INIBITORI DELL’ANIDRASI CARBONICA COME ANTITUMORALI.

Un aspetto importante di molti tumori è l’ipossia [59]. L’inadeguato rifornimento di ossigeno è la principale conseguenza patofisiologica della microcircolazione disturbata sia strutturalmente che funzionalmente e dei processi di diffusione dell’ossigeno deteriorati. L’ipossia nei tumori appare essere fortemente associata con la propagazione del tumore, con la trasformazione in maligno, e con la resistenza alla chemioterapia e alla radioterapia. L’ipossia regola l’espressione di differenti geni, incluso l’isoenzima CA IX, attraverso la cascata del fattore di ipossia inducibile 1 (HIF1). L’espressione della CA IX è fortemente sovra- regolata dall’ipossia e viene sotto-regolata dalla proteina sopprimitrice di tumori

Figura 13.

L’espressione della CA IX viene fortemente aumentata in molti tipi di tumori, come nel glioma/ependimoma, nel mesotelioma, nel carcinoma papillare/follicolare, nel carcinoma della vescica, della cervice uterina, nel carcinoma naso-faringeo, di testa e collo, del seno, dell’esofago, dei polmoni, del cervello, della vagina, nel carcinoma delle cellule basali/squamose, e tumori renali.

In alcune cellule cancerogene, il gene VHL è mutato portando ad una forte sovra- regolazione della CA IX (fino a 150 ripiegamenti) come conseguenza dell’attivazione dell’HIF costitutiva.

La CA IX appartiene alla famiglia delle α-CAs umane molto attive, dove le sue proprietà catalitiche della reazione di idratazione della CO2 sono paragonabili con

quelle del catalizzatore CA II altamente evoluto, infatti, siccome la struttura a raggi X della CA IX non è ancora disponibile, molti studi hanno usato la struttura

della CA II per il modello e il disegno di inibitori della CA IX. Come per tutte le α-CAs, la CA IX è sensibile all’inibizione da anioni, dalle solfonammidi e sulfamati, con gli inibitori che coordinano direttamente con lo ione zinco dentro la cavità del sito attivo e che partecipano a varie interazioni favorevoli con residui amminoacidici situati nel mezzo idrofobico e idrofilico del sito attivo.

Diversi anni fa sono stati identificati molti inibitori della CA IX con concentrazioni del basso nanomolare (Tabella 3) [38,40]. Fra loro, qualche sulfamato e solfonammide è stata caratterizzata con la cristallografia a raggi X e con modelli analoghi. Tali studi hanno messo in evidenza anche composti che non permeano la membrana (e così inibiscono in modo specifico la CA IX in vivo) o agiscono come inibitori duali CA IX-COX2 (cicloossigenasi 2). Sia le solfonammidi eterocicliche che aromatiche come anche le solfonammidi/sulfamati/sulfammidi alifatiche possiedono un’attività inibitoria nell’ordine del basso nanomolare per le CA IX che sono state scoperte finora. Sono state anche descritte solfonammidi che incorporano vari zuccheri, ma finora la maggior parte degli CAIs usati per comprendere la funzione di questa proteina

Come descritto precedentemente, l’ipossia, attraverso la cascata dell’HIF, porta ad una alta sovraespressione della CA IX in molti tumori. Complessivamente la conseguenza di ciò è un pH sbilanciato, con la maggior parte dei tumori ipossici che hanno un pH acido con valori intorno a 6, in contrasto con i normali tessuti, i quali hanno un pH caratteristico con valori intorno a 7.4.

L’espressione costitutiva della CA IX umana ha recentemente mostrato di diminuire il pH extracellulare (pHe) nelle cellule epiteliali dei reni canini in

Madin-Darby (MDCK). Gli inibitori solfonammidici CA IX-selettivi (del tipo 17 e 18) hanno ridotto l’acidità nel mezzo inibendo l’attività catalitica dell’enzima, e quindi la generazione di ioni H+, legandosi in modo specifico solo alle cellule ipossiche che esprimono la CA IX. L’eliminazione del sito attivo della CA ha anche dimostrato di ridurre l’acidità del mezzo, ma un inibitore solfonammidico non può legarsi al sito attivo di tali proteine mutanti.

Perciò, le cellule tumorali diminuiscono il loro pHe sia con la produzione di acido

catalizzata dai tumori associati alla CA IX, che possiede un dominio catalitico extracellulare (Figura 14).

Figura 14.

Il basso pHe è stato associato con la trasformazione tumorigenica, con il

riarrangiamento cromosomiale, con la rottura della matrice extracellulare, la migrazione e l’invasione, l’induzione dell’espressione dei fattori di crescita cellulari e l’attivazione delle proteasi.

La CA IX probabilmente assume anche un ruolo nel fornire bicarbonato per essere usato come substrato per le cellule di crescita, siccome è stabilito che è necessario il bicarbonato per la sintesi dei nucleotidi pirimidinici.

L’indisulam (8), un derivato solfonammidico (originariamente chiamato E7070) con potente attività antitumorale, ha recentemente mostrato di agire come inibitore nell’ordine del nanomolare della CA IX (Tabella 3) [60].

Il suo dettagliato meccanismo d’azione non è chiaro, ma si sa che è coinvolto nella perturbazione del ciclo cellulare nelle fasi G1e/o G2, nella sottoregolazione delle cicline, nella riduzione dell’attività della chinasi 2 ciclina dipendente (CDK2), nell’ inibizione della fosforilazione della proteina del retinoblastoma (pRb) e nell’espressione differenziata di molecole che partecipano all’adesione cellulare, nella risposta di segnale e immunitaria, in aggiunta alle sue proprietà inibitorie nei confronti della CA IX. L’indisulam ha mostrato efficacia in vivo contro xenografts di tumori nei topi nudi, evidenziando un significante effetto antitumorale e passando alla fase clinica I e II per il trattamento dei tumori solidi. Fra i principali derivati riportati finora, alcuni dei più interessanti potenti inibitori della CA IX sono dei composti studiati da Svastova et al. (strutture 17 e 18) [61]. Nelle cellule tumorali sono predominanti oltre che gli isoenzimi CA IX anche le CA XII dove mostrano una ridotta espressione nei normali tessuti. E’ stato recentemente provato che dall’idratazione del biossido di carbonio a protoni e bicarbonato, queste CAs contribuiscono in maniera significativa all’acidificazione

extracellulare dei tumori solidi, come già detto in precedenza, mentre la loro inibizione diminuisce tale fenomeno con una certa estensione. Le CA IX e XII sono sovraespresse in molti tipi di tumori in risposta al fattore inducibile di ipossia (HIF), e la ricerca sul coinvolgimento di tali isoenzimi nel cancro ha fatto significativi progressi negli ultimi anni.

La pubblicazione della struttura cristallina a raggi X della CA IX [13], che è una proteina dimerica con struttura quaternaria non identificata prima per questa famiglia di enzimi (Figura 15), ci permette di progettare farmaci inibitori con uno

scaffold attivo contro questo nuovo bersaglio antitumorale. In verità, si sa da

molto tempo che molte classi di solfonammidi e sulfamati aromatici/eterociclici hanno buona affinità per questa isoforma, ma generalmente non mostrano specificità per l’inibizione delle isoforme associate al tumore verso i restanti isoenzimi CA (CA I-VII e XII-XV) trovati nei mammiferi.

Negli ultimi anni sono stati riportati diversi approcci per ottenere composti che bersagliano in modo specifico le isoforme associate ai tumori: solfonammidi fluorescenti (come il composto 17), usate per ottenere immagini a scopo diagnostico e per determinare il ruolo delle CA IX nell’acidificazione dei tumori; Il derivato 17 è una solfonammide fluorescente che si lega solo alla CA IX in condizioni di ipossia in vivo. Questo composto può quindi essere usato come

probe fluorescente per accertare la presenza di tumori ipossici. (ii) composti

carichi positivamente (come il composto 18) o negativamente, che non possono attraversare la membrana plasmatica a causa della presenza della carica e inibendo così in modo selettivo solo le CAs extracellulari, fra le quali la CA IX e la XII; Il composto 18 appartiene alla classe di composti carichi positivamente, composti che non attraversano la membrana. Quindi, poichè tali composti non inibiscono le CAs intracellulari, possono mostrare minori effetti collaterali confrontandoli con i composti attualmente disponibili (come l’acetazolamide), i quali inibiscono indiscriminatamente tutte le CAs. La struttura cristallina a raggi X del composto 18 nell’addotto con la CA II (il cui sito attivo è simile a quello della CA IX) è stato riportato recentemente. Il derivato piridinico carico positivamente 18 si lega preferibilmente al sito attivo dell’enzima, coordinando con la funzione della solfonammide deprotonata a livello dello ione cataliticamente critico Zn2+_{. Tale}

derivato stabilisce altre interazioni favorevoli con residui amminoacidici presenti nella cavità del sito attivo, includendo lo stacking tra l’anello trimetilpiridinico dell’inibitore 18 e l’anello fenilico della Phe131, un amminoacido importante per il legame di inibitori alle CAs [13]. Un simile meccanismo di legame è stato ulteriormente riportato per il derivato fluorescente 17 [14]. In questo modo, queste

strutture possono essere usate per la progettazione razionale di farmaci che inibiscono in modo più selettivo e potente l’isoenzima IX. (iii) composti ipossia- attivabili, i quali utilizzano le basse condizioni dei tumori ipossici per convertire un profarmaco inattivo in un CAI attivo; (iv) solfonammidi/sulfamati/sulfammidi contenenti zucchero dei tipi 27-31, i quali a causa delle loro caratteristiche altamente idrofiliche non passano facilmente le membrane, possedendo così un’elevata affinità per le CAs extracellulari come la CA IX e XII; (v) nanoparticelle rivestite da CAIs; e (vi) differenti chemotipi rispetto le solfonammidi e suoi bioisosteri, come i fenoli 32-34, gli inibitori della proteina tirosin chinasi 35 e 36, le cumarine 37-50, i fullereni 51, e altri composti recentemente studiati come alternativi CAIs agli inibitori di tipo classico [62,63], Figura 16.

Gli inibitori della proteina tirosin chinasi (PTKIs) in uso clinico come agenti antitumorali imatinib 35 e nilotinib 36 hanno recentemente mostrato essere inibitori della CA IX/XII nel range del nanomolare, sebbene il loro meccanismo di inibizione non sia ancora conosciuto, poichè non sono state finora ottenute strutture cristalline a raggi X degli addotti di qualche isoenzima della CA con i due composti. Tuttavia, questa scoperta che spiega i potenti effetti antitumorali dei due composti in molti tipi di tumori maligni, che in aggiunta all’inibizione della PTK, possono essere anche causati dall’inibizione delle isoforme della CA associate al cancro. È stato dimostrato che le cumarine e le tiocumarine agiscono come CAIs, e il loro meccanismo di inibizione è stato decifrato in dettaglio da un gruppo di ricercatori [62]. Essi hanno dimostrato che il prodotto naturale 6-(1S- idrossi-3-metilbutil)-7-metossi-2H-cromen-2-one 37 e la semplice cumarina non sostituita 38 sono idrolizzate nel sito attivo della CA con la formazione dell’acido 2-idrossi-cinnamico 39 e 40, rispettivamente, i quali rappresentano di fatto gli enzimi inibitori. Successivamente, durante questi studi sono emersi altri due fatti interessanti: (i) questa nuova classe di CAIs, le cumarine/tiocumarine, si legano nella forma idrolizzata all’entrata del sito attivo delle CA e non interagiscono con lo ione metallico, formando così una categoria completamente nuova di inibitori; e (ii) per lo specifico caso del composto 37, l’acido cinnamico-sostituito 39 è stato osservato un legame nel sito attivo della CA come isomero cis, sebbene questi derivati siano stabili in soluzione come isomeri trans. Tuttavia, per la cumarina più semplice 38, l’acido trans-2-idrossicinnamico 40 è stato evidenziato che si lega al sito attivo dell’enzima, tramite cristallografia a raggi X. Il tentativo di spiegare la geometria insolita dell’inibitore 39 nel sito attivo dell’enzima è stato

che il 29 potrebbe essere troppo ingombrante come isomero trans nello spazio ristretto del sito attivo della CA, mentre l’isomero cis instabile in soluzione potrebbe essere stabilizzato quando si lega nella cavità dell’enzima. Dovrebbe essere anche detto che le cumarine 37 e 38 sono potenti inibitori contro alcune isoforme della CA umana studiate, le quali rendono questa intera classe di derivati molto interessante per la progettazione di nuovi CAIs. Il legame della cumarina idrolizzata all’hCA II è mostrato in Figura 17, dove sono evidenziate anche le strutture degli attivatori istamina e L-adrenalina, mostrando che i siti di legame

delle cumarine e degli attivatori nelle CAs sono gli stessi [62].

Figura 17

In seguito sono stati ricercati una serie di derivati aventi varie porzioni in cui l’anello (tio)cumarinico è stato sostituito nelle posizioni 3-,6-,7-,3,6-,4,7-, e 3,8-, nei tipi 41-50. La più significante scoperta di questo secondo studio è stata che alcune cumarine sono davvero degli CAIs isoforma-selettivi, che inibiscono in modo efficiente solo una isoforma delle 13 cataliticamente attive trovate negli

umani. Per esempio, la tiocumarina 45 e diverse cumarine (43, 44, 46, e 47) hanno mostrato un’affinità nell’ordine del basso nanomolare per la CA IX, con costanti di inibizione nel range di 45-98 nM. Queste cumarine incorporano la funzione 6- idrossimetil- e 3-esterea (43 e 46, 47), senza importanti differenze di attività tra gli esteri metilici ed etilici in questo caso. I derivati monosostituiti 48 e 50 d’altra parte contengono o un gruppo piccolo (CH2OH) o un gruppo piuttosto

ingombrante (esametilenetetrammina) in posizione 6 dell’anello cumarinico, i quali rendono le scoperte fatte molto importanti, dal momento che è chiaro che per un efficace inibizione della CA IX, in posizione 3- e 6- dell’anello (tio)cumarinico è permessa una grande varietà di motivi strutturali. Il composto 50 ha mostrato di essere un inibitore nell’ordine del basso nanomolare della sola CA IX (KI di 48 nM) mentre inibisce nel range micromolare tutte le altre 12 CAs, una

caratteristica mai evidenziata prima per un CAI di tipo solfonammidico. Quindi, questo è il primo inibitore CA IX selettivo mai riportato finora [62].

La prova in vivo che i potenti inibitori della CA IX possano realmente mostrare effetti antitumorali è stata pubblicata solo molto recentemente dal gruppo di Neri [64]. Usando derivati che non permeano la membrana, partendo dallo scaffold dell’acetazolamide al quale vengono attaccati o l’acido fluoresceina-carbossilico o l’albumina, questo gruppo ha mostrato un ritardo nella comparsa del tumore resistente (nei topi con xenografts di una linea di cellule renali cancerogene, SK- RC-52) in animali trattati per un mese con questi inibitori della CA.

Di recente, il gruppo di Neri [65] ha anche pubblicato uno studio che mostra che gli anticorpi monoclonali umani che bersagliano le CA IX possono anche essere usati per fornire immagini del tumore ipossici. È stata descritta una generazione di

anticorpi monoclonali umani ad alta affinità (A3 e CC7) specifici per l’hCA IX, usando la tecnologia phage. Questi anticorpi sono capaci di colorare la CA IX ex

vivo e di bersagliare l’ antigene affine in vivo. In un modello animale con cancro a

livello del colon (LS174T), l’imaging della CA IX si sovrappone esattamente con la colorazione del pimonidazolo, con una colorazione preferenziale dell’area tumorale caratterizzata da una piccola vascolarizzazione e bassa perfusione. La stessa conclusione è stata ottenuta da un altro gruppo di ricercatori usando piccole molecole di inibitori CA IX-selettivi del tipo 17.

La solfonammide fluorescente 17 con alta affinità per le CA IX ha mostrato di legarsi alle cellule solo quando la proteina CA IX è espressa dalle cellule in ipossia. I topi NMRI-nu trapiantati a livello sottocutaneo con tumore al colon HT -29 sono stati trattati con il 7% di ossigeno o con la nicotinammide e carbogeno e sono stati confrontati con animali di controllo. L’accumulo dell’CAI 17 è stato monitorato da imaging fluorescente non invasivo. Un accumulo specifico del 17 può essere osservato nelle aree tumorali delineate e confrontato con un analogo non-solfonammidico strutturalmente simile che contiene lo stesso scaffold (ad

esempio, un derivato con la stessa struttura del composto 17 ma senza il gruppo SO2NH2).

La somministrazione della nicotinammide e del carbogen, diminuisce l’ipossia acuta e cronica, rispettivamente, e previene l’accumulo del 17 nei tumori. Quando si tratta con il 7% di ossigeno inalato, è stato osservato che si ha un accumulo triplicato del composto 17.

Inoltre, la frazione di inibitore legata si riduce rapidamente in seguito alla riossigenazione del tumore. Questi risultati dell’imaging in vivo confermano i dati in vitro precedenti che dimostrano che il legame delle CAI e la ritenzione richiede l’esposizione all’ipossia. Le solfonammidi fluorescenti possono quindi rappresentare un potente strumento per visualizzare la risposta all’ipossia nei tumori solidi. Un importante passo è stato quindi fatto nei confronti dell’applicabilità clinica, fornendo la possibilità di selezionare pazienti per terapie dirette verso la CA IX.

Recentemente [63] è stato anche mostrato che i derivati del fullerene che incorporano una funzione amminoacidica protetta pendente, come il derivato della fenilalanina 51, inibiscono gli isoenzimi CA (inclusa la CA IX) nel range submicromolare impedendo l’entrata nel sito attivo, come mostrato in Figura 18.

Figura 18.

In definitiva, i dati biochimici, fisiologici e farmacologici indicano che l’inibizione dei tumori associati con l’isoenzima CA IX possono essere utilizzati nella gestione dei tumori ipossici che non rispondono alla classica chemioterapia e radioterapia.

Finora, l’uso degli CAIs descritti forniscono possibilità di sviluppo sia come strumenti diagnostici per l’imaging non-invasiva di questi tumori, che come agenti terapeutici che probabilmente cambiano l’acidità extratumorale nella quale la CA IX è coinvolta.

5.5. INIBITORI DELL’ANIDRASI CARBONICA QUALI FARMACI PER