Inibitori della dark fermentation

I diversi fattori che possono determinare l'inibizione della produzione d’idrogeno biologico da dark fermentation possono essere generalmente classificati come inibitori di pre-processo o in-process [9].

Gli inibitori del pre-processo sono quei soppressori che sono già presenti prima del processo di DF, quali: ceppi batterici e ioni metallici. Gli inibitori in-process sono generati invece nel corso del processo DF come ammoniaca, idrogeno e prodotti finali [9].

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 Microflora batterica

Una microflora batterica mista oltre a contenere HPB, può anche comprendere un'ampia varietà di microrganismi come i batteri che consumano idrogeno (HCB) e altri microrganismi che competono con gli HPB per il consumo dei substrati, riducendo in questo modo la resa netta di bioidrogeno. Questi includono in metanogeni idrogenotropici (Hydrogenotrophic methanogenesis), Homoacetogenesis, batteri che riducono il solfato (SRB), batteri che riducono i nitrati (NRB), produttori di proprionico, batteri che riducono il ferro e batteri lattici (LAB) [9, 54, 60]:

Hydrogenotrophic methanogenesis; essi producono CH4 riducendo la CO2 ed

usando H2 come donatore di elettroni [9]. Di conseguenza, qualsiasi

molecola di H2 prodotta durante il processo DF, è consumata, con

conseguente riduzione della resa di bio-idrogeno: 4𝐻2+ 𝐶𝑂2 → 𝐶𝐻4+ 2𝐻2𝑂

Homoacetogens; Gli omoacetogeni sono anaerobi obbligati che hanno la

capacità di crescere autotroficamente, eterotroficamente o mixotropicamente, su una varietà di substrati, per produrre acetato [8, 50]. In particolare gli omoacetogeni autotrofi, contribuiscono alla formazione di acetato riducendo la CO2 usando H2 come donatore di

elettroni:

4𝐻₂+ 2𝐶𝑂₂ → 𝐶𝐻₃𝐶𝑂𝑂𝐻 + 2𝐻₂𝑂

Dinamarca et al. [23] hanno riportato che il tasso di consumo

omoacetogeno di H2 nelle colture anaerobiche varia tra 4 e 62 moli di

H2/l fango·d, ed è influenzato dalla concentrazione di acetato, dallo

spazio di testa, dalla storia dell'inoculo e dai tassi di trasferimento di massa.

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Priopionate producers; I produttori di propionato sono in grado di

utilizzare H2 come donatore di elettroni per la produzione di propionato

da glucosio:

𝐶6𝐻12𝑂6+ 2𝐻2 → 2𝐶𝐻3𝐶𝐻2𝐶𝑂𝑂𝐻 + 2𝐻2𝑂

Oltre a diminuire la resa di H2, i batteri produttori di propionato

sopprimono anche il processo di DF attraverso l'aumento della produzione di acido propionico, il quale ha un effetto inibente sulla produzione di bio-idrogeno [9, 60].

Sulphate-reducing bacteria; Gli SRB sono anaerobi obbligati in grado di

utilizzare una varietà di substrati come donatori di elettroni e di ridurre i solfati a solfuri [9, 22, 23, 54]. Inoltre, la presenza dei solfuri prodotti può inibire i processi biologici attraverso effetti tossici sulle attività e sui tassi di crescita di diversi microrganismi:

𝑆𝑂42−+ 3𝐻2+ 𝐻+ → 𝐻𝑆−+ 4𝐻2𝑂

Dhar et al.[22] hanno riportato che concentrazioni di solfuro disciolte

superiori a 100 mg/L hanno prodotto una riduzione della produzione di H2.

Nitrate-reducing bacteria; I NRB sono eterotrofi o autotrofi, tuttavia solo i

batteri denitrificanti autotrofi sono HCB, utilizzando quindi H2 come

donatore di elettroni per produrre ammoniaca [9]. 𝑁𝑂₃−_{+ 4𝐻}

2+ 𝐻+ → 𝑁𝐻3+ 3𝐻2𝑂

Lactic acid bacteria; la presenza di LAB agisce come inibitore della

produzione di bio-idrogeno attraverso la competizione dei substrati o per il rilascio di tossine [9]. I LAB competono con gli HPB per il consumo di substrati (piruvato) e producono acido lattico a spese del bio-idrogeno, con conseguente riduzione della resa di produzione.

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Le strategie per ridurre o rimuovere la concentrazione dei suddetti ceppi batterici dannosi per un ottimale processo di dark fermentation sono molto complesse e labili da un punto di vista impiantistico, poiché funzione del tipo di substrato, del tipo di inoculo e di numerosi parametri gestionali.

Le principali tecniche di controllo sono tuttavia rappresentate dal pre- trattamento dell’inoculo, dal mantenimento di pH basso in condizioni acide e da un limitato HRT di processo [9, 54, 60].

 Ioni metallici

Gli ioni metallici sono un requisito importante del processo di DF poiché aiutano il metabolismo batterico, la crescita cellulare, l'attivazione e il funzionamento di enzimi e coenzimi e la produzione di bio-idrogeno [9, 28].

Nondimeno, alte concentrazioni di ioni metallici possono dimostrarsi inibitori e quindi sopprimerne la produzione.

In particolare:

- Magnesio Mg2+

Alte concentrazioni possono accelerare la glicolisi, con conseguente aumento della concentrazione di metaboliti glicolitici, la quale provoca una repressione della glicolisi. Il valore soglia riportato per il magnesio, in un processo di DF con glucosio e un inoculo costituito da fango è pari a 1.0 mg/L [9].

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- Sodio Na+

L'aggiunta di ioni sodio aumenta la riduzione di Fdox, comportando una

maggiore concentrazione di Fdred, favorendo così la formazione di H2.

Concentrazioni eccessive determinano l’inibizione della produzione di bioidrogeno a causa di un cambiamento nella via metabolica, che favorisce la formazione di altri metaboliti a scapito di H2. Il valore soglia

riportato per il sodio, in un processo di DF con glucosio e un inoculo costituito da fango, è pari a 1000.0 mg/L [9].

- Calcio Ca2+

Lee et al. [40] hanno riportato che l’aggiunta di 5.4 e 27.2 mg/L di Ca2+ _nel

processo di DF ha portato ad una maggiore produzione di bio-idrogeno. Tuttavia, valori elevati comportano l’inibizione del processo fermentativo. Il valore soglia riportato per il calcio, in un processo di DF con glucosio ed inoculo costituito da fango, è pari a 150.0 mg/L [9].

- Ferro Fe2+

Il ferro è uno ione metallico molto importante poiché è richiesto sotto forma di ferredoxine (o proteine ferro-zolfo), le quali assistono il trasferimento di elettroni per l'ossidazione del piruvato in acetil-CoA tramite la via di Pfor nei processi di DF prima della produzione di bio- idrogeno [9, 22]. Di conseguenza, una concentrazione minima di ferro è fondamentale per un'efficace produzione. Tuttavia concentrazioni troppo elevate di ferro possono influenzare negativamente il metabolismo batterico, con conseguente riduzione delle loro attività e soppressione della produzione di bio-idrogeno. Il valore soglia riportato per il ferro, in un processo di DF con glucosio e un inoculo costituito da fango, è pari a 350.0 mg/L [9].

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- Nichel Ni2+

Concentrazioni minime di Ni2+ _{sono necessarie per un’ottima produzione}

di bio-idrogeno. Nondimeno, alte concentrazioni di Nichel inibiscono il processo. Il valore soglia riportato, in un processo di DF con glucosio e un inoculo costituito da fango, è pari a 0.1 mg/L [9].

- Altri ioni metallici

Altri metalli pesanti che influiscono sulla produzione di bioidrogeno fermentativo scuro includono rame, manganese, zinco, cromo, cadmio e piombo. Li e Fang [39] hanno riportato gli effetti di inibizione di diversi metalli pesanti sulla produzione di bio-idrogeno: nell'ordine Cu (più inibente), Ni ~ Zn, Cr, Cd, Pb (meno inibente), i cui valori soglia sono molto variabili in funzione del tipo di substrato e di inoculo [9, 39].

 Ammoniaca

L'azoto ammoniacale esiste sia come ammoniaca libera (NH3), sia come

ione ammonio (NH4+). Alte concentrazioni di tali composti hanno effetti

tossici e repressivi nei processi di DF e DA [9].

L’ammoniaca libera è considerata l’inibitore principale [9], poiché può facilmente diffondersi attraverso la membrana cellulare; in questo modo essa tende a reagisce con un protone per formare NH4, generando così

uno squilibrio nel pH intracellulare e determinando l’inibizione delle attività batteriche [3, 9]. La concentrazione soglia di ammoniaca varia molto in relazione al tipo di substrato e al pH del materiale; in particolare

Salerno et al. [55] riportano valori compresi tra 350 – 500 mg/L per pH tra

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 Concentrazioni di metaboliti solubili

Il processo di DF comporta, oltre alla produzione di bio-idrogeno, la generazione di altri sottoprodotti, i quali includono in particolare acidi grassi volatili e solventi. La formazione di questi metaboliti dipende dalla via metabolica dei microrganismi ed è generalmente classificata come acidogenesi (per la formazione di acidi organici) e solventogenesi (per la produzione di solventi). Sebbene bassi livelli di questi prodotti finali possano essere favorevoli per la produzione di bio-idrogeno, alte concentrazioni possono provocare un'inibizione del processo [9].

Tra i diversi metaboliti generati durante il processo di DF, l'acido butirrico è maggiormente tossico rispetto all’acido acetico poiché un massimo di 4 mol di H2 possono essere sintetizzate per mole di glucosio

con acido acetico come prodotto finale, mentre solo 2 moli di H2 possono

essere prodotte se l'acido butirrico è il prodotto finale [9, 54].

Poiché la formazione di metaboliti solubili è fortemente dipendente dal pH, mantenerlo entro un intervallo appropriato, compreso tra 4 e 6, è fondamentale per ridurre al minimo la produzione di alcuni metaboliti.

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