INIBITORI DELL’ANIDRASI CARBONICA UTILIZZATI COME MARKERS TUMORAL

CANCRO

.

Essendo espresse nelle cellule cancerose, le CA-IX e CA-XII potrebbero essere utilizzate come markers per una vasta gamma di tumori ipossici. Quindi alcune sono state progettate solfonammidi fluorescenti per l’imaging e la successiva diagnosi di tumori ipossici. Uno dei più importanti composti sviluppati fino ad oggi è il derivato 17 (4-sulfamoilfeniletiltioureido)fluoresceina, preparato attraverso la reazione della fluoresceina tiocianato (FITC) con una omosulfanilammide aromatica ammino-sostituita. E’ stato dimostrato che il composto 17 si lega soltanto al tessuto tumorale ipossico, dato che questo

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sovraesprime gli isoenzimi IX e XII, quindi potrebbe essere molto utile per l’imaging di questo tipo di cancro.

Questo composto presenta una Ki verso la CA-IX di 24 nM e mostra proprietà di

impermeabilità alla membrana, valutata attraverso un modello in vivo di membrane di eritrociti.

Per quanto riguarda il composto 29, questo è stato capace di ridurre l’acidificazione extracellulare mediata da CA-IX derivante da cellule di rene canino Madin-Darby (MDCK-CA-IX) in condizioni ipossiche, ed il suo effetto sul pH extracellulare normossico è risultato trascurabile. Attualmente, è stato sviluppato come strumento diagnostico, negli studi clinici, per l’imaging di tumori ipossici.

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INTRODUZIONE

ALLA

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Le anidrasi carboniche (CAs) sono una superfamiglia di metallo-enzimi che catalizzano l’interconversione tra CO2 e ione bicarbonato. Sono quindi coinvolte in un cruciale processo fisiologico connesso alla respirazione e al trasporto di CO2/bicarbonato attraverso i tessuti metabolizzanti ed i polmoni. Ad oggi sono conosciute sei distinte famiglie genetiche di diversa evoluzione: α-CA, β-CA, γ- CA, δ-CA, ζ-CA, η-CA. Nei vertebrati più sviluppati, compresi gli esseri umani, sono stati scoperti quattordici isoenzimi delle α-CA, numerati da I a XIV. Recentemente è stato individuato un ulteriore isoenzima delle α-CA (CA-XV), presente in diverse specie animali, eccetto che negli esseri umani e negli scimpanzé. Le diverse famiglie di CAs differiscono per lo ione metallico presente nel sito attivo. Tutte e cinque le classi di enzimi sono zinco-enzimi, ma probabilmente le γ-CAs sono ferro-enzimi, anche se risultano essere attive anche in presenza degli ioni zinco o cobalto[59,60], mentre le ζ-CAs utilizzano cadmio o zinco per la catalisi di reazioni fisiologiche[61,62].

Gli isoenzimi CA svolgono varie importanti funzioni fisiologiche e fisiopatologiche relative alla respirazione e al trasporto di CO2/bicarbonato; inoltre regolano il pH e l’omeostasi della CO2, la secrezioni di elettroliti in una varietà di tessuti/organi, le reazioni di biosintesi (come la gluconeogenesi, la lipogenesi e l’urogenesi), il riassorbimento osseo e la calcificazione. Recentemente è stato evidenziato che sono coinvolte in alcuni processi patologici (tumorigenecità, obesità, epilessia, crescita e virulenza di vari patogeni). Le CAs sono enzimi ubiquitari, quindi la loro presenza in così tanti tessuti e in così tante isoforme rappresenta una meta attraente per la progettazione di inibitori con diverse applicazioni biomediche.

Diversi inibitori delle anidrasi carboniche (CAIs) sono agenti efficaci dal punto di vista clinico e negli ultimi anni sono emerse nuove applicazioni per gli CAIs. Essi possono essere utilizzati a livello topico come antiglaucoma, come anticonvulsivanti, antiobesità, antipanico e come agenti antitumorali/strumenti diagnostici[5,11,13,45]. Inoltre, le CAs rappresentano un target emergente nella progettazione di farmaci anti-infettivi (agenti antimicotici e antibatterici)[12,63,64] con un meccanismo d’azione innovativo. Di conseguenza, sono state sviluppate nuove numerose classi di CAIs al fine di modularne le proprietà farmacologiche.

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Le CAs vengono inibite principalmente da due classi di composti: gli anioni complessanti il metallo (tra cui i carbossilati) e le solfonammidi/ sulfammati/ sulfammidi, che generalmente si legano allo ione Zn2+ del sito attivo dell’enzima. Il gruppo di ricerca presso il quale ho svolto la mia tesi, ha recentemente sviluppato nuovi derivati triciclici 1 caratterizzati da uno scaffold benzotiopiranopirazolico o piridotiopiranopirazolico, sul quale è stata inserita una funzione benzensolfonammidica [65]. Questi composti sono stati progettati quali analoghi rigidi di celecoxib e valdecoxib, che nati come inibitori specifici delle ciclossigenasi 2 (COX-2), hanno dimostrato di essere anche potenti CAIs[66-68].

I composti 1a-e, così come i composti di riferimento CLX e VLX sono stati saggiati quali inibitori catalitici delle isoforme hCAI-XIV (Tabella 5) presso il laboratorio del Professor Supuran, C. T. dell’Università di Firenze.

56 Tabella 5. Inibizione di hCAisoforme I-XIV con i composti 1a-e, Celecoxib (CLX)

e Valdecoxib (VLX). X S R N N H₂NO₂S 1a-e 1a: X = CH R = OCH₃ 1b: X = CH R = Cl 1c: X = CH R = CF₃ 1d: X = N R = H 1e: X = N R = CH₃ Ki(nM)α enzyme 1a 1b 1c 1d 1e CLX VLX hCA-I 65 212 318 193 155 50000 54000 hCA-II 16 29 210 72 49 21 43 hCA-III 22700 32000 28600 6400 7900 7400 78000 hCA-IV 8850 7200 7140 328 7500 880 1340 hCA-VA 923 440 327 476 992 794 912 hCA-VB 1072 3140 3250 3180 3270 93 88 hCA-VI 7116 9280 9340 8055 8140 94 572 hCA-VII 609 602 628 873 912 2170 3900 hCA-IX 2182 1845 2570 2340 3250 16 27 hCA-XII 4550 5620 6755 5540 5870 18 13 hCA-XIII 938 2810 714 4300 4630 98 425 hCA-XIV 931 797 548 715 844 689 107

La caratteristica principale dei derivati 1a-e è l’elevata attività inibitoria nei confronti delle isoforme I e II della CA umana (hCA); al contrario, l’attività

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inibitoria verso hCA-III, IV, VA, VB, VI, VII, IX, XII, XIII e XIV è risultata di due ordini di grandezza più bassa.

Dall’analisi dei dati riportati nella Tabella 5 sono emerse le seguenti relazioni struttura-attività (SAR)[65]:

 Le isoforme citosoliche hCA-I e hCA-II sono inibite rispettivamente moderatamente ed efficacemente dai composti 1a-e. Il profilo di inibizione di questi composti nei confronti di hCA-II è risultato simile a quello di celecoxib e valdecoxib, mentre è risultato migliore nei confronti di hCA-I. La presenza nello scaffold eterociclico di un benzene o di una piridina porta comunque all’ottenimento di efficaci CAIs. Inoltre, nell’ambito dei derivati benzotiopiranici, gli inibitori più efficaci sono quelli recanti il gruppo metossilico (1a) o un atomo di cloro (1b) in posizione 7, mentre l’introduzione di un gruppo CF3 (1c) comporta una minore attività inibitoria nei confronti di entrambe le isoforme.

 L’isoforma citosolica lenta hCA-III viene inibita poco sia dai composti 1a-e, che da celecoxib e valdecoxib. Ciò è probabilmente dovuto ad una specifica struttura del sito attivo dell’enzima hCA-III, il quale presenta un ingombrante residuo di Fenilalanina (Phe198) al centro della tasca attiva che interferisce con il legame dei composti 1a-e, stericamente ingombrati [69].  L’isoforma IV legata alla membrana viene inibita moderatamente dai

composti 1a-e. Il composto con un profilo migliore di inibizione è 1d, che presenta l’anello pirimidinico non sostituito (R=H).

 Le isoforme mitocondriali hCA-VA e hCA-VB, nonché l’isoforma hCA-VI

secreta nella saliva, sono inibite da questi composti e dai coxib, con costanti di inibizione nell’intervallo 327-9340 nM.

 Le isoforme citosoliche rimanenti hCA-VII e hCA-XIII sono inibite moderatamente dai composti 1a-e. I derivati piridinici 1d-e hanno mostrato un’attività inibitoria inferiore nei confronti dell’isoforma hCA-VII. Sembra che per questa isoforma la natura del sostituente R abbia minor influenza sull’attività inibitoria. Al contrario, per l’inibizione dell’isoforma hCA-XIII

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questo sembra essere il parametro più importante. Infatti il composto 1c (R=CF3) mostra il miglior profilo di inibizione.

Importante sottolineare che i coxib, VLX e CLX, sono inibitori deboli di hCA-VII, ma mostrano un miglior profilo di inibizione nei confronti di hCA-XIII.

 Le isoforme transmembranarie hCA-IX, -XII e -XIV sono inibite moderatamente dai nuovi composti 1a-e. L’isoforma maggiormente inibita è hCA-XIV, mentre l’isoforma meno inibita è hCA-XII.

La cristallografia a raggi X e studi di sovrapposizione hanno permesso di spiegare il profilo di inibizione specifico delle pirazolo-solfonammidi, che è risultato piuttosto differente da quello dei composti di riferimento CLX e VLX. In particolare, per studiare il tipo di inibizione di questi composti sono stati condotti studi di cristallografia a raggi X del composto 1e complessato con l’enzima hCA- II (Figura 22).

Figura 22. Rappresentazione del sito attivo dell’enzima hCA-II complessato con

il composto 1e (magenta). Lo ione zinco nel sito attivo è rappresentato come una sfera grigia.

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Il composto 1e si inserisce profondamente nel sito attivo dell’enzima, spiazzando il solvente legato allo zinco catalitico, per cui l’azoto della solfonammide interagisce direttamente con lo ione zinco. L’azoto e l’ossigeno della solfonammide si trovano infatti nella giusta distanza per formare legami a idrogeno con la Treonina 199 (Figura 23).

L’atomo di zolfo distorce l’anello del composto, ma non è direttamente coinvolto nell’interazione con l’enzima hCA-II, non è risultato dunque essere essenziale per l’attività. Gli anelli idrofobici del sistema eterociclico si protendono all’esterno e sono stabilizzati principalmente da residui idrofobici che delimitano la cavità del sito attivo, coinvolgendo interazioni di Van der Waals con le catene laterali di Valina 121, Fenilalanina 131, Leucina 198, Prolina 202 ed Istidina 64.

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In Figura 23 è riportata la sovrapposizione della struttura hCA-II-1e (Figura 23A) che è stata effettuata parallelamente con VLX (Figura 23B) e CLX (Figura 23C).

Figura 23. Rappresentazione dei composti 1e (A, magenta), di VLX (B, ciano) e

di CLX (C, verde) sovrapposti sul sito attivo della hCA-II. Gli amminoacidi sono rappresentati come bastoncini gialli, mentre lo ione zinco nel sito attivo è rappresentato come una sfera grigia. Le frecce rosse indicano il cambiamento conformazionale di hCA-II nel legame con l’inibitore.

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L’aspetto più interessante di questa comparazione ha rivelato che tutti e tre i composti si legano allo ione zinco del sito attivo e che i loro gruppi terminali hanno la capacità di occupare zone diverse sulla superficie del sito attivo. In particolare, l’anello fenilico idrofobico di VLX spinge fuori la Fenilalanina 131 dalla tasca idrofobica a differenza dei composti 1e (Figura 23A) e CLX (Figura 23B). L’anello fenilico idrofobico di CLX costringe l’Asparagina 67 a cambiare conformazione (Figura 23C), inoltre CLX ha sia una regione idrofila ricca di fluoro che un anello fenilico idrofobico, e ciò gli conferisce un orientamento insolito. Per quanto riguarda il composto 1e, l’atomo di azoto idrofilo fuso nell’anello piridinico, può essere coinvolto nel legame a idrogeno con il solvente e quindi non necessita della presenza nella tasca idrofobica della Fenilalanina 131 (Figura 23A).

Nonostante i cambiamenti conformazionali delle catene laterali dei tre inibitori (1e, VLX e CLX) che interagiscono con hCA-II e i loro diversi orientamenti all’interno del sito attivo, tutti e tre interagiscono con circa le stesse dimensioni superficiali della proteina, che è rispettivamente: 407, 451 e 409 Å2 [65].

I risultati ottenuti hanno indicato che le benzensolfonammidi 1a-e costituiscono una nuova classe di CAIs molto interessante da un punto di vista clinico, in quanto presentano specificità nei confronti di un numero ristretto di isoforme. La maggiore selettività di inibizione porta al vantaggio che tali inibitori daranno sicuramente minori effetti collaterali rispetto a quelli di vecchia generazione non selettivi. Inoltre è risultato molto significativo il fatto che i composti 1d e 1e abbiano mostrato un buon profilo di inibizione verso le CAs dei micobatteri, dato che tali CAs sono inibite meno da altre classi di solfonammidi, prospettando nuovi scenari di applicazione terapeutica di tali composti.

La ricerca in questo ambito è continuata investigando altre serie di composti benzen-solfonammidici apportando modifiche allo scaffold, sempre con lo scopo di sintetizzare CAIs quanto più selettivi possibile verso alcune isoforme [70]. In particolare, è stata shiftata la funzione benzen-solfonammidica dalla posizione 1 alla posizione 2 del sistema pirazolico dei nuclei benzotiopirano[4,3-c]pirazolo e piridotiopirano[4,3-c]pirazolo (2 a-d) [70], per valutare come questo cambio di posizione potesse modulare la selettività per alcune isoforme di CA. I sostituenti

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in posizione 7 (R) sono stati scelti considerando quelli che avevano mostrato i risultati più convincenti nei composti precedentemente descritti 1 a-e.

2a-d

2a: X = CH R = OCH3 2b: X = CH R = Cl 2c: X = N R = H 2d: X = N R = CH3

Successivamente, sono stati studiati composti con un diverso scaffold eteropoliciclico. In particolare, è stata effettuata la sintesi di sistemi pirido- tiopirano-pirimidinici (3a-e) con la funzione benzensolfonammidica in posizione 2 del sistema triciclico spaziata da un linker NH [70].

X R S N N HN SO₂NH₂ 3a-e 3a: X = CH R = H 3b: X = CH R = OCH3 3c: X = CH R = Cl 3d: X = N R = H 3e: X = N R = CH3

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I composti 2a-d così come i composti 3a-e sono stati saggiati per valutare la loro capacità di inibire le quattro isoforme CA più rilevanti da un punto di vista fisiologico, le hCA-I, -II, -IX e -XII, utilizzando l’acetazolamide (AAZ) come composto di riferimento[6].

I dati raccolti in Tabella 7 testimoniamo che i composti 2a-d vanno ad inibire significativamente tutte e quattro le isoforme investigate, con costanti di inibizione che stanno, rispettivamente, nel range di 22.5-68.4 nM verso l’isoforma umana I, 7.1-8.5 nM verso l’isoforma II, 6.1-7.7 nM nei confronti dell’isoforma IX, 38.1-68.6 nM nei confronti dell’isoforma XII. Dagli studi SAR è emerso che il sostituente R cosi come l’eteroatomo X hanno una scarsa influenza sull’attività inibitoria.

Tabella 7

È dunque emerso che lo shift del gruppo benzen-solfonammidico dalla posizione 1 alla posizione 2 dell’anello pirazolico ha determinato una perdita della isoforma- selettività di questi composti. Quindi questa linea di ricerca è stata abbandonata a favore della sintesi di nuovi derivati che incorporassero un anello pirimidinico sul

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sistema benzotiopiranico e piridotiopiranico (composti 3a-e). I dati di inibizione delle varie isoforme investigate per tali composti sono riportati in Tabella 8.

Tabella 8

Dai dati riportati emerge che la isoforma citosolica I è inibita moderatamente da tali composti con una Ki compresa tra 66.9 e 84.0 nM, e nuovamente gli studi di SAR hanno mostrato che la natura del sostituente R e/ o dell’eteroatomo X non hanno un’influenza significativa ai fini dell’attività biologica. Questo non è stato invece il caso dell’isoforma II, per la quale è stato evidenziato un differente profilo di inibizione per queste solfonammidi. In particolare si sono mostrati efficaci inibitori di questa isoforma i composti 3d ed 3e con una Ki rispettivamente di 8.0 e 9.4 nM; il composto standard AAZ ed i composti 3a-c si sono dimostrati molto meno efficaci con una Ki assai più elevata (range 63.2-218 nM). La migliore sostituzione si è dunque rivelata quella che incorpora nello scaffold policiclico un anello piridinico e non benzenico. Il sostituente R non ha dimostrato avere grande influenza sul profilo di inibizione enzimatica dei composti.

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L’isoforma transmembranaria IX, un valido target antitumorale, è risultata essere inibita in modo efficace da questi derivati con Ki che vanno da 7.0 a 27.6 nM sia per i composti con l’anello benzenico (3a-c) che quello piridinico (3d-e) nel sistema triciclico, che sono risultati quindi efficaci inibitori. Dall’analisi dei risultati emerge che, per quanto riguarda la serie di composti che presentano l’anello benzenico nel sistema triciclico, quando il sostituente R è un metossile (3b) si ha una perdita di efficacia inibitoria di almeno 3 volte rispetto a quando la posizione 2 è non sostituita (3a) o presenta un atomo di Cl (3c). Per quanto riguarda la serie dei composti piridinici (3d,e), invece, si ha un incremento di tre volte dell’attività inibitoria nei confronti di hCA-IX quando il sostituente R è un metile (3e) rispetto all’omologo non sostituito (3d).

Anche per quanto riguarda l’isoforma XII tali composti si sono dimostrati dei validi inibitori con valori di Ki nel range 15.5 e 75.1 nM. In particolare, come si può vedere in tabella, i composti più efficaci si sono dimostrati il 3c (R= Cl) nella serie benzenica ed il 3d (R=H) nella serie pirazolica.

Sulla base di queste ricerche precedentemente svolte, sono state progettate possibili ulteriori modifiche da apportare allo scaffold triciclico dei sistemi appena descritti. Scopo della mia tesi è stata la preparazione di nuovi derivati eterociclici caratterizzati da scaffold pirazolochinazolinico e pirimidochinazolinico (Figura 24). In particolare, la progettazione razionale ha previsto: (i) l’introduzione di un ulteriore atomo di N sull’anello A a dare il nucleo pirimidinico; (ii) l’eliminazione dall’anello B dell’atomo di zolfo, che non si è dimostrato fondamentale nell’interazione con l’enzima; (iii) per quanto riguarda il terzo ciclo (anello C), direttamente collegato alla funzione benzensolfonammmidica, sono stati mantenuti sia il nucleo pirazolico (1-sostituito) che quello pirimidinico (2- sostituito), come schematizzato in Figura 24.

66 N N N N R R N N H₂NO₂S N N NH H₂NO₂S A C pirazolo- chinazoline pirimido- chinazoline A C B B Figura 24.

In particolare, il mio lavoro di tesi ha previsto la sintesi delle pirazolo-chinazoline

4a-c e delle pirimido-chinazoline 5 a-c.

N N N N H₂NO₂S R 4a-c N N R N N HN SO₂NH₂ 5a-c 4a: R = H 4b: R = CH₃ 4c: R = C₆H₅ 5a: R = H 5b: R = CH₃ 5c: R = C₆H₅

In entrambi i sistemi triciclici è comunque presente un nucleo pirimidinico (anello A) sostituito in posizione 2 con un CH3, che nei precedenti studi aveva fornito buoni risultati, e con un gruppo fenilico, per valutare se questo sostituente, con maggiore ingombro sterico, sia in grado di modulare la selettività nei confronti delle varie isoforme dell’enzima AC.

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La sintesi delle due serie di composti 4a-c e 5a-c prevede la sintesi di intermedi chiave comuni che sono i 7,8-diidro-5-(6H)-chinazolinoni-2-sostituiti 6a-c sintetizzati secondo la procedura, già descritta in letteratura [72] e riportata nello schema 1. Schema 1 O O + _CH OCH3 H3CO N CH3 CH3 i O O CHN(CH3)2 + C NH R NH2 . _HCl ii N N O R 6 a-c 6a: R = H 6b: R = CH3 6c: R = C6H5 7 R = H, CH3, C6H5

Condizioni di reazione: i: 100°C, 1 ora; ii: EtOH, riflusso, 5-15 ore.

Il cicloesan-1,3-dione commerciale è stato fatto reagire con un eccesso di N,N-

dimetilformammide-dimetilacetale (DMF-DMA) a 100°C per un’ora,

monitorando l’andamento della reazione mediante TLC (miscela eluente: etere di petrolio 40-60°C/acetato di etile = 1: 9). Dopo raffreddamento, per triturazione con etere etilico si ottiene un precipitato giallo che, per successiva filtrazione a pressione ridotta, fornisce il composto desiderato 7 con resa quantitativa. Questo

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risulta sufficientemente puro da poter essere utilizzato come tale nello step successivo senza ulteriore purificazione.

La successiva reazione 1,3-bielettrofila dell’intermedio dimetilamminometilenico

7 con il reattivo bi-nucleofilo, formammidina, acetammidina o benzammidina

cloridrato, secondo quanto riportato in letteratura[73],ha portato all’ottenimento dei derivati pirimidinici 6a-c [72]. A questo scopo, il composto 7 viene solubilizzato in etanolo e fatto reagire con una quantità stechiometricamente equivalente dell’opportuna ammidina cloridrata commercialmente disponibile. La reazione viene condotta a riflusso per un periodo che va dalle 5 alle 25 ore controllando mediante TLC (miscela eluente: etere di petrolio 40-60°C/acetato di etile = 1: 9). Dopo raffreddamento, la miscela di reazione viene portata a secco a pressione ridotta ed il residuo ottenuto viene purificato mediante cromatografia flash su gel di silice (miscela eluente: etere di petrolio 40-60°c/acetato di etile = 1: 9).

Quindi, per l’ottenimento dei derivati pirazolici 4a-c e pirimidinici 5a-c è stato necessario attivare il C nella posizione in  al carbonile dei composti 6a-c a dare i corrispondenti derivati dimetilammino metilenici 8a-c (Schema 2).

Schema 2 N N O R 6 a-c 6a: R = H 6b: R = CH3 6c: R = C6H5 + CH OCH3 H3CO N CH3 CH3 i N N O R CHN(CH3)2 8 a-c 8a: R = H 8b: R = CH3 8c: R = C6H5

Condizioni di reazione: i: 100°C, 1 ora.

I derivati 6a-c vengono fatti reagire con un eccesso di DMF-DMA a 100°C per un’ora controllando l’andamento della reazione mediante TLC (miscela eluente:

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etere di petrolio 40-60°C/acetato di etile = 1: 9). Dopo raffreddamento e triturazione con etere etilico, si ha la precipitazione dei composti desiderati 8a-c che vengono utilizzati come tali negli step successivi in quanto sono risultati sufficientemente puri da non necessitare ulteriori purificazioni.

A questo punto, la sintesi per l’ottenimento dei derivati pirazolici 4a-c e pirimidinici 5a-c è stata condotta seguendo procedure diverse.

Per la sintesi dei derivati pirazolo chinazolinici 4a-c, i derivati 8a-c precedentemente ottenuti vengono solubilizzati in etanolo e fatti reagire con un

leggero eccesso di 4-solfonammidofenilidrazina cloridrato, prodotto

commercialmente disponibile, secondo procedure già descritte in letteratura [65] (schema 3). Schema 3 N N R O CHN(CH₃)₂ 8 a-c 8a: R = H 8b: R = CH3 8c: R = C₆H₅ + SO2NH2 NHNH₂ i N N N N R H2NO2S 4 a-c 4a: R = H 4b: R = CH₃ 4c: R = C₆H₅ . _HCl

Condizioni di reazione: i: EtOH, 80°C, 20 ore.

I composti 8a-c solubilizzati in etanolo vengono addizionati di 4- solfonammidofenilidrazina cloridrato in eccesso e si scalda a 80°C per 20 ore controllando l’andamento della reazione mediante TLC (miscela eluente: etere di petrolio 40-60°C/acetato di etile = 1: 9). Dopo raffreddamento, il solido ottenuto, corrispondente ai composti 4a-c grezzi, viene raccolto mediante filtrazione a pressione ridotta e purificato mediante cromatografia flash su gel di silice (miscela eluente: etere di petrolio 40-60°C/acetato di etile = 1: 9).

70

Per la sintesi del sistema pirimidochinazolinico dei composti 5a-c (Schema 4) è necessaria la preparazione della N-sulfanilammidoguanidina 9, come descritto in letteratura [74]. La sulfanilammide, prodotto commerciale, viene solubilizzata in HCl concentrato ed addizionata di cianammide (soluzione al 50% p/p). La miscela viene scaldata a 100 °C per 20-30 minuti sotto costante agitazione. Dopo raffreddamento, la soluzione ottenuta viene versata in un becker contenente soluzione satura di NaHCO3 e tenuta in freezer tutta la notte. Si forma un precipitato bianco che viene raccolto mediante filtrazione a pressione ridotta e direttamente utilizzato, senza ulteriore purificazione, nella reazione successiva (Schema 4).

Quindi l’opportuno dimetilamminometilen derivato 8a-c viene solubilizzato in n- BuOH ed addizionato di una quantità stechiometricamente equivalente di composto 9 e una doppia di NaOH. La miscela di reazione viene lasciata a 120°C per 8-12 ore sotto costante agitazione controllando l’andamento della reazione mediante TLC (miscela eluente etere di petrolio 40-60°C/acetato di etile = 1: 9). Dopo raffreddamento, si evapora il solvente a pressione ridotta ottenendo un solido che, purificato mediante cromatografia flash su gel di silice (miscela eluente: etere di petrolio 40-60°C/acetato di etile = 1: 9), non ha fornito i prodotti desiderati 5a-c.

I dati spettroscopici, in particolare gli spettri 1H-NMR, hanno dimostrato che i prodotti ottenuti corrispondono alle strutture 5’a-c, in cui l’anello B del sistema triciclico ha subito aromatizzazione, probabilmente a causa delle elevate temperature ed ai tempi lunghi di reazione durante il processo sintetico. Del resto, diminuire i tempi di reazione comporta la non completezza del processo sintetico con formazione di intermedi non ciclizzati.

71 Schema 4 SO₂NH₂ NH₂ + H2NCN SO₂NH₂ NH C HN NH₂ H2CO3. 9 + N N R O CHN(CH₃)₂ 8a-c 8a: R = H 8b: R = CH3 8c: R = C6H5 ii N N N N R NH SO₂NH₂ N N N N NH R SO₂NH₂ 5a-c 5a: R = H 5b: R = CH3 5c: R = C6H5 i ii 5'a-c 5'a: R = H 5'b: R = CH3 5'c: R = C₆H₅

Condizioni di reazione e reagenti: i: HCl conc., CNNH2 soluzione acquosa al 50%, 100°C, 30 minuti; ii: n-BuOH, NaOH, 120°C, 8-12 ore.

72 N N R N N HN SO₂NH₂ 5'a-c 5'a: R= H 5'b: R= CH₃ 5'c: R= C₆H₅

Ad ogni modo, anche se in questo caso il sistema triciclico risulta più rigido rispetto ai composti precedenti, i derivati 5’a-c mantengono comunque i requisiti strutturali richiesti per l’interazione con l’enzima AC.

Tutti i composti finali ottenuti, nonché tutti gli intermedi di reazione sono stati caratterizzati mediante dati chimico-fisici e spettroscopici ed i dati sono risultati in accordo con le strutture proposte.

I derivati 4a-c e 5’a-c sono stati avviati a screening quali inibitori catalitici delle isoforme hCA I-XIV presso il laboratorio del professor Supuran, C. T. dell’Università di Firenze. Al momento i risultati non sono ancora disponibili.