INIBITORI DELL’ANIDRASI CARBONICA UTILIZZATI COME MARKERS TUMORALI NELLA DIAGNOSI DEL

CANCRO

_.

Essendo, le CAs IX e XII, espresse nelle cellule cancerose, potrebbero essere utilizzate come markers per una vasta gamma di tumori ipossici. Quindi alcune solfonammidi fluorescenti sono state progettate per l’imaging e la successiva diagnosi di tumori ipossici. Uno dei più importanti composti sviluppati fino ad oggi è il derivato 17 (4-sulfamoilfeniletiltioureido) fluoresceina, preparato attraverso la reazione della fluoresceina tiocianato (FITC) con una omosulfanilammide aromatica ammino sostituita. E’ stato dimostrato che il composto 17 si lega soltanto al tessuto tumorale ipossico, dato che questo sovraesprime gli isoenzimi IX e XII, quindi potrebbe essere molto utile per evidenziare l’imaging di questo tipo di cancro.

Questo composto presenta una Ki verso la CA IX di 24 nM e mostra proprietà di

impermeabilità alla membrana, valutata attraverso un modello in vivo delle membrane delle cellule rosse del sangue.

Per quanto riguarda il composto 29, questo è stato capace di ridurre l’acidificazione extracellulare delle cellule CA IX del rene canino Madin-Darby (MDCK-CA IX) nell’ipossia, ed il loro effetto sul pH extracellulare normossico è risultato trascurabile. Attualmente, è stato sviluppato come strumento diagnostico, negli studi clinici, per l’imaging di tumori ipossici.

52

Introduzione parte

53 Le anidrasi carboniche sono una superfamiglia di metallo-enzimi che catalizzano l’interconversione tra CO2 e ione bicarbonato. Sono quindi coinvolte in un cruciale

processo fisiologico connesso alla respirazione e al trasporto di CO2/bicarbonato

attraverso i tessuti metabolizzanti ed i polmoni. Ad oggi sono conosciute sei distinte famiglie genetiche di diversa evoluzione: α-CA, β-CA, γ-CA, δ-CA, ζ-CA, η-CA. Nei vertebrati più sviluppati, compresi gli esseri umani, sono stati scoperti quattordici isoenzimi delle α-CA, numerati da I a XIV. Recentemente è stato individuato un ulteriore isoenzima delle α-CA (CA XV), presente in diverse specie animali, eccetto che negli esseri umani e negli scimpanzé. Le diverse famiglie di anidrasi carboniche differiscono per lo ione metallico presente nel sito attivo. Tutte e cinque le classi di enzimi sono zinco-enzimi, ma probabilmente le γ-CAs sono ferro-enzimi, anche se risultano essere attive anche in presenza degli ioni zinco o cobalto[59,60]_{, mentre le ζ-CAs utilizzano cadmio o zinco per la catalisi di reazioni}

fisiologiche[61,62].

Gli isoenzimi CA svolgono varie importanti funzioni fisiologiche e fisiopatologiche relative alla respirazione e al trasporto di CO2/bicarbonato; inoltre regolano il pH e

l’omeostasi della CO2, la secrezioni di elettroliti in una varietà di tessuti/organi, le

reazioni di biosintesi (come la gluconeogenesi, la lipogenesi e l’urogenesi), il riassorbimento osseo e la calcificazione. Recentemente è stato evidenziato che sono coinvolte in alcuni processi patologici (tumorigenecità, obesità, epilessia, crescita e virulenza di vari patogeni). Le anidrasi carboniche sono enzimi ubiquitari, quindi la loro presenza in così tanti tessuti e in così tante isoforme rappresenta una meta attraente per la progettazione di inibitori con diverse applicazioni biomediche. Diversi inibitori delle anidrasi carboniche (CAI) sono risultati agenti diuretici efficaci e negli ultimi anni sono emerse nuove applicazioni cliniche dei CAI. Essi possono essere utilizzati a livello topico come antiglaucoma, come anticonvulsivanti, antiobesità, antipanico e come agenti antitumorali/strumenti diagnostici[5,11,13,45]_{. L’inibizione delle CA non ha solo le applicazioni cliniche}

viste, ma è anche un target emergente nella progettazione di anti-infettivi (agenti antimicotici e antibatterici) [12,63,64] con un diverso meccanismo d’azione. Di conseguenza sono state sviluppate nuove numerose classi di CAI al fine di modularne le proprietà farmacologiche.

54 Le anidrasi carboniche vengono inibite principalmente da due classi di composti: gli anioni complessanti il metallo (tra cui molti carbossilati) e le solfonammidi/sulfamati/sulfammidi, che generalmente si legano allo ione Zn2+ del sito attivo dell’enzima.

Sulla base di quanto detto, il gruppo di ricerca presso il quale ho svolto la mia tesi ha recentemente descritto e caratterizzato nuovi derivati triciclici con scaffold benzotiopiranopirazolico e piridotiopiranopirazolico sul quale è stata inserita una funzione benzensolfonammidica 1 [65]. Questi composti erano stati progettati quali analoghi rigidi di celecoxib e valdecoxib, che nati come inibitori specifici delle ciclossigenasi 2 (COX-2), hanno dimostrato di essere anche potenti inibitori delle CAs[66-68]_.

I composti 1a-e, così come i composti di riferimento CLX e VLX sono stati saggiati quali inibitori catalitici delle isoforme hCA I-XIV (Tabella 5) presso il laboratorio del Professor Supuran, C. T. dell’Università di Firenze.

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Tabella 5. Inibizione di hCAisoforme I-XIV con i composti 1a-e, Celecoxib (CLX)

e Valdecoxib (VLX). X S R N N H₂NO₂S 1a-e 1a: X = CH R = OCH₃ 1b: X = CH R = Cl 1c: X = CH R = CF₃ 1d: X = N R = H 1e: X = N R = CH₃ Ki(nM)α enzyme 1a 1b 1c 1d 1e CLX VLX hCAI 65 212 318 193 155 50000 54000 hCA II 16 29 210 72 49 21 43 hCA III 22700 32000 28600 6400 7900 7400 78000 hCAIV 8850 7200 7140 328 7500 880 1340 hCA VA 923 440 327 476 992 794 912 hCA VB 1072 3140 3250 3180 3270 93 88 hCA VI 7116 9280 9340 8055 8140 94 572 hCA VII 609 602 628 873 912 2170 3900 hCAIX 2182 1845 2570 2340 3250 16 27 hCA XII 4550 5620 6755 5540 5870 18 13 hCAXIII 938 2810 714 4300 4630 98 425 hCA XIV 931 797 548 715 844 689 107

56 La caratteristica principale dei derivati 1a-e è l’elevata inibizione dell’anidrasi carbonica umana (hCA) I e II, mentre la loro attività inibitoria verso hCA III, IV, VA, VB, VI, VII, IX, XII, XIII e XIV è risultata di due ordini di grandezza più bassa.

Dall’analisi della Tabella 5 sono emerse le seguenti relazioni struttura-attività (SAR)[65]:

 Le isoforme citosoliche hCA I e II sono inibite rispettivamente moderatamente ed efficacemente dai composti 1a-e. Il profilo di inibizione di questi composti nei confronti di hCA II è risultato simile a quello di celecoxib e valdecoxib (Tabella 5), mentre nei confronti di hCA I è risultato migliore. La presenza nello scaffold eterociclico di un benzene o di una piridina porta comunque all’ottenimento di efficaci CAI. Inoltre, nell’ambito dei derivati benzotiopiranici, gli inibitori più efficaci sono stati quelli recanti il gruppo metossilico (1a) o un atomo di cloro (1b) in posizione 7, mentre l’introduzione di un gruppo CF3 (1c) ha comportato una minore attività

inibitoria nei confronti di entrambe le isoforme.

 L’isoforma citosolica lenta hCA III viene inibita poco sia dai composti 1a-e, che da celecoxib e valdecoxib. Ciò è probabilmente dovuto ad una specifica struttura del sito attivo dell’enzima hCA III, il quale presenta un ingombrante residuo di Fenilalanina (Phe198) al centro della tasca attiva che interferisce con il legame dei composti 1a-e, stericamente ingombrati [69].

 L’isoforma IV legata alla membrana viene inibita moderatamente dai composti 1a-e. Il composto con un profilo migliore di inibizione è 1d, che presenta l’anello pirimidinico non sostituito (R = H).

 Le isoforme mitocondriali hCA VA e VB, nonché l’isoforma hCA VI secreta nella saliva, sono inibite da questi composti e dai coxib, con costanti di inibizione nell’intervallo 327-9340 nM.

 Le isoforme citosoliche rimanenti hCA VII e hCA XIII sono inibite moderatamente dai composti 1a-e. I derivati piridinici 1d-e hanno mostrato un’attività inibitoria inferiore nei confronti dell’isoforma hCA VII. Sembra che per questa isoforma la natura del sostituente R abbia minor influenza

57 sull’attività inibitoria. Al contrario, per l’inibizione dell’isoforma hCA XIII questo sembra essere il parametro più importante. Infatti il composto 1c (R = CF3) mostra i migliori profili di inibizione.

Importante sottolineare che i coxib, VLX e CLX, sono inibitori deboli di hCA VII, ma mostrano un miglior profilo di inibizione nei confronti di hCA XIII.  Le isoforme transmembranarie hCA IX, XII e XIV sono inibite moderatamente dai nuovi composti 1a-e. L’isoforma maggiormente inibita è hCA XIV, mentre l’isoforma meno inibita è hCA XII.

La cristallografia a raggi X e studi di sovrapposizione hanno permesso di spiegare il profilo di inibizione specifico delle pirazolo-solfonammidi, che è risultato piuttosto differente da quello dei composti di riferimento CLX e VLX. In particolare, per studiare il tipo di inibizione di questi composti sono stati condotti studi di cristallografia a raggi X del composto 1e complessato con l’enzima hCA II (Figura 22).

Figura 22. Rappresentazione del sito attivo dell’enzima hCA II complessato con il

composto 1e (magenta). Lo ione zinco nel sito attivo è rappresentato come una sfera grigia.

Il composto 1e si inserisce profondamente nel sito attivo dell’enzima, spiazzando il solvente legato allo zinco catalitico, per cui l’azoto della solfonammide interagisce direttamente con lo ione zinco. L’azoto e l’ossigeno della solfonammide si trovano

58 infatti nella giusta distanza per formare legami a idrogeno con la Treonina 199 (Figura 23).

L’atomo di zolfo distorce l’anello del composto, ma non è direttamente coinvolto nell’interazione con l’enzima hCA II, non è risultato dunque essere essenziale per l’attività. Gli anelli idrofobici del sistema eterociclico si protendono all’esterno e sono stabilizzati principalmente da residui idrofobici che delimitano la cavità del sito attivo, coinvolgendo interazioni di Van der Waals con le catene laterali di Valina 121, Fenilalanina 131, Leucina 198, Prolina 202 ed Istidina 64.

59 In Figura 23 è riportata la sovrapposizione della struttura hCA II-1e (Figura 23A) che è stata effettuata parallelamente con VLX (Figura 23B) e CLX (Figura 23C).

Figura 23.Rappresentazione dei composti 1e (A, magenta), di VLX (B, ciano) e di

CLX (C, verde) sovrapposti sul sito attivo della h CA II. Gli amminoacidi sono rappresentati come bastoncini gialli, mentre lo ione zinco nel sito attivo è rappresentato come una sfera grigia. Le frecce rosse indicano il cambiamento conformazionale di h CA II nel legame con l’inibitore.

60 L’aspetto più interessante di questa comparazione ha rivelato che tutti e tre i composti si legano allo ione zinco del sito attivo e che i loro gruppi terminali hanno la capacità di occupare zone diverse sulla superficie del sito attivo. In particolare, l’anello fenilico idrofobico di VLX spinge fuori la Fenilalanina 131 dalla tasca idrofobica a differenza dei composti 1e (Figura 23A) e CLX (Figura 23B). L’anello fenilico idrofobico di CLX costringe l’Asparagina 67 a cambiare conformazione (Figura 23C), inoltre CLX ha sia una regione idrofila ricca di fluoro che un anello fenilico idrofobico, ciò gli conferisce un orientamento insolito. Per quanto riguarda il composto 1e, l’atomo di azoto idrofilo fuso nell’anello piridinico, può essere coinvolto nel legame a idrogeno con il solvente e quindi non necessita della presenza nella tasca idrofobica della Fenilalanina 131 (Figura 23A).

Nonostante i cambiamenti conformazionali delle catene laterali dei tre inibitori (1e, VLX e CLX) che interagiscono con hCA II e i loro diversi orientamenti all’interno del sito attivo, tutti e tre interagiscono con circa le stesse dimensioni superficiali della proteina, che è rispettivamente: 407, 451 e 409 Å2 [65].

I risultati ottenuti hanno indicato che le benzensolfonammidi 1a-e costituiscono una nuova classe di inibitori delle anidrasi carboniche molto interessante da un punto di vista clinico, in quanto presentano specificità nei confronti di un numero ristretto di isoforme CA . La maggiore selettività di inibizione porta al vantaggio che tali inibitori daranno sicuramente minori effetti collaterali rispetto a quelli di vecchia generazione non selettivi. Inoltre è risultato molto significativo che i composti 1d e

1e abbiano mostrato un buon profilo di inibizione verso le CAs dei micobatteri,

dato che tali CAs sono inibite meno da altre classi di solfonammidi, prospettando nuovi scenari di applicazioni terapeutiche di tali composti.

La ricerca in questo ambito è continuata investigando altre serie di composti benzen-solfonammidici apportando modifiche allo scaffold, sempre con lo scopo di sintetizzare CAIs quanto più selettivi possibile verso alcune isoforme [70]. In particolare è stata shiftata la funzione benzen-solfonammidica dalla posizione 1 alla posizione 2 del pirazolo dei sistemi benzotiopirano- e piridotiopirano- [4,3- c]pirazolico (2a-d) [70], per valutare se questo cambio di posizione potesse modulare la selettività per alcune isoforme di CA. I sostituenti in posizione 7 (R) sono stati

61 scelti sulla base di quelli che avevano mostrato i risultati più convincenti nei composti precedentemente descritti 1 a-e.

2a-d

a: X = CH R = OCH3

b: X = CH R = Cl c: X = N R = H d: X = N R = CH3

Successivamente sono stati studiati composti con un diverso scaffold etero policiclico. In particolare è stata effettuata la sintesi di sistemi pirido-tiopirano- pirimidinici (3a-e) con la funzione benzensolfonammidica in posizione 2 del sistema triciclico spaziata da un linker NH [70].

X R S N N HN SO₂NH₂ 3a-e a: X = CH R = H b: X = CH R = OCH3 c: X = CH R = Cl d: X = N R = H e: X = N R = CH3

62 I composti 2a-d così come i composti 3a-e sono stati saggiati per valutare la loro capacità di inibire le quattro isoforme CA più rilevanti da un punto di vista fisiologico, le hCA I, II, IX e XII, utilizzando l’acetazolamide (AAZ) come composto di riferimento[6].

I dati raccolti in Tabella 7 testimoniamo che i composti 2a-d vanno ad inibire significativamente tutte e quattro le isoforme investigate, con costanti di inibizione che stanno, rispettivamente, nel range di 22.5-68.4 nM verso l’isoforma umana I, 7.1-8.5 nM verso l’isoforma II, 6.1-7.7 nM nei confronti dell’isoforma IX, 38.1- 68.6 nM nei confronti dell’isoforma XII. Dagli studi di relazione struttura- attività (SAR) è emerso che il sostituente R cosi come l’eteroatomo X hanno una scarsa influenza sull’attività inibitoria.

Tabella 7

È dunque emerso che lo shift del gruppo benzen-solfonammidico dalla posizione 1 alla posizione 2 dell’anello pirazolico ha determinato una perdita della isoforma- selettività di questi composti. Quindi questa linea di ricerca è stato interrotto a favore della sintesi di nuovi derivati che incorporassero un anello pirimidinico sul sistema benzotiopirano e piridotiopirano (composti 3a-e). I dati di inibizione delle varie isoforme investigate per tali composti sono riportati in Tabella 8.

63

Tabella 8

Dai dati riportati emerge che la isoforma citosolica I è inibita moderatamente da tali composti con una Ki compresa tra 66.9 e 84.0 nM, e nuovamente gli studi di SAR

hanno mostrato che la natura del sostituente R e/ o dell’eteroatomo X non hanno un’influenza significativa ai fini dell’attività biologica. Questo non è stato invece il caso dell’isoforma II, per la quale è stato evidenziato un differente profilo di inbizione per queste solfonammidi. In particolare si sono mostrati efficaci inibitori di questa isoforma i composti 3d e 3e con una Ki compresa tra 8.0 e 9.4 nM. Mentre

il composto standard AAZ ed i composti 3a-c si sono dimostrati molto meno efficaci con una Ki assai più elevata (range 63.2-218 nM). La migliore sostituzione

si è dunque rivelata quella che incorpora nello scaffold policiclico un anello piridinico e non benzenico. Il sostituente R non ha dimostrato avere grande influenza sul profilo di inibizione enzimatica dei composti.

L’isoforma transmembranaria IX, un valido target antitumorale, è risultata essere inibita in modo efficace da questi derivati con Ki che vanno da 7.0 a 27.6 nM sia

per i composti con l’anello benzenico (3a-c) che quello piridinico (3d-e) nel sistema triciclico che sono risultati quindi efficaci inibitori. Dall’analisi dei risultati emerge che, per quanto riguarda la serie di composti che presentano l’anello benzenico nel

64 sistema triciclico, quando il sostituente R è un metossile (3b) si ha una perdita di efficacia inibitoria di almeno 3 volte rispetto a quando la posizione 2 è non sostituita (3a) o presenta un atomo di Cl (3c). Per quanto riguarda la serie dei composti piridinici (3d,e) invece si ha un incremento di tre volte dell’attività inibitoria nei confronti di hCA IX quando il sostituente R è un metile (3e) rispetto che nell’omologo non sostituito (3d).

Anche per quanto riguarda l’isoforma XII tali composti si sono dimostrati dei validi inibitori con valori di Ki nel range 15.5 e 75.1 nM. In particolare, come si può vedere

in tabella, i composti più efficaci si sono dimostrati il 3c (R= Cl) nella serie benzenica ed il 3d (R=H) nella serie pirazolica .

Sulla base delle ricerche precedentemente svolte e qui discusse, sono state progettate delle possibili ulteriori modifiche da apportare allo scaffold triciclico dei sistemi appena descritti. In un recente lavoro di tesi sono tate apportate diverse modifiche quali l’introduzione di un ulteriore atomo di N sul primo anello a dare il nucleo pirimidinico ed è stato eliminato dell’atomo di zolfo dal sistema triciclico, che non si è dimostrato fondamentale nell’interazione con l’enzima.

In particolare sono stati sintetizzati composti col nucleo pirazolo-chinazolininico

4a-c e delle pirimido-chinazolinico 5 a-c.

4a-c 5a-c

4a: R = H 5a: R = H

4b: R = CH3 5b: R = CH3

65 In entrambi i sistemi triciclici è comunque presente un nucleo pirimidinico (anello A) sostituito in posizione 2 con il CH3 che nei precedenti studi aveva fornito i

migliori risultati e con un gruppo fenilico per valutare se questo sostituente, con maggiore ingombro sterico, sia in grado di modulare la selettività nei confronti delle varie isoforme dell’enzima AC.

Lo scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di effettuare delle semplificazioni strutturali dei sistemi semplificati dei derivati pirazolo-chinazolinici e pirimido- chinazolinici eliminando dal sistema triciclico l’anello pirimidinico (A) ad ottenere nuovi derivati biciclici. Sono stati così progettati i composti tetraidroindazolici (6a-

d) e tetraidrochinazolici (7a-d) in cui è stata comunque mantenuta la funzione

benzensolfonammidica direttamente legata in posizione 1 dell’anello pirazolico o legata in posizione 2 dell’anello pirimidinico. Questi due sistemi sono stati decorati con gruppi metilici o fenile (sostituenti R e R') al fine di valutare una possibile influenza dell’ingombro sterico sulla selettività verso le varie isoforme di AC.

6a-d 7a-d

6a: R = H, R' = H 7a: R = H, R' = H 6b: R = H, R' = CH3 7b: R = H, R' = CH3

6c: R = CH3, R' = CH3 7c: R = CH3, R' = CH3

6d: R = H, R' = C6H5 7d: R = H, R' = C6H5

La sintesi delle due serie di composti 6a-d e 7a-d prevede la sintesi di intermedi chiave comuni che sono i 2-(dimetilamminometilen)-1,3-dioni 5-sostituiti 9a-d sintetizzati secondo la procedura, già descritta in letteratura [71, 72]

66 I derivati 1,3-cicloesandione 5 sostituiti, commercialmente disponibili, sono stati fatti reagire con un eccesso di N,N-dimetilformammide dimetilacetale (DMF- DMA) a 100 °C per un’ora monitorando l’andamento della reazione mediante T.L.C. (miscela eluente: etere di petrolio 40-60/acetato di etile = 1:9) come riportato nello schema 1. Schema 1 8a-d 9a-d 8a: R = H, R' = H 9a: R = H, R' = H 8b: R = H, R' = CH3 9b: R = H, R' = CH3 8c: R = CH3, R' = CH3 9c: R = CH3, R' = CH3 8b: R = H, R' = C6H5 9b: R = H, R' = C6H5

Condizioni di reazione e reagenti: i: 100 °C per 1 ora;

Dopo raffreddamento, per triturazione con etere etilico si ha la precipitazione dei composti desiderati 9a-d che vengono raccolti mediante filtrazione a pressione ridotta. I composti 9a-d, ottenuti con rese quantitative, risultano sufficientemente puri da poter essere utilizzati come tali nello step successivo senza ulteriore purificazione.

Successivamente, per l’ottenimento dei derivati tetraidroindazolici 6a-d, i composti

9a-d vengono solubilizzati in etanolo e addizionati di una quantità

stechiometricamente equivalente di 4-solfonammido fenilidrazina cloridrato commercialmente disponibile secondo procedure già descritte in letteratura [65] (Schema 2). La miscela di reazione viene scaldata a 80 °C per un periodo che va

67 dalle 5 alle 20 ore controllando mediante T.L.C (miscela eluente: etere di petrolio 40-60/acetato di etile = 1:9).

Dopo raffreddamento si ottiene una sospensione che viene filtrata ottenendo i composti 6a-d, che vengono successivamente purificati mediante cristallizzazione da etanolo.

Schema 2

Condizioni di reazione e reagenti:i: EtOH, 80 °C per 5-20 ore.

Per la sintesi dei derivati tetraidrochinazolici 7a-d è risultata necessaria la preparazione della N-sulfanilamido guanidina 10 come già descritto in letteratura

[73]_{. La sulfanilamide, prodotto commerciale, viene solubilizzata in HCl concentrato}

ed addizionata di cianamide (soluzione al 50% p/p). La miscela viene scaldata a 100 °C per 20-30 minuti sotto costante agitazione. Dopo raffreddamento la soluzione ottenuta viene versata in un becker contenente soluzione satura di NaHCO3 e tenuta in freezer tutta la notte. Si forma un precipitato bianco che viene

raccolto mediante filtrazione a pressione ridotta e direttamente utilizzato, senza ulteriore purificazione, nella reazione successiva (Schema 3).

I derivati dimetilamminometilenici 9a-d vengono solubilizzati in n-BuOH ed addizionati di una quantità stechiometricamente equivalente di composto 10 e

68 doppia di NaOH. La miscela di reazione viene lasciata a 120° per 16 ore controllando l’andamento della reazione mediante T.L.C. (miscela eluente etere di petrolio/ acetato di etile 1:9).

Dopo raffreddamento la soluzione viene filtrata a pressione ridotta ottenendo i composti 7a-d che vengono successivamente purificati tramite cristallizzazione da etanolo.

Schema 3

Condizioni di reazione e reagenti: i: HCl conc. al 37%, CNNH2 soluzione acquosa

al 50%, 100 °C per ½ ora; ii: n-BuOH, NaOH, 120 °C per 16 ore.

Tutti i composti finali ottenuti 6a-d e 7a-d, nonché tutti gli intermedi di reazione sono stati caratterizzati mediante dati analitici e spettroscopici ed i dati sono risultati in accordo con le strutture proposte.

69 I derivati 6a-d e 7a-d sono stati avviati a screening per essere saggiati quali inibitori catalitici delle isoforme hCA I-XIV presso il laboratorio del professor Supuran, C. T. dell’Università di Firenze. Al momento i risultati non sono ancora disponibili.

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Parte sperimentale

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