Nuove applicazioni terapeutiche per inibitori e attivatori delle anidrasi carboniche

1. INTRODUZIONE [1]

Le ANIDRASI CARBONICHE (CAs) sono zinco-enzimi ubiquitari, presenti nei procarioti ed negli eucarioti e che sono codificati da quattro distinte famiglie genetiche di diversa evoluzione: le α-CAs (presenti nei vertebrati, nei batteri, nelle alghe e nel citoplasma delle piante verdi), le β-CAs (principalmente nei batteri, nelle alghe e nei cloroplasti sia delle mono- che delle dicotiledoni), le γ-CAs (presenti soprattutto negli archeobatteri ed in altri batteri) e le δ-CAs, presenti in qualche diatomea marina [2,3].

Nei mammiferi, sono descritti 16 differenti isoenzimi α-CA o proteine CA-correlate (CARP) (tabella 1), con localizzazione subcellulare e distribuzione nei tessuti molto varia [2,3].

Tabella 1. Isoenzimi α-CA nei vertebrati superiori. Isoenzima Attività catalitica Idratazione CO2 Affinità per le solfonammidi Localizzazione subcellulare

CA I Moderata Media Citosol

CA II Alta Molto alta Citosol

CA III Molto bassa Molto bassa Citosol

CA IV Alta Alta Legato alla membrana

CA VA Bassa-moderata Alta Mitocondrio

CA VB Alta Alta Mitocondrio

CA VI Moderata Alta Secreto nella saliva/latte

CA VII Alta Molto alta Citosol

CARP VIII Acatalitica Sconosciuta Citosol

CA IX Moderata-alta Alta Transmembrana CARP X Acatalitica Sconosciuta Secreto

CARP XI Acatalitica Sconosciuta Secreto

CA XII Bassa Molto alta Transmembrana CA XIII Moderata Medio-alta Citosol

CA XIV Moderata Alta Transmembrana

Fondamentalmente, ci sono varie forme citosoliche (CA I-III e CA VII), cinque isoenzimi di membrana (CA IV, CA IX, CA XII, CA XIV e CA XV), una forma mitocondriale (CA V) ed anche un isoenzima secreto, CA VI.

Questi enzimi catalizzano una reazione fisiologica molto semplice, l’interconversione tra anidride carbonica e lo ione bicarbonato, e sono quindi coinvolti nei processi fisiologici importanti collegati con la respirazione ed il trasporto di CO2 /bicarbonato tra tessuti di metabolizzazione ed i polmoni, il pH e

l’omeostasi di CO2, la secrezione di elettroliti in vari tessuti/organi, le reazioni di

biosintesi (come la gluconeogenesi, la lipogenesi e la ureogenesi), il riassorbimento delle ossa, la calcificazione, la tumorigenicità e molti altri processi fisiologici e patologici [2,3].

Oltre alle reazioni fisiologiche, come l’idratazione reversibile della CO2 a

bicarbonato (reazione 1.1, Fig. 1), le α-CAs catalizzano una varietà di altre reazioni:

• l’idratazione del cianato ad acido carbammico, o della cianammide ad urea (reazioni 1.2 e 1.3);

• l’idratazione dell’aldeide a gem-diolo (reazione 1.4);

• l’idrolisi dell’estere carbossilico, o solfonico (reazioni 1.5, 1.6), così come altri processi idrolitici minori, come quelli descritti dalle equazioni 1.7-1.9 in Fig. 1. [4].

Figura 1. Reazioni catalizzate dalle α-CAs

Bisognerebbe notare che l’attività fosfatasica precedentemente decritta della CA III è stata recentemente provata essere un artefatto [2].

Non è chiaro in questo momento se altre reazioni catalizzate dalla α-CA come l’idratazione della CO2 hanno un significato fisiologico.

E’ stata attualmente determinata la struttura cristallografica a raggi X per sei α-CAs (isoenzimi CA I-VA, CA XII e CA XIV) [2,5] così come per alcuni isoenzimi rappresentativi delle famiglie di β- e γ-CA.

2. MECCANISMO CATALITICO E DI INIBIZIONE DELLE ANIDRASI CARBONICHE [1]

Il meccanismo catalitico delle CAs è conosciuto in dettaglio [6]: in tutte le classi di enzimi una specie metallica idrossilata (L3-M2+-OH-) dell’enzima è la specie

cataliticamente attiva, agendo come un forte nucleofilo (a pH neutro) sulla molecola di CO2 all’interno di una tasca idrofobica nelle vicinanze. Questa specie

metallica idrossilata si genera dall’acqua coordinata con lo ione metallico, il quale si trova in fondo alla cavità del sito attivo. Il centro attivo normalmente comprende ioni M(II) in una geometria tetraedrica, con tre proteine Ligande (L) in aggiunta alla molecola d’acqua/ione idrossido, ma lo Zn(II) e il Co(II) sono stati anche osservati nelle geometrie di coordinazione trigonale bipiramidale o ottaedrica, per lo meno nelle γ-CAs.

In molti enzimi, la formazione della specie metallica idrossilata dal metallo-coordinato con l’acqua rappresenta lo stadio determinante del turnover catalitico, il quale per qualche α- e ζ-CAs la Kcat/KM raggiunge valori >108 M-1 s-1; questo

rende le CAs fra i più efficienti catalizzatori conosciuti in natura. I ligandi ionici metallici sono tre residui di His negli α-, γ-, e δ-CAs o una His e due residui di Cys nei β- e ζ-CAs. Qualche enzima della classe β ha quattro ligandi zinco proteina, che sono, una His, due Cys, e un Asp coordinato allo Zn(II). Per questi enzimi l’acqua non è coordinata allo ione metallico a valori di pH <8, come mostrato in un eccellente lavoro di cristallografia del gruppo di Jones sugli enzimi micobatterici Rv3558 e Rv1284. Tuttavia, a valori di pH >8, un residuo di Arg conservato in tutte le β-CAs studiate finora (appartenenti al così chiamato

elemento bivalente catalitico) forma un ponte salino con l’Asp coordinato allo Zn(II), liberando la quarta posizione di coordinazione dello Zn(II), la quale viene poi occupata dall’ingresso di una molecola d’acqua/ ione idrossido.

L’inibizione e l’attivazione delle CAs sono processi ben conosciuti, con la maggior parte degli inibitori che si legano al centro del metallo, e gli attivatori che si legano all’entrata della cavità del sito attivo e che partecipano allo spostamento dei protoni tra lo ione metallico-legato ad una molecola d’acqua e l’ambiente. Questo porta all’aumento della formazione del metallo idrossilato, la specie cataliticamente attiva dell’enzima [7,8].

2.1. α-CAs.

Lo ione metallico (come lo Zn(II) presente in tutte le α-CAs studiate finora) è essenziale per la catalisi [2,3]. I dati cristallografici a raggi X della struttura cristallina hanno dimostrato che lo ione metallico è situato nella tasca del sito attivo profonda 15 Å (Fig. 2), ed è coordinato con tre residui di istidina (His94, His96 e His119) e una molecola d’acqua/ione idrossido [2,3].

L’acqua legata allo zinco è anche impegnata nella formazione di un legame a idrogeno con l’idrossile della Thr199, che a sua volta è collegata con il carbossilato della Glu106; queste interazioni aumentano la nucleofilicità della molecola d’acqua legata allo zinco, e orientano il substrato (CO2) in una posizione

favorevole per l’attacco nucleofilo (Fig. 3) [2,3].

Figura 3.

La forma attiva dell’enzima è la base, con l’idrossido legato allo Zn(II) (Fig.3A). Questo forte nucleofilo attacca la molecola di CO2 legata in una tasca idrofobica

nelle sue vicinanze ( il sito di legame del substrato comprende residui di Val 121,di Val 143 e di Leu 198 nel caso dell’isoenzima umano CA(II) (Fig.3B), portando alla formazione di bicarbonato coordinato allo Zn(II) (Fig. 3C). Lo ione bicarbonato viene poi spiazzato da una molecola d’acqua e liberato in soluzione,

portando alla forma acida dell’enzima, con l’acqua coordinata allo Zn(II) (Fig.3D), che è la forma cataliticamente inattiva [2,3]. Al fine di rigenerare la base A, ha luogo una reazione di trasferimento di un protone dal sito attivo all’ambiente circostante, che può essere sostenuta sia da residui del sito attivo (come l’His64- il protone navetta negli isoenzimi I, II, IV, VII, IX e XII-XIV tra gli altri) che da tamponi presenti nel mezzo.

Il processo può essere schematicamente rappresentato dalle equazioni (1.10) e (1.11):

EZn2+_—OH- _{+ CO}

2 ⇔ EZn2+ —HCO3- ⇔ EZn2+ —OH2 + HCO3- (1.10)

EZn2+ _—OH

2 ⇔ EZn2+—OH- + H+ (1.11)

Il passaggio chiave nella catalisi è la seconda reazione, ovvero il trasferimento del protone che rigenera la specie Zn-idrossido dell’enzima [2,3,9]. Negli isoenzimi cataliticamente molto attivi, come CA II, CA IV, CA VII e CA IX, il processo è sostenuto da un residuo di istidina posto all’ingresso del sito attivo (His64), e da un gruppo di istidine (Fig. 1.2), che sporgono dal bordo del sito attivo sulla superficie dell’enzima, assicurando così un processo di trasferimento di protoni molto efficace per l’isoenzima CA II [9]. Questo spiega anche perché CA II è uno degli enzimi più attivi conosciuti (con una Kcat/Km = 1.5 x 108 M-1s-1) e fornisce

anche importanti basi per la progettazione di suoi inibitori con applicazioni cliniche [2,3,9].

Sono note due principali classi di inibitori CA (CAIs): gli anioni complessanti il metallo, e le solfonammidi non sostituite, che legano lo ione Zn(II) dell’enzima

sia sostituendo il ligando non proteico dello zinco (eq. 1.12 in Fig. 4) o aggiungendo al metallo una sfera di coordinazione (eq. 1.13 in Fig. 4), generando specie trigonali-bipiramidali [2,3,10].

Figura 4.

Le solfonammidi, che sono i più importanti CAIs, come i derivati usati in clinica acetazolamide, metazolamide, etossizolamide, diclorofenamide, dorzolamide e brinzolamide [11], legano lo ione Zn(II) con una geometria tetraedrica (Fig. 4), allo stato deprotonato, con l’atomo di azoto della solfonammide coordinato allo Zn(II) e formano un’estesa rete di legami a idrogeno, coinvolgendo residui di Thr199 e di Glu106, che partecipano anche all’ancoraggio della molecola di inibitore allo ione metallico. La parte aromatica/eterociclica dell’inibitore (R)

interagisce con residui idrofilici e idrofobici della cavità. Gli anioni si possono legare sia con un geometria tetraedrica allo ione metallico sia come addotti trigonali-bipiramidali, come ad esempio l’addotto tiocianato mostrato in Fig. 4B [10,11].

Nella tabella 2 sono riportati i dati di inibizione verso gli isoenzimi umani cataliticamente attivi di questi composti utilizzati in clinica (come le solfonammidi, il topiramato ed il suo derivato sulfamidico).

Per molti addotti degli inibitori solfonammide/ sulfamato/ sulfammide con gli isoenzimi CA I, II e IV [10, 12-14] sono disponibili le strutture cristallografiche a raggi X. In tutti questi addotti, la forma deprotonata della solfonammide/ del sulfamato/ della sulfammide è coordinata allo ione Zn(II) dell’enzima, e il suo

gruppo NH partecipa nel legame a idrogeno con l’Oγ della Thr199, che a sua volta

è impegnato in un altro legame a idrogeno col gruppo carbossilato della Glu106 [10, 12-15]. Uno degli atomi di ossigeno della funzione SO2NH partecipa anche

nel legame a idrogeno con il gruppo NH della Thr199. Ci sono vari esempi di addotti di questi inibitori con la CA II che sono solfonammidi, sulfamato e sulfamidici (Fig. 5-7).

Figura 6. EMATO legato al sito attivo della hCAII [16].

Figura 7. Sovrapposizione tra hCAII e topiramato (blu chiaro) e tra hCAII e sulfamide analoga del topiramato (giallo).

I diversi modi di interazione con i quali una solfonammide CAI raggiunge un’affinità molto alta (nel range del basso nanomolare) per il sito attivo della CA, sono illustrati nelle Fig. 5-7 per un inibitore solfonammidico contenente fluoro, PFMZ [12], per un sulfamato steroideo inibitore della CA, EMATO [16], per il farmaco antiepilettico topiramato, e per la sulfamide analoga [15]. Così, gli CAIs possono essere progettati usando come gruppi di ancoraggio allo zinco sia la solfonammide, che il sulfamato che la sulfamide. Per esempio, si può osservare che per il composto solfonammidico PFMZ, il gruppo ionizzato della solfonammide ha rimpiazzato lo ione idrossile coordinato con lo Zn (II) nell’enzima originario (distanza Zn-N di 1.95 Å), con lo ione metallico che rimane nella sua geometria tetraedrica stabile, coordinato anche con l’azoto solfonammidato, dall’azoto imidazolico di His 94, His 96 e His 119. Il protone dell’atomo di azoto del solfonamidato coordinato forma anche un legame a idrogeno con il gruppo idrossilico della Thr 199, che a sua volta accetta un legame a idrogeno dal carbossilato della Glu 106. Uno degli atomi di ossigeno della solfonammide forma un legame a idrogeno con l’ammide della Thr 199, mentre l’altro è semi-coordinato con lo ione Zn (II) catalitico (distanza O-Zn di 3.0 Å). L’anello tiazolidinico dell’inibitore è situato nella parte idrofobica della tasca del sito attivo, dove il ciclo forma interazioni di Van der Waals con le catene laterali di Leu 204, Pro 202, Leu 198 e Val 135 (Fig. 5-7). L’ossigeno carbonilico del PFMZ forma un forte legame a idrogeno con l’azoto ammidico della Gln 92 (di 2.9 Å), una interazione evidenziata anche dall’addotto acetazolamide- hCA. Oltre alla Gln 92, altri due residui situati nella metà idrofilica del sito attivo della CA, e cioè Glu 69 e Asn 67, formano legami di Van der Waals con la molecola di PFMZ

complessata all’hCA II. Ma le interazioni più importanti evidenziate in questo complesso riguardano la rete di legami a idrogeno che coinvolge l’atomo di azoto esociclico dell’inibitore, due molecole d’acqua (Wat 1194 e Wat 1199) e un atomo di fluoro in meta appartenenti al perfluorobenzoile pendente di PFMZ (Fig. 7). Quindi, è stato evidenziato un forte legame a idrogeno (di 2.9 Å) tra l’azoto imminico del PFMZ e Wat 1194, che a sua volta forma un legame a idrogeno con una seconda molecola d’acqua del sito attivo, Wat 1199 (con distanza di 2.7 Å). Il secondo idrogeno del Wat 1194 partecipa anche in un debole legame a idrogeno (3.3 Å) con l’ossigeno carbonilico del PFMZ. L’altro atomo di idrogeno del Wat 1199 forma un debole legame a idrogeno con l’atomo di fluoro in posizione 3 del perfluorobenzoile del PFMZ (Fig. 7). Infine, un’interazione molto interessante è stata osservata tra l’anello perfluorofenile del PFMZ e il fenile della Phe 131, un residuo critico per il legame di inibitori con lunghe catene con hCA II [2,11]. In realtà, questi due anelli sono quasi perfettamente paralleli, essendo situati ad una distanza di 3.4-4.7 Å. Questo insieme di interazioni non è mai stato osservato negli addotti solfonammide-hCA II. Interazioni simili sono state osservate anche negli inibitori della CA di tipo sulfamato (EMATO o topiramato) o sulfammidici (Fig. 6 e 7) [15,16].

Quattro tipi di solfonammidi CA I sono state sviluppate e usate clinicamente principalmente come farmaci antiglaucoma, per lungo tempo: acetazolamide, metazolamide, etossizolamide e diclorofenamide [11]. Come visto dai dati della Tabella 2, i composti riportati inibiscono fortemente la maggior parte degli isoenzimi CA (come CA I, CA II, CA IV, CA V, CA VII, CA IX e CA XII-XIV), con affinità, per molti di essi, nel range del basso nanomolare.

Recentemente, due nuovi farmaci sono stati introdotti nella pratica clinica, come solfonammide CAI per uso topico, come la dorzolamide e la brinzolamide che agiscono anche come inibitori molto potenti della maggior parte degli isoenzimi α-CA (Tabella 2).

Tabella 2.

Isozima Ki (nM) Composto

CA I CA II CA

III CA IV CA VA CA VB CA VI CA VII CA IX CA XII CA XIII CA XIV acetazolamide 250 12 3.10 74 63 54 11 2.5 25 5.7 17 41 metazolamide 50 14 1.10 6200 65 62 10 2.1 27 3.4 19 43 etossizolamide 25 8 5000 93 25 19 43 0.8 34 22 nt 25 diclorofenamide 1200 38 nt 15000 630 21 79 26 50 50 23 345 dorzolamide 50000 9 8000 8500 42 33 10 3.5 52 3.5 18 27 brinzolamide 45000 3 nt nt 50 30 0.9 2.8 37 3.0 nt 24 topiramato 250 10 nt 4900 63 30 45 0.9 58 3.8 47 1460 topiramato sulfamide 3450 2135 nt 941 32 21 nt 35 4580 1875 30 25

2.2. β-CAs.

Molti eubatteri, qualche archea (come Methanobacterium thermoautotrophicum), alghe e cloroplasti di piante superiori contengono CAs appartenenti alla classe β [17,18]. Le principali differenze tra questi enzimi e le α-CAs viste prima consistono nel fatto che di solito le β-CAs sono oligomeri, generalmente formati da 2-6 monomeri di peso molecolare di 25-30 kDa.

Attualmente sono disponibili le strutture a raggi X di quattro β-CAs: • l’enzima isolato dall’alga rossa Porphyridium purpureum; • l’enzima isolato dai cloroplasti di Pisum sativum;

• un altro enzima procariota, questa volta isolato dall’Escherichia coli; • “cab”, un enzima isolato dall’archea Methanobacterium

thermoautotrophicum.

Il monomero della CA di Porphyridium purpureum è composto da due strutture interne ripetute, avvolte come un paio di motivi fondamentalmente equivalenti costituiti da un dominio α/β e da tre α-eliche sporgenti. Il motivo è molto diverso da quello delle α-CAs o γ-CAs. Questa CA omodimerica appare come un tetramero con una pseudo simmetria 2-2-2 [19]. Le β-CAs sono così molto diverse dagli enzimi della classe α. Lo ione Zn(II) è essenziale per la catalisi in entrambe le famiglie di enzimi, ma la sua coordinazione è diversa e piuttosto variabile per le β-CAs: così, lo ione Zn(II) nelle β-CAs dei procarioti è coordinato con due residui di cisteina, con l’imidazolo del residuo di His e con un gruppo carbossilato appartenente ad un residuo di Asp (Fig. 8A), mentre l’enzima dei cloroplasti ha lo ione Zn(II) coordinato con due residui di cisteina, l’imidazolo appartenente al residuo di His, ed una molecola d’acqua (Fig. 8B) [19]. Il ripiegamento della

catena polipeptidica e l’architettura del sito attivo sono ovviamente molto diversi da quelli delle CAs appartenenti alla classe α.

Figura 8.

Dal momento che per qualche membro di β-CAs l’acqua non è direttamente coordinata con lo Zn(II) (Fig. 8A), il problema principale è se il meccanismo dello zinco-idrossido proposto per l’α-CAs sia valido anche per gli enzimi appartenenti alla famiglia β. Una risposta a questa domanda è stata data da Mitsuhashi et al [19] che ha proposto il meccanismo catalitico mostrato in Fig. 9.

Figura 9.

Dal momento che ci sono due motivi strutturali simmetrici nel monomero dell’enzima di Porphyridium Purpureum, risultanti da due omologhi ripetuti che sono legati tra loro da uno pseudo-asse ripiegato due volte, ci sono due ioni Zn(II) coordinati con i quattro amminoacidi citati prima. In questo caso queste coppie sono: Cys 149/Cys 403, His 205/His 459, Cys 208/Cys 462, e Asp 151/ Asp 405 [19].

È presente anche una molecola d’acqua nell’intorno di ciascun ione metallico, ma non è direttamente coordinato con esso, formando un legame a idrogeno con un ossigeno che collega lo zinco con l’Asp 151/Asp 405 (Fig. 9A).

E’ stato ipotizzato che può realizzarsi una reazione di trasferimento di un protone da questa molecola d’acqua al gruppo carbossilato del residuo di aspartato, formando uno ione idrossido che potrebbe poi coordinarsi allo Zn(II) il quale acquista una geometria trigonale-bipiramidale (Fig. 9B). Si forma così un forte nucleofilo che può attaccare la CO2 legata all’interno di una tasca idrofobica

dell’enzima (Fig. 9C), con formazione di bicarbonato legato allo Zn(II) (Fig. 9D). Questo intermedio è piuttosto simile all’intermedio della reazione proposta per il ciclo catalitico dell’α-CA (Fig. 3C), tranne che per la classe degli enzimi β, il residuo dell’acido aspartico originariamente coordinato allo zinco sembra partecipare al legame a idrogeno con il bicarbonato coordinato (Fig. 9D).

Nell’ultimo passaggio, il bicarbonato coordinato è rilasciato in soluzione, insieme ad un protone (non sono disponibili i dettagli riguardanti il processo di trasferimento del protone), l’aspartato formato ri-coordina lo ione Zn(II), e la relativa molecola d’acqua forma un legame a idrogeno con esso. L’enzima è così pronto per un altro ciclo di catalisi.

È stata riportata anche la struttura della β-CA delle piante dicotiledoni Pisum

sativum con risoluzione di 1.93 Å [20]. La molecola si assembla come un

ottamero con un nuovo dimero di dimeri riarrangiati. Il sito attivo è localizzato all’interfaccia tra due monomeri, con la Cys160, l’His220 e la Cys223 che legano lo ione zinco catalitico ed i residui di Asp162 (orientati da l’Arg164), la Gly224, la Gln151, la Val184, la Phe179 e la Tyr205 che interagiscono con l’acido acetico. I gruppi che legano il substrato sono uno ad uno corrispondenti con i gruppi funzionali del sito attivo dell’α-CA, con i rispettivi residui che sono strutture speculari. Quindi, nonostante i diversi avvolgimenti, α- e β-CAs hanno siti attivi

molto simili ed è probabile che condividano un meccanismo d’azione comune[20]. Cab esiste come dimero con un avvolgimento della subunità simile a quello osservato nelle β-CAs delle piante. Lo ione zinco del sito attivo è coordinato con i residui degli amminoacidi Cys32, His87, e Cys90, con coordinazione tetraedrica con una molecola d’acqua [21]. La maggiore differenza tra la β-CAs presente nelle piante e nel Cab è nell’organizzazione della tasca idrofobica (eccetto per la coordinazione dello zinco citata sopra). La struttura ha anche rivelato una molecola tampone Hepes legata ad una distanza di 8 Ǻ dal sito attivo dello zinco, che suggerisce un possibile trasferimento di protone dal sito attivo al solvente [21].

2.3. γ-

CAs

Il prototipo della CAs di tipo γ, “Cam” è stato isolato dall’archea metanogenica

Methanosarcina thermophila [22]. Le strutture cristalline del Cam contenente lo

zinco e quelle sostituite dal cobalto sono state descritte in forma libera e co-cristallizzata con solfato o bicarbonato [22].

Cam ha diverse caratteristiche che lo differenzia dall’α- e β-CAs. Così, la proteina avvolta è composta da una β-elica sinistrorsa interrotta da tre anse sporgenti e seguita da α-eliche corte e lunghe. Il monomero Cam si autoassembla in un omotrimero con un peso molecolare approssimativo di 70 KDa [22].

Lo ione Zn(II) all’interno del sito attivo è coordinato con tre residui di istidina, come nell’ α-CAs, ma rispetto alla geometria di coordinazione tetraedrica vista nel sito attivo dell’α-CAs, il sito attivo della γ-CA contiene acqua come ligando supplementare del metallo, così complessivamente la geometria di coordinazione

è trigonale bipiramidale per il Cam contenente lo Zinco e ottaedrica per l’enzima sostituito con il cobalto. Due dei residui di His che coordinano lo ione metallico appartengono ad un monomero (monomero A) mentre il terzo appartiene al monomero adiacente (monomero B). Così, i tre siti attivi sono localizzati all’interfaccia tra le coppie dei monomeri [22].

È stato proposto che il meccanismo catalitico della γ-CA è simile a quello presentato per gli enzimi della classe α. Tuttavia, la scoperta che lo Zn(II) non è tetracoordinato come riportato originariamente ma pentacoordinato [22], con due molecole d’acqua legate allo ione metallico, dimostra che c’è ancora tanto da comprendere su questi enzimi. Al momento, il meccanismo dello zinco idrossido è accettato come valido per la γ-CAs, come è probabile che esista un equilibrio tra la specie trigonale bipiramidale e la specie tetraedrica dello ione metallico appartenente al sito attivo dell’enzima. I ligandi legati al sito attivo hanno mostrato di prendere contatto con la catena laterale della Glu62 tale da suggerire che questa catena laterale sia probabilmente protonata. Nel Cam contenente lo zinco non complessato, la catena laterale della Glu62 e Glu84 sembrano condividere un protone; in più, la Glu84 può trovarsi in conformazioni multiple. Questo suggerisce che la Glu84 può agire come un protone navetta, il che rappresenta un aspetto importante nel meccanismo di reazione dell’α-CAs, per il quale un residuo di istidina del sito attivo generalmente esercita questa funzione, di solito l’His64. Gli anioni e le sulfonammidi, hanno mostrato di legarsi al Cam [23].

2.4. δ-CAs.

L’assorbimento spettroscopico a raggi X dello Zn indica che il sito attivo della CA della diatomea marina Thalassiosira weissflogii(TWCA1) è

sorprendentemente simile a quello dell’α-CAs dei mammiferi.

Lo zinco ha come ligandi tre istidine e una singola molecola d’acqua, il che è completamente differente dal β-CAs di piante superiori nelle quali lo zinco è coordinato con i tiolati di due cisteine, una istidina, e una molecola d’acqua [24]. L’anidrasi carbonica delle diatomee non mostra una significante somiglianza nella sequenza con altre anidrasi carboniche e può rappresentare un esempio di evoluzione convergente a livello molecolare.

Nella stessa diatomea è stata fatta una scoperta piuttosto eclatante: il primo enzima contenente cadmio, che è una proteina tipo CA. La diatomea marina

Thalassiosira weissflogii cresce in condizioni di zinco basso, tipico dell’ambiente

marino, e in presenza di sali di cadmio, porta a più alti livelli di attività cellulare di CA, sebbene i livelli di TWCA1, la maggiore isoforma intracellulare richiedente lo Zn nella CA in T. weissflogii, rimanga bassa [25].

Il 109Cd migra insieme ad un gruppo di proteine dimostrando che questa attività della CA sia diversa da quella del TWCA1 sull’originario lisato di cellule radiomarcate di T. weissflogii.

I livelli della proteina con Cd erano modulati dalla CO2 in un modo che ha

mostrato di essere compatibile con il ruolo di questo enzima nell’acquisizione di carbonio.

La purificazione della frazione attiva della CA porta all’isolamento di una proteina contenente Cd di 43 kDa, in cui è chiaro che T. weissflogii mostra una

CA specifica per il Cd, il quale, particolarmente sotto condizioni di basso Zn, può sostituire lo Zn enzima nel TWCA1 con il suo il meccanismo concentrato sul carbonio [25].

3. DISTRIBUZIONE DELLE CAs [1].

E’ stato dimostrato che le CAs sono presenti in moltissimi procarioti, dove questi enzimi esercitano importanti funzioni come la respirazione, il trasporto di anidride carbonica e la fotosintesi [2,3]. La possibilità di sviluppare degli inibitori della CA, antibiotici/antifungini, che inibiscono le CAs di batteri e funghi presenti nelle specie patogene, ha recentemente suscitato molto interesse [26,27]. Così, il gruppo di Muhlschlegel [26] ha utilizzato l’ascomicete Candida albicans (il più comune fungo patogeno in pazienti immunocompromessi) per la sua abilità a cambiare morfologia, da lievito a forma filamentosa, in risposta all’attacco di un ospite. La filamentazione di questo fungo è mediata da secondi messaggeri come l’adenosina mono fosfato 3',5'-ciclica (cAMP) sintetizzata dall’adenilato ciclasi. Il basidiomicete Cryptococcus neoformans è un ospite incapsulato che infetta principalmente il sistema nervoso centrale nei pazienti immunocompromessi [26]. Simile al cambio morfologico in C. albicans, la biosintesi della capsula in C.

neoformans, ha mostrato d’essere dipendente dall’attività dell’adenilato ciclasi.

Il gruppo di Muhlschlegel [26] ha dimostrato che la concentrazione fisiologica di CO2/ bicarbonato ( la cui formazione è dovuta alla reazione catalizzata dalle CAs

direttamente l’attività dell’adenilato ciclasi. Inoltre, l’equilibrio CO2/ bicarbonato

in queste CAs (appartenenti alla famiglia β-CA) è essenziale per la patogenesi di

C. albicans in nicchie dove la disponibilità di CO2 è limitata. E’ stato anche

dimostrato che l’adenilato ciclasi di C. neoformans è sensibile alle concentrazioni fisiologiche di CO2/ bicarbonato. Tali dati sono stati dimostrati usando inibitori

della CA. Tuttavia, il collegamento tra il segnale del cAMP e la sensibilità alla CO2/ bicarbonato è conservato nei funghi e la sensibilità alla CO2 si è rivelata

essere un importante mediatore della patogenesi fungina.

Nuovi agenti terapeutici, basati sulla inibizione di CAs presenti in questi patogeni potrebbero bersagliare tali meccanismi a vari livelli, allo scopo di controllare le infezioni fungine [26]. Helicobacter pilori è un batterio Gram-negativo scoperto all’inizio degli anni ’80; esso ha dimostrato di essere associato con le gastriti croniche, con le ulcere peptiche e più recentemente con il tumore gastrico, il secondo tumore umano più comune [27].

Il gruppo di Nishimori ha clonato e sequenziato l’anidrasi carbonica della classe α dell’ Helicobacter pilori ( hpCA) da pazienti con diverse lesioni della mucosa gastrica, incluse gastriti, ulcere e tumori [27]. Sebbene vari polimorfismi siano stati identificati di recente come 12Ala, 13Thr, 16Ile e 168Phe, non ci sono significanti rilevanze di qualche polimorfismo con lesioni della mucosa gastrica. Un recente lavoro Krungkrai et al. [28], sulle CAs parassitarie che ha scoperto la presenza di almeno due differenti α-CAs nel Plasmodium falciparum, uno dei protozoi che provoca la malaria, apre la strada allo sviluppo di agenti farmacologici basati sugli inibitori della CA. I globuli rossi infettati dal

rispetto a quella dei normali globuli rossi sani. L’enzima è stato poi purificato in modo omogeneo, mostrando un Mr di 32 KDa, ed è risultato attivo in forma

monomerica. L’attività dell’enzima parassitario è sensibile a noti inibitori della CA-solfonammide come la sulfanilammide e l’acetazolamide [28]. Una serie di solfonammidi aromatiche, la maggior parte dei quali sono basi di Schiff’s derivate dalla sulfanilammide/ omosulfanilammide/ 4-amminoetilbenzenesolfonammide e aldeidi aromatiche sostituite, o ureico-sostituite come le solfonammidi, sono state impiegate per l’inibizione in vitro dell’enzima parassitario della malaria (pfCA) e la crescita del P. falciparum.

Nelle piante superiori, nelle alghe e nei cianobatteri, sono presenti tutti i membri delle 3 famiglie di CA. Per esempio, l’analisi del genoma di Arabidopsis hanno rivelato che almeno 14 differenti CAs sono presenti in questa pianta, mentre nell’alga verde unicellulare Chlamydomonas reinhardtii, sono presenti sei enzimi. Nell’alga, le CAs sono state trovate nei mitocondri, nel cloroplasto nel citoplasma e nello spazio periplasmico [29].

Nelle dicotiledoni C3 sono state isolate due tipi di CAs, una nello stroma dei

cloroplasti e l’altra nel citoplasma, mentre nelle piante C4 questi enzimi sono

presenti nelle cellule mesofite, dove forniscono bicarbonato alla fosfoenolpiruvato (PEP) carbossilasi, il primo enzima coinvolto nel fissaggio della CO2 negli acidi

C4 [29].

Nelle piante CAM (crassulacean acid metabolism) le CAs sono molto abbondanti, essendo probabilmente presenti nel citosol, e molto abbondanti nei cloroplasti, dove partecipano nel fissaggio della CO2, fornendo bicarbonato alla

terrestre e sembrano essere correlati con il contenuto atmosferico di CO2, e quindi

con i processi di riscaldamento globale.

Negli animali, e più specificamente nei mammiferi, le CAs sono molto diffuse, come descritto in letteratura [30].

4. FUNZIONI FISIOLOGICHE DELLE CAs E LORO INIBIZIONE [1].

Non è chiaro se altre reazioni catalizzate dalle CAs (Fig. 1) oltre all’idratazione della CO2 / la disidratazione del bicarbonato siano fisiologicamente rilevanti [2].

Così, attualmente, solo la reazione 1.1 è considerata essere fisiologicamente la più importante in cui questi enzimi sono coinvolti.

Nei procarioti, come già visto, le CAs svolgono due funzioni generali:

1. _{il trasporto della CO}2 / bicarbonato tra i diversi tessuti dell’organismo;

2. il rifornimento della CO2 / bicarbonato nelle reazioni enzimatiche [17].

Negli organismi fotosintetici acquatici, un ruolo aggiuntivo è quello del meccanismo di concentrazione della CO2, il quale aiuta a superare la scarsa

presenza di CO2 circostante [29,31]. Per esempio, nella Chlamydomonas

reinhardtii questo meccanismo di concentrazione della CO2 è mantenuto dal

gradiente del pH creato attraverso le membrane tilacoidi dei cloroplasti dal fotosistema II- mediato dai processi di trasporto degli elettroni [31].

Un gran numero di procarioti non fotosintetici catalizzano reazioni in cui la CA potrebbe essere coinvolta nel rifornimento della CO2 / bicarbonato nelle vicinanze

del sito attivo, o nel rimuovere qualche composto allo scopo di migliorare l’energetica della reazione [17].

Un vasto numero di processi di carbossilazione/ decarbossilazione nei quali le CAs dei procarioti possono giocare un importante ruolo fisiologico è stato recentemente pubblicato da Smith e Ferry [17].

Nei vertebrati, incluso l’ Homo sapiens, le funzioni fisiologiche delle CAs sono state ampiamente studiate negli ultimi anni ‘70 [11, 24, 32]. Così, gli isoenzimi I, II e IV sono coinvolti nella respirazione e regolazione dell’omeostasi acido/base [11]. Questi complessi processi coinvolgono sia il trasporto di CO2 / bicarbonato

tra i tessuti di metabolizzazione e i siti di escrezione (polmoni, reni), facilitano l’eliminazione della CO2 dai capillari e dal microcircolo polmonare,

l’eliminazione degli ioni H+ dai tubuli renali e dai dotti collettori, come anche facilitano il riassorbimento del bicarbonato nell’orletto a spazzola e nell’ansa renale ascendente di Henle [11]. Di solito, gli isoenzimi I, II e IV sono coinvolti in tali processi.

Con la produzione di umor acqueo ricco di bicarbonato (mediato dagli isoenzimi ciliari CA II, CA IV e CA XII) all’interno dell’occhio, le CAs sono coinvolte nella visione, ed il loro malfunzionamento porta ad una elevata pressione intraoculare, e al glaucoma [11].

La CA II è anche coinvolta nello sviluppo e nel funzionamento delle ossa, come la differenziazione degli osteoclasti, o il rifornimento di acido per il riassorbimento osseo negli osteoclasti.

Le CAs sono coinvolte nella secrezione degli elettroliti in molti altri tessuti/organi, come: la formazione del CSF, fornendo bicarbonato e regolando il

pH nei plessi corioidei; la produzione di saliva nelle cellule degli acini e dei dotti; la produzione di acido gastrico nelle cellule parietali dello stomaco; la produzione della bile, la produzione del succo pancreatico, il trasporto di ioni intestinali [11,30]. Le CAs sono anche coinvolte nel gusto e nell’olfatto, nella protezione del tratto gastro-intestinale da condizioni di pH estremo (troppo acido o troppo basico), nella regolazione del pH e nella concentrazione del bicarbonato nel fluido seminale, nelle funzioni muscolari e nell’adattamento a stress cellulare.

Alcuni isoenzimi, come CA V sono coinvolti nei processi molecolari, come quello di escrezione di insulina nelle cellule β del pancreas [11,30].

Gli isoenzimi II e VA sono coinvolti in importanti processi metabolici, infatti forniscono bicarbonato per la gluconeogenesi, la biosintesi di acidi grassi ex novo o la sintesi di basi pirimidiniche [11]. Infine, alcuni isoenzimi (come CA IX, CA XII, CARP VIII) sono molto abbondanti in tumori, essendo coinvolti nell’oncogenesi e nello sviluppo dei tumori [32, 33].

Sebbene le funzioni fisiologiche di qualche isoenzima di mammifero (CAI, CAIII, CARP) non siano ancora chiare, da quanto detto finora si comprende l’importanza delle CAs per una moltitudine di processi fisiologici, sia allo stato normale che patologico. Questo può spiegare perché gli inibitori di questi enzimi abbiano trovato un posto nella medicina clinica già nel 1954, con l’acetazolamide (1) il primo agente diuretico non-mercuriale usato clinicamente [11].

Attualmente, gli inibitori di questi enzimi sono ampiamente usati clinicamente come agenti antiglaucoma, diuretici, antiepilettici, nella cura del mal di montagna, nelle ulcere gastriche e duodenali, nei disordini neurologici, o nell’osteoporosi [2,11].

Lo sviluppo di agenti più specifici è strettamente necessario, a causa dell’alto numero di isoenzimi presenti nel corpo umano, così come l’isolamento di un gran numero di nuove forme di CAs in tutto il regno degli organismi viventi. Questo è possibile solo comprendendo in dettaglio i meccanismi catalitici e di inibizione di questi enzimi.

Infatti, ora molte ricerche sono rivolte su almeno cinque fronti nella progettazione di agenti farmacologici appartenenti a questa classe:

• farmaci antiglaucoma con migliori profili rispetto alla dorzolamide e alla brinzolamide [11]. I bersagli degli isoenzimi di alcuni composti sono probabilmente CA II e XII [11];

• farmaci antitumorali diretti principalmente alla CA IX e CA XII, gli isoenzimi predominanti presenti nelle cellule tumorali [32, 33];

• agenti antiobesità, simili ai forti inibitori della CA topiramato [34] e zonisamide [35], i quali probabilmente bersagliano le isoforme mitocondriali CA VA e/o CA VB;

• anticonvulsivanti (che probabilmente bersagliano le CA II, VII, XII e XIV);

• e antibatterici, antifungini e altri tipi di agenti che bersagliano varie CAs di organismi patogeni come il batterio Helicobacter pilori, Mycobacterium

tuberculosis, ecc., il protozoo Plasmodium falciparum o il fungo Candida albicans, e Cryptococcus neoformans [23,31].

In conclusione tali enzimi e la loro inibizione rappresentano una scoperta straordinaria: dopo molti anni di intensa ricerca in questo campo, continuano ad

offrire opportunità di interesse per lo sviluppo di nuovi farmaci, nuovi strumenti diagnostici, o per capire approfonditamente i processi fondamentali della vita. La scoperta di molti CAs in vari organismi di tutto l’albero filogenetico è anche un chiaro segnale che questi vecchi enzimi sono coinvolti nei processi vitali critici e che la perturbazione della loro attività può portare a nuove strade per il controllo di malattie molto diffuse.

5. INIBITORI DELL’ANIDRASI CARBONICA [36,37].

Gli inibitori della Anidrasi Carbonica (CAI) comprendono i classici inibitori acetazolamide (1), metazolamide (2), etossizolamide (3), sulthiame (4) e diclorofenamide (5). Gli CAI comprendono anche farmaci più recenti/agenti studiati come la dorzolamide (6), la brinzolamide (7), l’indisulam (8), il topiramato (9), la zonisamide (10), la sulpiride (11), il coumato (12), l’emato (13), il celecoxib (14), il valdecoxib (15) e la saccarina (16) (Fig. 10; tabella 3).

I derivati 17 e 18 sono agenti studiati per bersagliare i tumori associati all’isoforma CA IX. Molti di questi composti sono stati sviluppati anni fa durante la ricerca di diuretici, tra i quali le tiazidi, i composti 19a-e, come anche i derivati 20-25 sono ancora ampiamente usati clinicamente [2, 11] (Fig. 10).

Tuttavia, qualcuno di questi inibitori potrebbe essere usato per il trattamento sistemico del glaucoma, ed ancora più recentemente, sono stati scoperti derivati più nuovi che sono potenziali agenti antiglaucoma per uso topico, come anche antitumorali, anti-obesità o farmaci anti-infettivi [38-42].

Gli effetti inibitori di alcuni di questi farmaci usati clinicamente verso le isoforme presenti nei mammiferi CA I-XIV, di origine umana o di topo, sono mostrate in Tabella 3.

Tabella 3.

Dal momento che specifici isoenzimi sono responsabili di differenti risposte biologiche, il loro diverso profilo di inibizione può spiegare le reali applicazioni

cliniche delle CAI, che vanno da farmaci diuretici e antiglaucoma, a farmaci antitumorali, anti-obesità e anti-epilettici.

Tuttavia, un problema cruciale nella progettazione degli CAI è relativo all’elevato numero di isoforme, la loro diffusa localizzazione in molti tessuti e organi (Tabella 4), e la mancanza di selettività degli inibitori attualmente disponibili nei confronti dell’isoenzima.

Tabella 4.

Le condizioni riducenti presenti nei tumori ipossici, in combinazione con la presenza della proteina ridotta tioredoxina 1, media la riduzione del legame

disolfuro con formazione di tioli [42]. I composti ridotti (tioli) sono meno ingombranti e mostrano un’eccellente attività inibitoria delle CA (nel range del basso nanomolare) rispetto ai disolfuri corrispondenti, i quali hanno difficoltà ad entrare nello spazio limitato del sito attivo dell’enzima [42].

I classici inibitori della CA (CAIs) sono le solfonammidi primarie, RSO2NH2 che

vengono utilizzate clinicamente da più di 50 anni come diuretici e farmaci antiglaucoma per uso sistemico. Infatti ci sono circa 30 farmaci usati clinicamente (o farmaci in via di sviluppo) che appartengono alla classe delle solfonammidi o sulfamato, 1-25, che hanno mostrato una significativa attività inibitoria della CA. Oltre al ruolo definito per questi CAIs come agenti diuretici e antiglaucoma, è emerso recentemente che hanno un potenziale come farmaci anticonvulsivanti, antiobesità, antitumorali, antipanico, e antinfettivi [43,44]. Tuttavia, i punti critici per la progettazione di CAIs come agenti terapeutici riguardano l’elevato numero di isoforme negli umani (16 CAs, di cui 13 hanno attività catalitica), la loro piuttosto diffusa localizzazione in molti tessuti/organi, e la mancanza di selettività dell’isoenzima negli inibitori solfonammidici/sulfamati attualmente disponibili [43,44]. Infatti, tra i derivati 1-25, non ci sono composti che inibiscono selettivamente qualche isoforma di CA con valori terapeutici, sebbene il loro profilo di inibizione dei 13 isoenzimi di mammiferi sono molto variabili e possono essere usati per la progettazione di scaffold di farmaci di nuova generazione, inibitori isoforma-selettivi.

Infatti, ultimamente sono stati fatti notevoli progressi in questo campo.

La tiazide ed i diuretici high-ceiling come la triclorometiazide 19d, il clortalidone 22 l’indapamide 23, e la furosemide 24, sono stati scoperti negli anni 60-70,

quando si sapeva ben poco sui vari isoenzimi della CA, e si pensava che questi farmaci non interagissero sostanzialmente con le CAs dei mammiferi.

19d: R2 _{= H; R}3 _{= CHCl}

2; R6 = Cl

Recentemente è stata rivista la loro interazione con le 13 CAs cataliticamente attive di mammiferi ed è stata riportata la struttura cristallografica a raggi X dei loro addotti con l’hCA II [45]. Queste solfonammidi strutturalmente correlate hanno mostrato un diverso funzionamento verso il diffusissimo isoenzima CA II, con il clortalidone, la triclorometiazide, e la furosemide che sono inibitori efficaci della CA II (KIs di 65-138 nM), mentre l’indapamide era quella più debole (KI di

2520 nM).

Inoltre, qualcuno di questi diuretici era un inibitore abbastanza efficace (basso nanomolare) di altre isoforme, per esempio, il clortalidone contro l’hCA VB, VII, IX, e il XIII; l’indapamide delle CA VII, IX, XII, e XIII, la triclorometiazide delle CA VII e IX, e la furosemide delle CA I e XIV [45]. Esaminando le quattro strutture cristalline a raggi X dei loro addotti con l’hCA II (Figura 11), osserviamo diversi siti attivi delle molecole d’acqua che interagiscono con lo scaffold del

clortalidone, della triclorometiazide, e della furosemide i quali sono responsabili di questa importante differenza di attività, in aggiunta al frammento della benzensolfonammide di queste molecole che si legano al sito attivo dell’enzima attraverso la formazione di un legame di coordinazione, nella forma deprotonata, allo ione Zn (II) [44].

Figura 11.

Invece, il legame dell’indapamide 23 con la CA II non mostra interazioni con il sito attivo delle molecole d’acqua. Il legame del clortalidone 22 all’interno del

sito attivo della CA II avviene nella forma tautomera enolica, con l’OH enolico che partecipa con due forti legami a idrogeno con l’Asn67 e una molecola d’acqua. Le recenti evidenze sui modi di legame di questi diuretici possono essere così utilizzati per progettare più efficaci inibitori della CA II così come composti con selettività/affinità per varie isoforme con possibili applicazioni nella chimica farmaceutica.

5.1. DIURETICI INIBITORI DELL’ANIDRASI CARBONICA

Le CAs sono molto abbondanti nei reni e le isoforme presenti in questo organo giocano un ruolo cruciale in almeno tre processi fisiologici: il bilancio omeostatico acido-base (con la secrezione e l’escrezione di protoni, dovuta alla reazione di idratazione della CO2 catalizzata da questi enzimi); il processo di

riassorbimento del bicarbonato; e l’escrezione di NH4+ . L’acetazolamide (1) è

stato il primo diuretico non-mercuriale ad essere usato clinicamente nel 1956 [11]. Tale composto rappresenta il prototipo di una classe di agenti farmacologici con un uso terapeutico relativamente limitato, ma che ha giocato un importante ruolo nello sviluppo delle basi della fisiologia e farmacologia renale, e nella progettazione della maggior parte degli agenti diuretici attualmente usati, come la tiazide e i diuretici high-ceiling. Continuando la somministrazione di CAI come l’acetazolamide, il volume delle urine aumenta e diventa alcalino. Il bicarbonato aumentato viene eliminato con le urine, insieme al Na+ e al K+ mentre la quantità di cloruro escreto diminuisce. Questa sequenza di eventi è dovuta all’inibizione di CA nel tubulo prossimale, la quale porta all’inibizione della secrezione di H+ da questo segmento del nefrone. L’inibizione degli enzimi citosolici (CA II) e di

membrana (CA IV, XII e CA XIV) sembra essere coinvolta negli effetti diuretici delle solfonammidi. Il risultato finale di questi processi è il trasporto del bicarbonato di sodio dal lume tubulare allo spazio interstiziale, seguito dal movimento dell’acqua (per mantenere l’isotonia), portando ad un aumento della diuresi.

L’acetazolamide, la metazolamide (2), l’etossizolamide (3) e la diclorofenamide (5) sono usati per trattare l’edema causato dall’ insufficienza cardiaca e da farmaci che inducono edema.

Molti altri diuretici, come le benzotiadiazine (19a-e; per esempio, la clorotiazide e l’idroclorotiazide) ; quinetazone (20); metolazone (21); clortalidone (22); indapamide (23); furosemide (24); e bumetanide (25) agiscono come inibitori della CA con differente efficacia (Figura 10). Ci si può aspettare questo dal momento che molti di essi hanno solfonammidi primarie non sostituite come gruppi che legano lo zinco [46].

5.2. INIBITORI DELL’ANIDRASI CARBONICA QUALI FARMACI PER DISTURBI OCULARI.

Il glaucoma è una malattia cronica e degenerativa degli occhi, caratterizzata da un'alta pressione oculare (IOP) che causa danni irreversibili al nervo ottico, provocando una perdita progressiva della vista ed eventualmente cecità [47-49]. Studi sulla chimica e dinamica dell’umore acqueo hanno identificato che il principale costituente di questa secrezione è rappresentato dal bicarbonato di sodio.

Le CAs sono state identificate nell’uvea anteriore dell’occhio dove hanno mostrato essere responsabili della secrezione di bicarbonato. I CAIs rappresentano il trattamento fisiologico principale per il glaucoma, inibendo l’enzima del processo ciliare, l’isoenzima CA II solfonammido sensibile (Tabella 3),la secrezione di bicarbonato e di umore acqueo viene ridotta, causando il 25-30% di riduzione della IOP [47]. In realtà, l’acetazolamide (1) per via sistemica, la

metazolamide (2), l’etossizolamide (3) o la diclorofenamide (4) sono ampiamente usati per trattare questo disturbo.

Il farmaco più studiato è l’acetazolamide (1, il cui nome commerciale è Diamox) la quale viene spesso somministrata per lunghi periodi in quanto riduce notevolmente la IOP, possedendo tossicità minima e proprietà farmacocinetiche ideali. Tuttavia, siccome le CAs sono espresse in maniera ubiquitaria nei vertebrati, la somministrazione sistemica delle solfonammidi porta all’inibizione non specifica delle CA presenti nei processi ciliari degli occhi (per esempio la CA II, IV, e XII) ed è associato ad effetti indesiderati, come torpore e formicolio delle estremità, sapore metallico, depressione, fatica, malessere, perdita di peso, diminuzione della libido, irritazione gastrointestinale, acidosi metabolica, calcoli renali e miopia transitoria.

Lo sviluppo di solfonammidi solubili in acqua quali CAIs da usare in gocce oculari iniziò nel 1990, e dal 1995 il primo agente farmacologico, la dorzolamide (6), è stato lanciato dalla Merck con il nome commerciale di Trusopt® [6]. Un secondo composto strutturalmente simile, la brinzolamide (7), è stata anche

approvata (dalla Alcon con il nome commerciale di Azopt®) [6] per il trattamento topico del glaucoma insieme a β-bloccanti come il timololo (Timoptol®), e ad analoghi della PGF2α [50], al latanoprost (Xalatan®), e al travoprost (Travatan®).

La dorzolamide e la brinzolamide sono potenti CAIs solubili in acqua che sono sufficientemente liposolubili per penetrare la cornea, e possono essere somministrati per via topica come idrocloride salificata (ad un pH di 5.5) o come una base libera, rispettivamente. I due farmaci sono efficaci nel ridurre la IOP e mostrano minori effetti collaterali rispetto ai farmaci utilizzati per via sistemica. Gli effetti collaterali osservati includono dolore, bruciore e arrossamento degli occhi, visione sfuocata e prurito, i quali sono probabilmente dovuti al pH acido della soluzione oculare di dorzolamide. E’ stato anche sperimentato un sapore amaro con entrambi i farmaci CAIs sia per uso sistemico che per uso topico, il quale è probabilmente dovuto all’accumulo di farmaco a livello oculare che defluisce nell’orofaringe e che inibisce le CAs presenti nella saliva (CA VI) e nelle papille gustative (CA II e CA VI) con il conseguente accumulo di bicarbonato.

Questi composti vengono ampiamente usati per controllare il flusso di umore acqueo e la pressione intraoculare (IOP) nei pazienti con glaucoma [51].

Perciò, nuovi efficaci CAIs topici quali possibili agenti antiglaucoma sono ancora in fase di studio [49]. Un recente approccio ha coinvolto l’attacco di funzioni che rendono solubili in acqua e di sistemi ad anello da attaccare alle solfonammidi aromatiche o eterocicliche per ottenere composti due o tre volte più efficaci rispetto la dorzolamide nell’abbassare la IOP nei conigli.

Questi composti erano solubili in acqua (come idrocloridi, triflati o trifluoroacetati), potenti inibitori della CA II umana, che penetravano la cornea e riducevano significativamente la IOP sia in conigli normotesi che in quelli affetti da glaucoma [49].

Recentemente [51] è stato proposto un altro approccio per ottenere CAIs antiglaucoma che incorporano lo scheletro della dorzolamide 6 sulla quale sono stati inseriti esteri nitrici, portando a composti del tipo 26.

Alcuni di questi hanno mostrato una elevata potenza ed efficacia NO-mediata come provato dal loro effetto rilasciante vascolare sull’anello aortico dei conigli pre-contratto da metoxamina ed hanno esercitato un forte abbassamento della IOP

in vivo nei conigli normotesi, anticipando in tal modo il loro potenziale per il

L’uso delle CAIs nel trattamento dell’edema maculare è basato sull’osservazione che l’acetazolamide (sale sodico) somministrata per via sistemica è efficace nel trattamento di questa condizione. Un’efficacia simile è stata osservata anche con la somministrazione topica della dorzolamide e della brinzolamide [48].

Viene generalmente assunto che la scomparsa dell’edema ed il miglioramento della vista sono indipendenti dall’attività ipotensiva della solfonammide, dovuta agli effetti diretti sulla circolazione nella retina. L’acetazolamide, la dorzolamide o la brinzolamide probabilmente agiscono come vasodilatatori locali, migliorando il flusso di sangue in questo organo e di conseguenza pulendo dai prodotti di scarto metabolico. La visione dopo essere stati sottoposti al trattamento (nelle fasi iniziali del disturbo) viene notevolmente migliorata [48].

Gao et al. [52] hanno recentemente dimostrato che l’isoenzima citosolico lento CA I media la permeabilità retinale emorragica e quella vascolare cerebrale attraverso l’attivazione della precallicreina e la generazione di una serina proteasi altamente attiva che è il fattore XIIa.

Questi fenomeni contribuiscono alla patogenesi della retinopatia diabetica proliferativa e dell’edema maculare diabetico, che rappresentano le principali cause della perdita della vista, e per i quali non ci sono trattamenti farmacologici attualmente disponibili. Perciò, come sostenuto dagli autori, l’inibizione della CA I può essere un bersaglio terapeutico per il trattamento di queste condizioni. Infatti, attualmente, sono disponibili potenti inibitori della CA I. Qualcuna delle isoforme associate alla membrana, come la CA IV, IX e la XII, sono anche considerate come i possibili bersagli delle solfonammidi antiglaucoma [53-55]. L’isoenzima bovino CA IV ha mostrato di essere sensibile all’inibizione da parte

di molte solfonammidi e sulfamati, con una KIs nel range del basso nanomolare

[53]. Tuttavia, la corrispondente isoforma umana, CA IV, mostra un diverso funzionamento, con qualche farmaco, come l’acetazolamide, l’etossizolamide e il sultiame, che agiscono come degli efficaci inibitori, mentre altri agenti antiglaucoma, come la metazolamide, la diclorofenamide, la dorzolamide e la brinzolamide, agiscono come deboli inibitori (Tabella 3), il che ci suggerisce che è improbabile che la CA IV sia coinvolta nella secrezione dell’umore acqueo, dato che viene inibito debolmente dalla maggior parte delle solfonammidi antiglaucoma.

Tuttavia, la CA XII (ma non la CA IX) ha recentemente mostrato di essere altamente espressa negli occhi di pazienti con glaucoma, e probabilmente gioca un ruolo importante nell’aumento della IOP caratteristica del disturbo [55].

Successivamente è stato mostrato che la CA XII viene altamente inibita da tutte le solfonammidi antiglaucoma usate clinicamente (Tabella 3), e questa è probabilmente l’isoforma di membrana coinvolta nel glaucoma che viene bersagliato da questi agenti.

5.3. INIBITORI DELL’ANIDRASI CARBONICA QUALI POTENZIALI FARMACI ANTI-OBESITÀ.

Tra le isoforme α-CA trovate negli animali, due degli isoenzimi CA, VA e VB, sono presenti nei mitocondri (Tabella 4). Questi isoenzimi sono coinvolti in differenti processi biosintetici, come l’ureogenesi, la gluconeogenesi e la

lipogenesi, nei vertebrati ( per esempio nei roditori) e negli invertebrati ( per esempio nelle cavallette) [56].

L’approvvigionamento di sufficiente substrato, il bicarbonato, in diversi processi biosintetici che coinvolgono la piruvato carbossilasi (PC), l’acetil-Co-A carbossilasi (ACC) e la carbamoil-fosfato sintetasi I e II, viene assicurato principalmente dalla reazione catalitica che coinvolge gli isoenzimi mitocondriali CA VA e CA VB – probabilmente aiutati dall’elevata attività dell’isoenzima citosolico CA II (Figura 12) [56].

Figura 12.

Diversi studi hanno evidenziato che le CAIs hanno un potenziale come farmaci anti-obesità, che può essere dovuto per i loro effetti sugli isoenzimi CA.

Il topiramato (9) è un farmaco anti-epilettico che possiede potenti effetti anticonvulsivanti per un meccanismo d’azione multifattoriale: il blocco dei canali

al sodio e dei recettori cainato/AMPA (acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolo-propionico), la ritenzione di CO2 secondaria all’inibizione dei globuli

rossi del sangue e degli isoenzimi CA del cervello, come l’aumento del sistema di trasmissione GABA (acido-γ-ammino-butirrico)-ergico [34]. Un effetto collaterale di questo farmaco, osservato in pazienti obesi era la perdita di peso corporeo, anche se nessuna spiegazione farmacologica di tale fenomeno è stata fornita [57]. Inoltre, il topiramato ha mostrato di ridurre le calorie e i grassi acquistati nei ratti obesi e in ratti Zucker. E’ stato recentemente dimostrato che il topiramato è anche un potente inibitore di differenti isoenzimi CA, come la II, VA, VB, VI, VII, XII e XIII (tabella 3), ed è stata determinata la struttura cristallina a raggi X del suo complesso con la CA II umana, rivelando le interazioni molecolari che spiegano l’elevata affinità di questo composto per il sito attivo della CA [34]. Poiché il topiramato agisce anche come un efficace inibitore degli isoenzimi CA VA e VB mitocondriali umani, l’inibizione di entrambi gli isoenzimi CA mitocondriali e citosolici coinvolti nella lipogenesi possono costituire un nuovo approccio per controllare la perdita di peso [56,57].

La zonisamide (10) è un altro farmaco anti-epilettico usato come terapia aggiuntiva per parziali attacchi refrattari. Tale composto ha multipli meccanismi d’azione, e mostra un ampio spettro d’azione nell’attività anticonvulsivante.

Analogamente al topiramato (9), recenti studi clinici hanno dimostrato un potenziale aggiuntivo per l’uso terapeutico nel dolore neuropatico, nei disturbi bipolari, nell’emicrania, nell’obesità, nelle malattie legate al cibo e nel morbo di Parkinson. La zonisamide (10) è una solfonammide alifatica, che inibisce in maniera potente le CAs citosoliche e mitocondriali coinvolte nella lipogenesi (tabella 3). Inoltre, la zonisamide in associazione con una dieta povera di calorie (deficit di 500 Kcal per giorno), ha prodotto, in più, una riduzione del peso medio di 5 Kg confrontato con una sola dieta effettuata da pazienti obese di sesso femminile [58].

Sia il topiramato (9) che la zonisamide (10) determinano una perdita di peso dovuta all’inibizione della lipogenesi, mediata da questi due agenti, che a loro volta è mediata dall’inibizione di alcuni isoenzimi CA coinvolti nella carbossilazione del piruvato ad ossaloacetato (isoforme mitocondriali CA VA e VB) e dell’acetil-coenzima-A a malonil-coenzima-A (isoforma citosolica CA II), come mostrato schematicamente in Figura 12. L’effetto globale è una potente

inibizione della lipogenesi. Attualmente, una combinazione del topiramato 9 (sostenuta forma di rilascio) con la fentermina, Qnexa, è in fase III di sperimentazione clinica per il trattamento dell’obesità, mettendolo in una prima classe di farmaci, con un nuovo meccanismo d’azione.

Quindi, l’inibizione delle isoforme mitocondriali CA VA e VB, probabilmente in associazione con le isoforme citosoliche CA II che sono ubiquitarie, possono rappresentare i bersagli per nuovi farmaci anti-obesità che riducono la lipogenesi inibendo le CA [56].

5.4. INIBITORI DELL’ANIDRASI CARBONICA COME ANTITUMORALI.

Un aspetto importante di molti tumori è l’ipossia [59]. L’inadeguato rifornimento di ossigeno è la principale conseguenza patofisiologica della microcircolazione disturbata sia strutturalmente che funzionalmente e dei processi di diffusione dell’ossigeno deteriorati. L’ipossia nei tumori appare essere fortemente associata con la propagazione del tumore, con la trasformazione in maligno, e con la resistenza alla chemioterapia e alla radioterapia. L’ipossia regola l’espressione di differenti geni, incluso l’isoenzima CA IX, attraverso la cascata del fattore di ipossia inducibile 1 (HIF1). L’espressione della CA IX è fortemente sovra-regolata dall’ipossia e viene sotto-sovra-regolata dalla proteina sopprimitrice di tumori

Figura 13.

L’espressione della CA IX viene fortemente aumentata in molti tipi di tumori, come nel glioma/ependimoma, nel mesotelioma, nel carcinoma papillare/follicolare, nel carcinoma della vescica, della cervice uterina, nel carcinoma naso-faringeo, di testa e collo, del seno, dell’esofago, dei polmoni, del cervello, della vagina, nel carcinoma delle cellule basali/squamose, e tumori renali.

In alcune cellule cancerogene, il gene VHL è mutato portando ad una forte sovra-regolazione della CA IX (fino a 150 ripiegamenti) come conseguenza dell’attivazione dell’HIF costitutiva.

La CA IX appartiene alla famiglia delle α-CAs umane molto attive, dove le sue proprietà catalitiche della reazione di idratazione della CO2 sono paragonabili con

quelle del catalizzatore CA II altamente evoluto, infatti, siccome la struttura a raggi X della CA IX non è ancora disponibile, molti studi hanno usato la struttura

della CA II per il modello e il disegno di inibitori della CA IX. Come per tutte le α-CAs, la CA IX è sensibile all’inibizione da anioni, dalle solfonammidi e sulfamati, con gli inibitori che coordinano direttamente con lo ione zinco dentro la cavità del sito attivo e che partecipano a varie interazioni favorevoli con residui amminoacidici situati nel mezzo idrofobico e idrofilico del sito attivo.

Diversi anni fa sono stati identificati molti inibitori della CA IX con concentrazioni del basso nanomolare (Tabella 3) [38,40]. Fra loro, qualche sulfamato e solfonammide è stata caratterizzata con la cristallografia a raggi X e con modelli analoghi. Tali studi hanno messo in evidenza anche composti che non permeano la membrana (e così inibiscono in modo specifico la CA IX in vivo) o agiscono come inibitori duali CA IX-COX2 (cicloossigenasi 2). Sia le solfonammidi eterocicliche che aromatiche come anche le solfonammidi/sulfamati/sulfammidi alifatiche possiedono un’attività inibitoria nell’ordine del basso nanomolare per le CA IX che sono state scoperte finora. Sono state anche descritte solfonammidi che incorporano vari zuccheri, ma finora la maggior parte degli CAIs usati per comprendere la funzione di questa proteina

Come descritto precedentemente, l’ipossia, attraverso la cascata dell’HIF, porta ad una alta sovraespressione della CA IX in molti tumori. Complessivamente la conseguenza di ciò è un pH sbilanciato, con la maggior parte dei tumori ipossici che hanno un pH acido con valori intorno a 6, in contrasto con i normali tessuti, i quali hanno un pH caratteristico con valori intorno a 7.4.

L’espressione costitutiva della CA IX umana ha recentemente mostrato di diminuire il pH extracellulare (pHe) nelle cellule epiteliali dei reni canini in

Madin-Darby (MDCK). Gli inibitori solfonammidici CA IX-selettivi (del tipo 17 e 18) hanno ridotto l’acidità nel mezzo inibendo l’attività catalitica dell’enzima, e quindi la generazione di ioni H+, legandosi in modo specifico solo alle cellule ipossiche che esprimono la CA IX. L’eliminazione del sito attivo della CA ha anche dimostrato di ridurre l’acidità del mezzo, ma un inibitore solfonammidico non può legarsi al sito attivo di tali proteine mutanti.

Perciò, le cellule tumorali diminuiscono il loro pHe sia con la produzione di acido

catalizzata dai tumori associati alla CA IX, che possiede un dominio catalitico extracellulare (Figura 14).

Figura 14.

Il basso pHe è stato associato con la trasformazione tumorigenica, con il

riarrangiamento cromosomiale, con la rottura della matrice extracellulare, la migrazione e l’invasione, l’induzione dell’espressione dei fattori di crescita cellulari e l’attivazione delle proteasi.

La CA IX probabilmente assume anche un ruolo nel fornire bicarbonato per essere usato come substrato per le cellule di crescita, siccome è stabilito che è necessario il bicarbonato per la sintesi dei nucleotidi pirimidinici.

L’indisulam (8), un derivato solfonammidico (originariamente chiamato E7070) con potente attività antitumorale, ha recentemente mostrato di agire come inibitore nell’ordine del nanomolare della CA IX (Tabella 3) [60].

Il suo dettagliato meccanismo d’azione non è chiaro, ma si sa che è coinvolto nella perturbazione del ciclo cellulare nelle fasi G1e/o G2, nella sottoregolazione delle cicline, nella riduzione dell’attività della chinasi 2 ciclina dipendente (CDK2), nell’ inibizione della fosforilazione della proteina del retinoblastoma (pRb) e nell’espressione differenziata di molecole che partecipano all’adesione cellulare, nella risposta di segnale e immunitaria, in aggiunta alle sue proprietà inibitorie nei confronti della CA IX. L’indisulam ha mostrato efficacia in vivo contro xenografts di tumori nei topi nudi, evidenziando un significante effetto antitumorale e passando alla fase clinica I e II per il trattamento dei tumori solidi. Fra i principali derivati riportati finora, alcuni dei più interessanti potenti inibitori della CA IX sono dei composti studiati da Svastova et al. (strutture 17 e 18) [61]. Nelle cellule tumorali sono predominanti oltre che gli isoenzimi CA IX anche le CA XII dove mostrano una ridotta espressione nei normali tessuti. E’ stato recentemente provato che dall’idratazione del biossido di carbonio a protoni e bicarbonato, queste CAs contribuiscono in maniera significativa all’acidificazione

extracellulare dei tumori solidi, come già detto in precedenza, mentre la loro inibizione diminuisce tale fenomeno con una certa estensione. Le CA IX e XII sono sovraespresse in molti tipi di tumori in risposta al fattore inducibile di ipossia (HIF), e la ricerca sul coinvolgimento di tali isoenzimi nel cancro ha fatto significativi progressi negli ultimi anni.

La pubblicazione della struttura cristallina a raggi X della CA IX [13], che è una proteina dimerica con struttura quaternaria non identificata prima per questa famiglia di enzimi (Figura 15), ci permette di progettare farmaci inibitori con uno

scaffold attivo contro questo nuovo bersaglio antitumorale. In verità, si sa da

molto tempo che molte classi di solfonammidi e sulfamati aromatici/eterociclici hanno buona affinità per questa isoforma, ma generalmente non mostrano specificità per l’inibizione delle isoforme associate al tumore verso i restanti isoenzimi CA (CA I-VII e XII-XV) trovati nei mammiferi.