IDENTIFICAZIONE DEL WEST NILE VIRUS

Sono stati raccolti campioni biologici di siero, sangue intero, liquido cerebrospinale ed urine di soggetti con sintomatologia neurologica.

I campioni sono stati estratti con lo strumento NucliSENS® easyMAG® (Biomerieux). I campioni di sangue (100 µ L) sono stati pre-lisati con con 900 µ L dello stesso tampone di lisi impiegato dallo strumento ed eluiti in volume di finale di 50 µL; i campioni di CSF sono stati eluiti in 110 µL partendo da un volume di 500 µ L, mentre i campioni di urine sono stati estratti in 50 µL partendo da un volume di 500 µ L.

Sangue, liquor ed urine sono invece stati analizzati con tecniche molecolari con lo strumento LC480 II (Roche Italia, Monza, Italia).

Nel siero e nel CSF si sono cercati anticorpi IgM e IgG specifici mediante test ELISA. Le letture dell’assorbanza sono state eseguite con lo strumento GloMax® (Promega, Italia).

3.3.1. DIAGNOSI SIEROLOGICA Ricerca di anticorpi IgM ed IgG nel siero

Per la ricerca degli anticorpi di classe IgM è stato utilizzato il kit WN-IgM (FOCUS Diagnostic, DxSelect^tm) e per quella degli anticorpi di classe IgG il kit WN-IgG (FOCUS Diagnostic, DxSelect^tm). Si sono seguiti i protocolli forniti dalla ditta.

Per calcolare i valori, è stata divisa la densità ottica rilevata del campione per la media dei valori di assorbanza del cut-off (indice). I campioni sono considerati positivi per un indice di IgM maggiore di 1.10 e di 1.50 per le IgG.

Da settembre 2015, la diagnosi sierologica è stata effettuata con il kit Anti-WNV ELISA IgG/IgM (EUROIMMUN), per ottimizzare i tempi di esecuzione del test. Per valutare la sensibilità del nuovo kit si sono testati alcuni campioni già analizzati in precedenza per garantire la riproducibilità delle analisi. I valori ottenuti sono risultati sovrapponibili. I nuovi parametri per valutare la positività dei campioni variano in base alla classe di anticorpo esaminata: l’assorbanza delle IgM del controllo o dei campioni è stata divisa per l’assorbanza del calibratore (utilizzato come cut-off); per le IgG, come cut-off si è utilizzato il calibratore 2. In entrambi i casi, l’indice maggiore di 1.10 indica positività.

Test di avidità

I campioni in cui si sono riscontrate le IgG positive sono stati poi sottoposti al test di avidità, per stabilire se l’infezione era più o meno recente. Il kit utilizzato è AVIDITY determination of antibodies against WN Virus ELISA (EUROIMMUN), seguendo il protocollo fornito dalla ditta. I valori dell’indice RAI si calcolano come per il kit del TBE.

3.3.2. DIAGNOSI MOLECOLARE

Per la ricerca del WNV si sono utilizzate una real-time RT-PCR home made, specifica per i Lineage 1 e 2, e due kit commerciali in grado di rilevare e quantificare l’RNA. Si tratta di saggi molto sensibili e specifici che consentono di riscontrare tutti i vari Lineage del WNV circolanti in Italia e nelle zone limitrofe. La riproducibilità dei risultati ottenuti dalle varie

metodiche è stata verificata testando i pannelli per proficiency test QCMD 2012013-2014-2015 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Regno Unito). Ogni 1-2 anni, infatti, vengono inviati presso il nostro laboratorio controlli di qualità, denominati Quality Control for Molecular Diagnostics (QCMD), per il miglioramento della qualità della diagnostica molecolare.

Real-time RT-PCR home made

La presenza del WNV è stata rilevata mediante real-time RT-PCR diretta ad una zona altamente conservata del genoma del WNV del Lineage 1 e 2, in prossimità della regione 5’ NCR e del gene della proteina C. È stato usato il kit Kapa Probe Fast Universal One-step qRT-PCR kit (Kapa Biosystems, Inc. Wilmington, MA), seguendo le indicazioni di Linke et al. (2007). Primer, sonda TaqMan e profilo termico vengono riportati qui di seguito:

Primer/TaqMan probe (5’ → 3’) Posizione pb

ProC-F CCTGTGTGAGCTGACAAACTTAGT 10-33 144 ProC-R GCGTTTTAGCATATTGACAGCC 132-153 ProC-Probe 6FAM-CCTGGTTTCTTAGACATCGAGATCT-TAMRA 89-113 45 CICLI 95°C 95°C 5’ 5’’ + Cooling 60°C 40°C 35” 30” 42°C 25’

Real-time con kit commerciale LightMix® Kit West Nile Virus (Roche)

La retrotrascrizione è stata eseguita con il kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche) seguendo le indicazioni fornite dalla ditta.

La real-time PCR è stata eseguita amplificando un frammento di 111 pb del gene NS5 del genoma del WNV con il kit commerciale LightMix® Kit West Nile Virus (Roche), seguendo le indicazioni fornite dalla ditta. Il kit prevedeva anche una reazione di controllo e quattro standard a concentrazione nota per permettere la quantificazione.

50 CICLI 95°C 95°C 10’ 5” 72°C + Cooling 15” 62°C 40°C 5” 30”

Real-time con kit commerciale ELITe MGB® (ELITechGroup)

Da luglio 2015 è stato sostituito il kit commerciale in uso con il kit West Nile Virus ELITe MGB® (ELITechGroup). Questo cambiamento è stato effettuato per ottimizzare i tempi di esecuzione del test e minimizzare le contaminazioni. La riproducibilità delle metodiche è stata garantita testando i controlli QCMD come già descritto sopra. Anche questo test amplifica una regione del gene NS5 del genoma del WNV e utilizza quattro standard a concentrazione nota per permettere la quantificazione. Sono state seguite le indicazioni fornite dalla ditta sia per la preparazione dei reagenti che per il profilo termico sotto indicato. 45 CICLI 94°C 94°C 5’ 10” 72°C + Cooling 20” 60°C 40°C 30” 30” 50°C 20’

3.3.3. GENOTIPIZZAZIONE DEI CAMPIONI POSITIVI

La caratterizzazione molecolare è stata ottimizzata a partire da lavori presenti in letteratura [Vinayagamoorthy et al., 2005]. È stata amplificata una regione di 250 pb della proteina C del Capside (Anchored Core Protein) con il kit SuperScript III One-Step RT-PCR system with Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen). I primer (10 pmol/μL) e il profilo termico utilizzati sono i seguenti:

Primer (5’ → 3’) Posizione pb WNV1F GCCGGGCTGTCAATATGCTAAAA 10-33 250 WNV1R GCACTGGTCAAGGTCCCTAGTTC 132-153 40 CICLI 94°C 94°C 15’ 15” 68°C 68°C 30” 5’ 59°C 30” 48°C 30’ 4°C ∞

La regione di amplificazione è stata poi ampliata a 513 pb (arrivando a coprire anche una porzione del gene E) utilizzando una nuova combinazione di primer [Lanciotti et al., 2002; Vinayagamoorthy et al., 2005]. Si è utilizzato il kit SuperScript III One-Step RT-PCR system with Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen). I primer (10 pmol/μL) e il profilo termico utilizzati sono i seguenti:

Primer (5’ → 3’) Posizione pb WNV1F GCCGGGCTGTCAATATGCTAAAA 10-33 513 WNV640R CAGCCGACAGCACTGGACATTCATA 615-640 40 CICLI 94°C 94°C 15’ 15” 68°C 68°C 30” 5’ 56°C 30” 48°C 30’ 4°C ∞

Per il sequenziamento e l’analisi filogenetica si è proceduto come già descritto al paragrafo 3.1.6.

3.3.4. ISOLAMENTO VIRALE

L’isolamento virale su campioni di urina è stato eseguito in maniera analoga a quello del TBEV (paragrafo 3.2.4.).

3.3.5. TEST DI RIDUZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE DELLE PLACCHE

Per confermare le positività di WNV, si è utilizzata la metodica delle placche messa a punto durante il secondo anno di dottorato; si è titolato il virus mediante test delle placche. Il ceppo utilizzato appartiene al Lineage 1. Il protocollo osservato è analogo a quello per il test PRNT per il TBEV (descritto al paragrafo 3.2.5.); l’unica variante è il tempo di incubazione per la formazione delle placche: il WNV impiega solo 3 giorni, mentre il TBEV, come abbiamo visto, 5 giorni.