. Entrambi i meccanismi possono favorire il recupero della funzione miocardica dopo la lesione da I/R e il mantenimento del flusso sanguigno coronarico. Durante l'ischemia miocardica, una delle principali cause di aritmie e dell'aumento del metabolismo è l'eccessivo rilascio di norepinefrina, ulteriormente potenziato dalla liberazione della renina dai mastociti e dall'attivazione della cascata renina-angiotensina locale (Reid A.C. et al. 2011). È interessante notare che l'H2S è in grado di inibire la degranulazione antigene-indotta

nelle cellule RBL-2H3 (basofili di ratto) e mastociti derivanti dal midollo osseo murino, suggerendo un ruolo inibitorio di H2S in questa risposta infiammatoria (Marino A. et al.

2016; Roviezzo F. et al. 2015).

29

1.5.3. H

S NELLA MODIFICAZIONE PROTEICA

Le proteine cellulari subiscono modificazioni post-trascrizionali; tra queste, la Ssulfidratazione è uno dei principali processi coinvolti nell’influenzamento funzionale di diversi enzimi nell'ambiente intracellulare (Szabo C. 2007). È stato riportato che H2S induce

sulfidratazione sui residui di cisteina in modo covalente: di conseguenza, le proteine S-solforate risultano chimicamente più reattive e aumentano la loro attività biologica attraverso l'attivazione della chinasi (Gadalla M.M. & Snyder S.H. 2010). Recenti studi hanno mostrato che la produzione endogena di H2S è implicata nella S-sulfidratazione delle proteine: nei

topi privi di CSE, la S-sulfidratazione basale era diminuita, se confrontata con il gruppo di controllo. Questa scoperta ha dimostrato che l'H2S endogeno è coinvolto nel sostenere la

S-sulfidratazione che è un importante processo di segnalazione: la S-S-sulfidratazione H2

S-indotta ha migliorato l'attività catalitica della gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), ha causato l'attivazione del canale KATP modificando i residui di cisteina sulla

subunità Kir6.1 e mediato vasodilatazione, effetti antipertensivi e cardioprotettivi nel danno miocardico da I/R (Mustafa A.K. et al. 2009).

1.5.4. PRESERVAZIONE DELLA FUNZIONE MITOCONDRIALE

I mitocondri sono i principali responsabili della produzione di ATP nella cellula e regolano la morte cellulare e l'apoptosi (Murphy E. & Steenbergen C. 2007). Durante un evento ischemico, la riduzione dei livelli di ossigeno causa il blocco della respirazione mitocondriale e della fosforilazione ossidativa, con conseguente riduzione dei livelli intracellulari di ATP e compromissione della funzione mitocondriale. Quando si verifica la riperfusione, si verificano diversi processi: l'ossigeno viene ripristinato permettendo alla catena respiratoria di produrre nuovamente ATP insieme a ROS e radicali liberi, e i mitocondri si caricano del Ca2+ citosolico che è stato accumulato nella cellula durante l'ischemia (Halestrap A.P. 2010). Questi eventi, insieme alla normalizzazione del pH fisiologico intracellulare, inducono l'apertura di MPTP, portando alla morte cellulare. Ricerche sperimentali hanno chiarito il ruolo di MPTP come bersaglio molecolare nella cardioprotezione. Inibendo l'MPTP con ciclosporina A dopo riossigenazione in un setting di lesioni da I/R, il miocardio umano risultava protetto dal danno, indicando che i mitocondri svolgono un ruolo importante in questo processo e possono essere visti come bersaglio molecolare per la gestione di un evento di I/R (Shanmuganathan S. et al. 2005). Un altro