INIBITORI DELLA ANIDRASI CARBONICA - Derivati benzo(d)isotiazolici quali inibitori della Anidra

Si conoscono principalmente due classi di inibitori: gli anioni, che complessano il metallo, e le solfonammidi non sostituite (RSO₂NH₂). Gli anioni agiscono come inibitori nell’ordine del millimolare/micro molare, mentre le seconde agiscono nell’ordine del micro-nanomolare. Le solfonammidi sono in uso in terapia da più di 50 anni, come farmaci diuretici e per la cura del glaucoma. Ci sono infatti circa 30 molecole clinicamente utilizzate, appartenenti alla classe delle solfonammidi o dei

sulfamati, che mostrano una significativa attività di inibizione della Anidrasi Carbonica (CA).

È inoltre recentemente emerso che questa classe di molecole possono essere utilizzate come potenziali anticonvulsivanti, antitumorali, antidolorifici, antiinfettivi e per la cura dell’obesità.

Il problema nella progettazione di tali molecole sta nel fatto che esistono tante isoforme dell’enzima (16, di cui 13 sono attive cataliticamente) con una localizzazione piuttosto diffusa in tessuti e organi, e ad oggi non si hanno ancora farmaci altamente selettivi per un’isoforma.

Il profilo terapeutico dei derivati sintetizzati fino ad ora nei confronti delle 13 isoforme della CA è altamente variabile, ma questi possono essere utilizzati per individuare la struttura base per farmaci di nuova generazione. Diuretici tiazidici, come triclorometiazide (3), clortalidone (4), indapamide (5), furosemide (6), sono stati scoperti negli anni 60-70, quando ancora non si sapeva molto riguardo alle isoforme della Anidrasi Carbonica.

Recentemente è stata presa in considerazione e studiata l’interazione con le isoforme cataliticamente attive della Anidrasi Carbonica. Le solfonammidi sopraelencate sono strutturalmente correlate tra loro, ma mostrano un comportamento diverso nei confronti della diffusa isoforma CA II: in particolare, l’indapamide risulta un debole agonista della CA II (Ki=2520nM), mentre gli altri tre ne sono efficienti inibitori (Ki=65- 138nM).

Inoltre, alcuni di questi diuretici inibiscono anche altre forme della CA, oltre la CA II:

 Clortalidone inibisce (nell’ordine del basso nM) anche la isoforma VB, VII, IX e XII;

 Indapamide è inibitore anche di CA VII, IX, XII e XIII;

 Triclorometiazide le isoforme CA VII e CA IX;

 Furosemide inibisce CA I e CA XIV.

34 Cl S H N N O O NH2 O Cl SO₂NH₂ H N O OH O 5 6 Indapamide Furosemide H N HN S O O SO2NH2 Cl Cl2HC Cl H2NO2S OH HN O 3 4 Triclorometiazide Clortalidone

La struttura a raggi X mostra come l’indapamide 5 effettivamente abbia minore capacità di inibire l’enzima, a causa del fatto che non stabilisce interazione a idrogeno con le molecole di acqua del sito attivo, mentre le altre tre sono stabilizzate da forti legami a idrogeno, che si addizionano al legame tra la porzione benzensolfonammidica e la forma deprotonata dello Zn(II), fondamentale per l’attività catalitica. Il clortalidone 4 lega il sito attivo della CA II attraverso la forma tautomerica enolica; l’OH enolico, inoltre, partecipa alla formazioni di due forti legami a idrogeno con Asn67 e una molecola di acqua.

Altri farmaci a struttura solfonammidica sono utilizzati in terapia per la cura del glaucoma. L’Acetazolamide (1) è un effettivo farmaco antiglaucoma usato per via sistemica (Diamox®), ma ha un uso limitato a causa dei numerosi effetti collaterali che insorgono con il suo utilizzo, in quanto interagisce anche con altre forme della Anidrasi Carbonica, oltre la CA II, come la CA IV e CA XII, causando stanchezza, calcoli renali, parestesie. Un uso topico a livello oculare di inibitori della Anidrasi Carbonica è permessa da farmaci solubili in acqua, come la Dorzolamide (7) (Trusopt®)

e la Brinzolamide (8) (Azopt®), entrambi in associazione con β-bloccanti come Timololo (9) (Timoptol®) e analoghi PGF₂α come Latanoprost (10) (Xalatan®) e Travoprost ( 11) (Travatan®).

Alcuni composti sono farmaci ampiamente utilizzati per il controllo delle dinamiche dell’umor acqueo e della pressione intraoculare (IOP) in pazienti con ipertensione e glaucoma.

N N S S NH₂ O O HN O S S NH2 NH H O O O O H 1 7 Acetazolamide Dorzolamide N S S O O MeO(H₂C)₃ NHEt SO₂NH₂ 8 Brinzolamide β-BLOCCANTI: N O N S N O H N OH F₃C O OH _OH HO O O 9 11 Timololo Travoprost

36 HO HO O O OH 10 Latanoprost

Alcuni inibitori della Anidrasi Carbonica sono utilizzati come antiepilettici. Rientrano in questa categoria il Topiramato (12), Zonisamide (13) e il Sultiame (14). Il loro meccanismo di azione sembra essere piuttosto complesso e la isoforma che inibiscono è difficile da stabilire, anche se la cristallografia a raggi X dimostra che queste tre molecole sono in grado di formare complessi con la CA II.

O O O O O O S O O NH2 N O S O O NH₂ 12 13 Topiramato Zonisamide S N S O O NH2 O O 14 Sultiame

Tra gli effetti collaterali di Topiramato 12 e Zonisamide 13 si può individuare la perdita di peso nei pazienti epilettici obesi: questo aspetto ha suggerito che queste molecole potessero causare inibizione della lipogenesi e quindi fossero in grado di esplicare azione antiobesità, inibendo isoforme coinvolte nella carbossilazione del piruvato ad ossalacetato (isoforme mitocondriali CA VA e VB) e dell’acetilcoenzima-A a malonilcoenzima-A. Le isoforme IX e XII della Anidrasi Carbonica sono iperespresse nei tumori solidi, e questo ha portato la ricerca a cercare di svilupparne inibitori selettivi per combattere il tumore.

È noto che molte classi di solfonammidi aromatiche/eterocicliche e sulfamati hanno buona affinità per queste isoforme, ma non mostrano specificità di inibizione verso CA IX e XII rispetto alle altre isoforme esistenti.

Sono stati elaborati diversi approcci per ottenere composti che selettivamente interagiscano con le isoforme associate al tumore:

 solfonammidi fluorescenti, usate per scopi di imaging e per determinare il ruolo della CA IX nella acidificazione del tumore;

 composti carichi positivamente o negativamente, che non possono attraversare la membrana plasmatica a causa della carica e di conseguenza inibiscono solo le isoforme extracellulari, tra cui la CA IX e la CA XII;

 composti attivati dall’ipossia, che sfruttano le condizioni riducenti del tumore ipossico per convertire un pro farmaco inattivo in un attivo inibitore della Anidrasi Carbonica;

 zuccheri contenenti solfonammidi/sulfamati/sulfamidi, che a causa del loro elevato carattere idrofilico non attraversano facilmente la membrana plasmatica e quindi possiedono una maggiore affinità per le forme extracellulari dell’enzima;

 nano particelle rivestite con inibitori della Anidrasi Carbonica;

Utilizzando derivati basati sulla struttura dell’acetazolamide a cui sono state legate porzioni di acido carbossilico legante fluoresceina o frazioni leganti l’albumina, impermeabili alla membrana, è stata dimostrata la loro capacità di ritardare lo sviluppo del tumore in topi che hanno subito trapianto di cellule renali chiare, particolare variante dell’adenocarcinoma renale, di una linea di carcinoma SK-RC-52, trattati per un mese con inibitori della CA.11 Le solfonammidi si legano allo Zinco (II) dell’enzima, sia sostituendo il legame non proteico dello zinco che aggiungendo addizionali legami di coordinazione generando specie trigonali/bi piramidali.

Agiscono infatti legando lo ione zinco con il loro atomo di azoto allo stato deprotonato in una geometria tetraedrica, mentre con uno degli ossigeni instaurano legami a idrogeno con l’azoto del residuo Thr199; inoltre si ha una estesa rete di legami a idrogeno coinvolgenti l’O di residui di Thr199, che a sua volta è impegnata in altre interazioni stabilizzanti con il gruppo carbossilato del Glu106, i quali partecipano all’ancoraggio della molecola inibitrice allo ione metallico. La porzione aromatica/eterociclica interagisce con residui idrofobici e idrofilici della cavità. 3 (Figura 12)

39 Figura 12

Interazione solfonammide-sito attivo

La struttura del sito attivo della Anidrasi Carbonica ha una caratteristica notevole, che non è mai stata osservata in altre classi di enzimi finora studiati.

Presenta infatti una struttura “bipolare”, molto particolare: metà del sito attivo è rivestito solo di residui idrofobici (Leu135, Leu91, Val121, Val131, Leu141, Val143, Leu198 e Pro202), mentre la rimanente parte è caratterizzata da residui amminoacidici idrofilici (Arg58, Arg60, Asn62, His64, Ser65, Gln67, Thr69 e Gln92). Lo Zn²⁺ è situato in profondità della cavità del sito attivo.

La spiegazione più probabile per questa particolarità è che la parte idrofobica sia utilizzata per intrappolare la molecola di CO₂, mentre quella idrofilica potrebbe essere la parte del sito attivo attraverso la quale le molecole polari generate dalle reazioni di idratazione della anidride carbonica, protoni e ioni bicarbonato, sono rilasciate dalla cavità verso

l’ambiente circostante. Almeno per quanto riguarda i protoni, è stata dimostrata che esiste una relazione tra molecole di acqua e residui di istidina, i quali svolgono il ruolo di proton shuttle, e sono coinvolti in molti processi.

Per poter progettare farmaci selettivi per una o più isoforme della Anidrasi Carbonica, è stato condotto uno studio di analisi dell’interazione di diversi composti con la parte idrofobica o idrofilica del sito attivo dell’enzima, che infatti influenza fortemente la selettività degli inibitori della Anidrasi Carbonica.

I primi studi hanno riguardato l’interazione del 4-fenilacetamidometil-

benzensolfonammide (4ITP) (15) con la isoforma CA II, che rappresenta la

isoforma citosolica fisiologicamente più importante.

O

_H

N

SO

₂

NH

₂

4ITP

Il gruppo solfonamidico deprotonato del 4ITP si coordina con lo ione Zinco (II) del sito attivo e stabilisce un forte legame a idrogeno con l’OH del residuo di Thr 199. L’ossigeno del gruppo –CONH del farmaco è in prossimità di una molecola di acqua e forma un legame a idrogeno di 3.4 Å. Il gruppo fenilico terminale idrofobico è liberamente associato con una tasca idrofobica costituita da residui di Val135, Leu204 e Pro202 sulla superficie della isoforma CA II, essendo 5.9 Å distante dal residuo di Phe131 e 4.6 Å dal residuo di Pro202. (Figura 13)

41 Figura 13

Interazione 4ITP con il sito attivo dell’enzima

Successivamente è stata analizzata l’interazione di molti altri composti benzensolfonammidici contenenti catene laterali aromatiche nella loro struttura con varie isoforme enzimatiche, paragonandoli al 4ITP, per ottenere informazioni utili circa la le caratteristiche fondamentali che conducono ad elevata affinità/selettività verso una certa isoforma. In particolare si tratta dei composti 2HD6 16, 3OYS 17, 3N2P 18 e 3MMF 19:

N H O SO2NH2 SH N H O SO2NH2 16 17 2HD6 3OYS

42 N H NH O SO2NH2 O₂N N N N HN SO2NH2 Cl HN HO 18 19 3N2P 3MMF

Questi composti sono stati studiati come inibitori per le isoforme CA I, CA II, CA VA, CA VB, CA IX e CA XII, come mostrato in tabella 1.

Tabella 1: Dati di inibizione sulle forme CAI, CA II, CA VA, CA VB, CA IX, e CA XII da parte dei composti 4ITP, 3OYS, 3N2P, 3MMF e HD6

INIBITORE Ki (nM)

hCA I hCA II hCA VA hCA VB hCA IX hCA XII

4ITP 75 54 8.6 8.3 136 212

3OYS 7.6 9.0 13 10 84 71

2HD6 276 16 79 114 9.1 6.4

3N2P 23.4 15 146 138 0.9 5.7

3MMF 1098 37 451 340 0.75 1.6

La tabella 1 mostra come 4ITP sia un inibitore di media potenza nei confronti delle CA I e CA II, un debolissimo inibitore della CA IX e CA XII, mentre ha una azione potente nei confronti delle forme mitocondriali CA VA e CA VB, con una costante di inibizione Ki nel range di 8.3/8.6 nM. Il composto a catena laterale più breve, 3OYS, è un migliore inibitore in generale di tutte le isoforme ma non risulta particolarmente selettivo per nessuna di queste. La solfonammide contenente il gruppo SH, 2HD6, è stata ottenuta come pro farmaco in quanto è ridotto nel mercapto-derivato nei tumori ipossici. È un debole inibitore della CA I, CA VA e CA VB, ed è un effettivo inibitore delle isoforme CA II, CA IX, CA XII: è meno promiscuo rispetto a 3OYS ma non selettivo come 4ITP.

È interessante notare come i composti 3N2P 18 e 3MMF 19, che nella loro struttura presentano gruppi più polari, siano altamente selettivi per le isoforme transmembranali associate ai tumori CA IX e CA XII, per le quali mostrano una Ki nel range di 0.75/5.7 nM. Queste molecole mostrano anche un’efficace capacità di inibire la isoforma CA II, con una Ki nell’ordine di 15/37 nM, quindi di un ordine di grandezza inferiore rispetto alla inibizione delle CA IX e XII; sono invece deboli inibitori delle isoforme mitocondriali CA VA e VB.

Per razionalizzare la modalità di legame e il modello di inibizione, è stata sovrapposta la struttura di interazione del 4ITP-CA II con le strutture degli addotti della CA II stessa associata agli altri composti sopraelencati. (Figura 14)

Figura 14

Essendo che 3OYS e 4ITP differiscono solo per un ponte metilenico nella loro struttura, non sorprende che i due composti leghino la CA II in un modo molto simile.

La variabilità strutturale tra questi composti quando legano CA II risiede nella catena laterale.

Infatti, i composti contenenti solo la porzione benzilica idrofobica nella catena laterale (3OYS e 4ITP) si legano all’interno della tasca idrofobica dell’enzima.

Il derivato triazinico 3MMF si lega in un sito intermedio tra la tasca idofobica, nella quale si inseriscono 3OYS e 4ITP, e quella in cui legano i derivati più polari 2HD6 e 3N2P: l’addizione di una porzione polare, come il gruppo –SH o il gruppo NO₂ all’anello fenilico, spostano la catena laterale dalla tasca idrofobica (contenente il residuo Phe131) verso la parte idrofilica del sito attivo.

Questi modi differenti della catena laterale di legare il sito attivo hanno importanti conseguenze sulla modalità di inibizione selettiva di questi composti verso le varie isoforme dell’enzima, quelle citosoliche (CA I e II), mitocondriali (CA VA e VB) o transmembranali (CA IX e XII).

Successivamente è stata eseguita una sovrapposizione delle isoforme CA I, CA IX e CA XII sul complesso 4ITP-CA II (figura 15); la isoforma CA III non è stata presa in considerazione in quanto è documentato che il residuo di Phe198, un amminoacido ingombrante nel sito attivo della CA III, crea un significativo ingombro sterico per più inibitori solfonamidici.

45 Figura 15

Sovrapposizione delle isoforme CA I, CA IX e CA XII sul complesso 4ITP-CA II

Il residuo Gln92, il quale ha la possibilità di formare legame a idrogeno con l’ossigeno carbonilico della catena laterale (-CONH del 4ITP), si è conservato in tutte le isoforme della Anidrasi Carbonica.

Dalla figura emerge che 4ITP inibisce in misura minore le isoforme CA IX e XII rispetto alla CA II, a causa della presenza dei residui amminoacidici Asp132 in CA IX e Ser132 in CA XII, che sono amminoacidi polari vicino al gruppo fenilico idrofobico: questa affermazione si è rivelata vera appena sono stati determinati i dati di inibizione del composto nei confronti di tali isoforme. La molecola ha una media potenza, con valori di Ki di 136-212 nM.

Il derivato a catena laterale più corta, 3OYS, è un inibitore leggermente migliore di 4ITP nei confronti delle isoforme di membrana, e presenta

valori di Ki intorno a 71-84 nM, come descritto in tabella 1. Questa osservazione può essere razionalizzata dal fatto che nelle isoforme I e II sono presenti rispettivamente residui di Ala132 e Gly132 che permettono al sito attivo di conservare la natura idrofobica nella tasca di legame. Inoltre la CA XII presenta un residuo di Ser135, al posto degli amminoacidi idrofobici presenti nelle altre isoforme, e questo potrebbe condurre ad una ridotta capacità inibente da parte di 4ITP.

L’introduzione di gruppi polari nei derivati solfonammidici causa uno spostamento della catena laterale sopra l’apertura del sito attivo, generando così la possibilità di formazione di un legame a idrogeno, nella isoforma II, con il residuo di Asn67: anche nelle isoforme mitocondriali, è confermato che la costante di inibizione di 3N2P è nell’ordine del basso nM, precisamente di 9-5.7 nM.

L’amminoacido in posizione 67 in realtà mostra il più alto grado di variabilità nel sito attivo; infatti, ad esempio, nella CA IX è presente un residuo di Asn, mentre nella CA XII si ha un residuo di Lys. In generale comunque la catena laterale degli amminoacidi in posizione 67 fornisce la possibilità di formare interazioni a idrogeno con composti che dispongono di accettori di tali interazioni nella loro struttura.

I composti 3N2P e 2HD6 mostrano un migliore profilo inibitorio nei confronti delle isoforme CA IX e CA XII rispetto ai derivati 4ITP e 3OYS, in quanto questi ultimi hanno la catena laterale orientata verso la parte idrofobica del sito attivo.

Paragonando i valori delle costanti di inibizione Ki relativi agli addotti solfonammide-CAII di 3N2P, 3MMF, 3OYS e 2HD6 con quelli del complesso 4ITP-CAII, le differenze sono minime: i valori rientrano nel range di 9.0-54 nM. Questi dati si correlano bene con i valori della energia libera di Gibbs di legame, come emerge dalla tabella 2:

Tabella 2: valori delle Ki, della superficie ingombrata e della energia libera di legame relativamente ai composti 4ITP, 3OYS, 3N2P, 3MMF e HD6

INIBITORE Superficie ingombrata (Å²) ΔG di legame (Kcal/mol) Ki (nM) 3OYS 350 -15.0 9 3N2P 370 -12.6 15 3MMF 340 -15.0 37 2HD6 340 -13.8 16 4ITP 360 -14.2 54

I valori delle Ki subiscono delle piccole variazioni probabilmente determinate dalla regione nella quale la catena fenilica si inserisce, all’interno del sito attivo. Questa disposizione può dipendere da diversi fattori, tra cui:

 la distanza tra il gruppo solfonammidico e la catena laterale;

 la presenza di gruppi polari nella catena laterale che possono partecipare alla formazione di legami a idrogeno a altre interazioni addizionali;

 la flessibilità del linker. È il caso ad esempio del composto 3N2P, in cui il gruppo ureidico permette una maggiore flessibilità alla catena rispetto al gruppo –CONH o -SO₂NH, che essendo più rigidi conducono a minori possibilità di instaurare interazioni con i diversi amminoacidi del sito attivo.

A causa della mancata disponibilità delle strutture CA VA e VB, è stata utilizzata una struttura murina troncata di CA VA come stampo, ed è stato paragonato il legame di 4ITP a CA II, con quello a CA VA e VB.

48 Figura 16

Paragone tra il legame di 4ITP e CA II, con quello di CA VA e VB.

A causa del fatto che 30 residui amminoacidici della sequenza delle proteine mitocondriali sono eliminati quando questi enzimi sono mirati al mitocondrio, la sequenza N-terminale è più corta nelle isoforme VA e VB, e questa differenza emerge rispetto alla CA II.

Un’altra differenza strutturale legata al sito di legame per i farmaci, è l’anello contenente il residuo di Phe131: tale residuo Phe131, presente nella CA II e VB, corrisponde ad un residuo di Tyr131 nella isoforma CA VA e l’ossidrile della tirosina può stabilire interazioni a idrogeno con il gruppo – CONH del farmaco.

Un secondo residuo, Asn 67, presente nella cavità del sito attivo di CA II, è sostituito da Gln67 nella isoforma CA VA e da Leu67 nella isoforma VB, anche se questi residui sono localizzati a 6Å dal farmaco nel modello elaborato; Gln92 e Val121 sono invece conservati anche in queste isoforme.

Tutti questi aspetti sopraelencati spiegherebbero la elevata affinità del 4ITP per le isoforme mitocondriali in questione: 4ITP è sei volte più affine come inibitore a queste rispetto alla CA II. 6

Nel documento Derivati benzo(d)isotiazolici quali inibitori della Anidrasi Carbonica (pagine 32-49)