4. UTILIZZO CLINICO GENERALE DEGLI INIBITOR
4.5 INIBITORI DELL’ANIDRASI CARBONICA USATI COME POTENZIALI FARMAC
POTENZIALI FARMACI ANTITUMORALI.
[50]Dopo le malattie cardiovascolari, il cancro è la seconda causa di mortalità al mondo. Viene considerata una patologia ad eziologia multifattoriale causata sia da fattori genetici, (esistono infatti soggetti più suscettibili di altri a sviluppare una neoplasia per la loro predisposizione genetica) sia da fattori ambientali a cui il soggetto è esposto nell’arco della vita. Essenzialmente si tratta di una malattia dei geni delle cellule somatiche, in cui per motivi ereditari o per motivi di esposizione ad agenti fisici, come le radiazioni, o chimici o biologici si accumulano una quantità tale di mutazioni in specifici geni, in modo da determinare una modificazione della cellula sana a cellula tumorale. Le cellule tumorali presentano numerose differenze rispetto alle cellule sane:
In primo luogo perdono il controllo della proliferazione cellulare, ovvero si replicano in maniera incontrollata. Diventano insensibili ai segnali anti- proliferativi: ad esempio si ha perdita dell’inibizione da contatto con le cellule vicine, si replicano anche in assenza dei segnali di attivazione della mitosi, manca qualsiasi regolazione nella progressione del ciclo cellulare
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(in particolare, in molti tumori, si è visto mancare del tutto il check point G1-S).
Sono cellule resistenti al segnale apoptotico, evadono completamente l’apoptosi, ovvero la morte cellulare programmata, andando di fatto incontro ad un processo di immortalizzazione.
Le cellule cancerose maligne hanno anche la capacità di indurre la proliferazione delle cellule dell’endotelio vascolare, producendo dei veri e propri nuovi vasi sanguigni (neo-angiogenesi) che vanno ad irrorare la massa tumorale alimentandola e promuovendo anche la metastatizzazione, e dunque l’invasività anche in altri tessuti distanti dal sito dove si è sviluppato il tumore primario.
Altra caratteristica importante dei tumori è l’ipossia[51]. Il tumore è caratterizzato da un inadeguato rifornimento di ossigeno. L’ipossia regola l’espressione di differenti geni attraverso la cascata del fattore d’ipossia inducibile 1 (HIF1), anche del gene che codifica per l’isoenzima CA-IX, la isoforma delle CAs più coinvolta nel cancro. In particolare, l’espressione della CA-IX è sovra-regolata dall’ipossia e sotto-regolata dalla proteina sopprimitrice dei tumori wild type di Von Hippel-Lindau (p-VHL)[51]. In questo contesto, si inserisce la prospettiva di usare specifici CAIs come farmaci antitumorali (Figura 18).
44 Figura 18. Regolazione dell’espressione della CA IX.
In alcune cellule cancerose il gene che codifica per la proteina sopprimitrice di Von Hippel-Lindau risulta essere mutato. Di conseguenza viene meno la regolazione che questa proteina opera sulla cascata dell’HIF. In condizione di ipossia, dunque, abbiamo una abnorme attivazione dell’HIF costitutiva, la cascata procede senza regolazione e va ad attivare nel nucleo la trascrizione genica, aumentando di fatto l’espressione di numerosi geni, tra cui appunto quello che codifica per la CA-IX (Figura 19). L’aumentata espressione di tale isoforma provoca nei tumori solidi ipossici una alterazione del pH che diventa più acido (assume il valore di 6 rispetto al pH dei normali tessuti che si attesta su 7.4).
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Figura 19. Ruolo della CA-IX nella progressione del tumore attraverso la
modulazione del pH.
La CA-IX appartiene alla famiglia delle α-CAs umane molto attive e le sue proprietà catalitiche della reazione di idratazione della CO2 sono paragonabili a
quelle del catalizzatore CA-II altamente evoluto.
Attualmente, la struttura a raggi X della CA-IX non è ancora disponibile, quindi è stata utilizzata la struttura della CA-II per comprendere le caratteristiche di inibizione della CA-IX.
Come per tutte le α-CAs, la CA-IX è sensibile all’inibizione da parte di anioni, solfonammidi e sulfammati. Gli inibitori si coordinano direttamente con lo ione zinco dentro la cavità del sito attivo e partecipano a varie interazioni favorevoli con residui amminoacidici, situati nel mezzo idrofobico e idrofilico del sito attivo. Alcuni anni fa sono stati identificati molti inibitori della CA-IX, attivi a concentrazioni nel range del basso nanomolare (Tabella 4)[52-54].
Studi successivi hanno messo in evidenza anche composti che non permeano la membrana e che quindi inibiscono in modo specifico la CA-IX in vivo o composti che agiscono come inibitori duali CA-IX-COX2.
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Sia le solfonammidi eterocicliche che aromatiche, come anche le solfonammidi/sulfammati/sulfammidi alifatiche, possiedono un’attività inibitoria nell’ordine del basso nanomolare per la CA-IX.
Alcuni CAIs sono stati sviluppati come probes fluorescenti del tipo 17 ed utilizzati per comprendere la funzione di questa proteina in vivo.
I composti solfonammidici aromatici (classici CAIs) hanno mostrato di:
invertire l’effetto dell’acidificazione tumorale (composto A)
inibire la crescita delle cellule cancerose con valori di IC50 (corrispondenti
alla molarità degli inibitori che producono il 50 % di inibizione della crescita delle cellule tumorali dopo 48 ore di esposizione al farmaco) nell’intervallo del micromolare (metazolamide, etossizolamide, indisulam, composti B-D)
sopprimere l’invasione del tumore mediata dalle CAs associate al cancro
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Teicher e colleghi hanno riportato che l’acetazolamide, se somministrata da sola, riduce la crescita del tumore, mentre, quando somministrata in combinazione con diversi agenti chemioterapici, ritarda il suo sviluppo[55].
L’indisulam (8), derivato solfonammidico (originariamente chiamato E7070), ha recentemente mostrato di agire come CAI a concentrazioni nell’ordine del nanomolare (Tabella 4)[56].
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L’indisulam è attualmente in fase II di sperimentazione clinica e il suo meccanismo d’azione ancora non è ben chiaro. E’ comunque noto che è coinvolto nella perturbazione del ciclo cellulare nelle fasi G1 e/o G2, nella sottoregolazione delle cicline, nella riduzione dell’attività della chinasi 2 ciclina dipendente (CDK2), nell’inibizione della fosforilazione della proteina del retinoblastoma (pRb), nell’espressione differenziata di molecole che partecipano all’adesione cellulare, nella risposta di segnale e immunitaria, in aggiunta alle sue proprietà inibitorie nei confronti della CA-IX. Ha inoltre dimostrato di avere un’efficacia nel trattamento dei tumori solidi[56].
Tutti gli CAIs al momento sviluppati come antitumorali non bersagliano selettivamente le CA-IX e CA-XII (isoforme associate al cancro), perciò essi sono anche capaci di inibire altri isoenzimi della CA (ad esempio la CA-I e la CA-II) che hanno rilevanza fisiologica.
Perciò, negli ultimi anni, sono state proposte delle strategie per ottenere composti che interagiscano in modo specifico con le isoforme associate ai tumori.
Gli isoenzimi CA-IX e CA-XII hanno alcune caratteristiche peculiari che le distinguono dalle CA-I e CA-II. La principale differenza sta nel fatto che gli isoenzimi IX e XII sono proteine transmembrana che orientano il loro dominio catalitico fuori dalla cellula, mentre gli isoenzimi I e II sono proteine solubili localizzate all’interno della cellula, nel citosol.
Quindi la strategia che è stata adottata per cercare di ottenere una inibizione selettiva delle isoforme associate al cancro è stata quella di sintetizzare solfonammidi aromatiche con una minore capacità di diffondere attraverso la membrana lipidica (Figura 20).
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Figura 20.
Il primo approccio per indurre l’impermeabilità della membrana agli CAIs, è stato quello di progettare inibitori polimerici ad alto PM (composto E in Figura 20). Tuttavia, gli effetti in vivo di questi composti sono stati deludenti a causa di problemi connessi ai polimeri (reazioni allergiche o problemi di biodisponibilità). Si è pensato, allora, di sviluppare solfonammidi cationiche, ottenute facendo
reagire solfonammidi eterocicliche aromatiche contenenti gruppi –NH2 liberi con
sali di piridinio, per ottenere derivati piridinici. I composti derivati da G (Figura
20) hanno mostrato una Ki nel range del basso nanomolare (3-5 nM) per la CA-IX
associata ai tumori.
Studi successivi ex vivo hanno mostrato che tali composti possono discriminare tra l’isoenzima CA legato alla membrana e quello del citosol. Inoltre, in vivo questi composti si sono dimostrati incapaci di attraversare la membrana plasmatica. Quindi, poiché tali composti non inibiscono le CAs intracellulari, possono mostrare minori effetti collaterali rispetto ai composti attualmente
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disponibili (come l’acetazolamide), che inibiscono indiscriminatamente tutte le CAs.
Un altro approccio, utilizzato da Wilkinson e colleghi, è stato quello di sfruttare la ben nota caratteristica che hanno i carboidrati di non poter diffondere attraverso la membrana. Per questo motivo sono state studiate una serie di solfonammidi benzeniche glucoconiugate attaccando, attraverso click-tailing, funzioni zuccherine al farmacoforo costituito dalle classiche solfonammidi aromatiche ad alta affinità (Ar-SO2-NH2) [57], (Figura 21). Due composti (H, I) si sono rivelati
molto attivi e selettivi verso la CAIX. Le code zuccherine hanno mostrato di essere fondamentali per ottenere composti selettivi nei confronti degli isoenzimi delle CAs.
Poiché l’ipossia è una caratteristica di molti tumori solidi, un’altra strategia per colpire gli isoenzimi associati ai tumori, è stata la progettazione di CAIs bioriduttivi ipossia-attivabili (L e M).
La strategia è quella di sfruttare le condizioni riducenti presenti in tali tumori (l’ossigeno qua presente è inferiore all’ 1%) per convertire un profarmaco inattivo in un CAI attivo. Di fatto avviene una bio-riduzione, che può anche essere mediata dalla proteina riducente tioredoxina-1, che è stata trovata ad alte concentrazioni in molti tipi di tumore umano.
In tale ambito, una serie di derivati disolfurici delle solfonammidi eterocicliche aromatiche sono stati sintetizzati da De Simone e colleghi [58]. Tali solfonammidi contenenti gruppi disolfuro di per sé sono molto ingombranti, e quindi incapaci di legarsi all’interno dello spazio ristretto del sito attivo della CA per motivi di ingombro sterico.
Tuttavia la bioriduzione, che avviene in vivo nei tumori ipossici, di tali solfonammidi dimeriche porta alla generazione di tioli molto meno voluminosi rispetto alla molecola di partenza, e per questo in grado di accedere al sito attivo enzimatico delle CA tumorali ed interagire con lo ione Zn2+ determinando inibizione enzimatica.
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Figura 21.