INIBITORI DELLE TIROSIL-DNA-FOSFODIESTERASI

Gli studi effettuati sulle cellule SCAN1 hanno dimostrato la partecipazione di TDP1 nella riparazione del danno al DNA mediato da Top1, e nell’ipersensibilità alla CPT presente nelle cellule umane con un singolo deficit nell’attività di TDP1. Queste osservazioni suggeriscono la possibilità di sviluppare inibitori di TDP1 in grado di potenziare l’effetto citotossico degli inibitori di Top1 nella terapia farmacologica antitumorale. Ad oggi, sono stati individuati ancora pochi inibitori della TDP1, e le loro potenzialità e specificità lasciano ancora molto spazio per un miglioramento. Per esempio, sia il vanadato che il tungstato sono in grado di mimare il fosfato nello stato di transizione, agendo così da inibitori a concentrazioni millimolari. Tuttavia, a causa della bassa specificità e dell’ipersensibilità verso tutte le reazioni di trasferimento di gruppi fosforici, essi non possono essere utilizzati come inibitori farmacologici [21].

Gli inibitori delle TDP1 meglio conosciuti sono:

1. Antibiotici aminoglicosidici → un recente studio riporta che la neomicina inibisca TDP1 più efficacemente rispetto agli analoghi amminoglicosidici paromomicina e lividomicina A (Figura

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24). L’inibizione di TDP1 da parte della neomicina è stata osservata su substrati sia a singolo che a

doppio filamento, ma è maggiore sui duplex di DNA; l’aclarubicina, invece, inibisce esclusivamente TDP1 con substrati a doppio filamento. L’inibizione da parte della neomicina può essere superata aumentando i livelli di TDP1, ed è maggiore a bassi pH. Da quanto sappiamo, i primi inibitori TDP1 riportati per uso farmacologico sono gli antibiotici amminoglicosidici e gli inibitori ribosomici tiostreptoni, la clindamicina-2-fosfato e la paromomicina [22].

Figura 24

2. Derivati steroidei → utilizzando un nuovo saggio di screening ad alto rendimento, è stato individuato come potenziale inibitore di TDP1 un derivato del progesterone sostituito in C21, chiamato NS88915. Un secondo screening e studi di reattività con enzimi che processano il DNA hanno confermato che NSC88915 (Figura 25) possiede una specifica attività inibitoria nei confronti di TDP1. La destrutturazione di NSC88915 in gruppi funzionali discreti ha rivelato che tutti i componenti sono necessari per l’attività inibitoria verso TDP1. Inoltre, la sintesi di analoghi di NSC88915 ha fornito informazioni sui requisiti strutturali necessari per l’inibizione di TDP1. La risonanza plasmonica di superficie (SPR) mostra che NSC88915 si lega a TDP1, mentre analoghi inattivi non riescono ad interagire con l’enzima. In seguito a studi di docking molecolare e dei meccanismi, questi composti sono stati proposti come inibitori competitivi, che mimano il substrato oligonucleotide-peptide di TDP1. Questi derivati steroidei rappresentano un nuovo chemiotipo e forniscono un nuovo scaffold per lo sviluppo di piccole molecole capaci di inibire TDP1[23].

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Figura 25. Inibizione da parte di NSC88915: (A) struttura chimica di NSC88915; (B) rappresentazione schematica di un saggio biochimico con base gel sulla TDP1; TDP1 idrolizza il legame 3’-fosfotirosinico e converte N14Y in un oligonucleotide contenente un 3’-fosfato (N14P); (C) gel rappresentativo che dimostra l’inibizione dose-dipendente della TDP1 da parte di NSC88915; (D) rappresentazione grafica dell’inibizione, in percentuale, della TDP1 da parte di NSC88915. Ogni punto rappresenta la media ± l’errore standard per tre diversi esperimenti.

3. Furamidina → saggi biochimici in vitro hanno confermato che anche la furamidina inibisce TDP1 a concentrazioni micromolari. La furamidina lega il duplex di DNA nel solco minore, selettivamente sui siti ricchi di adenina e timina, così come si intercala tra le coppie di guanina e citosina. Dal momento che nel saggio non era presente alcun duplex di DNA, il meccanismo d’azione della furamidina è praticamente nuovo. Ulteriori analisi tramite risonanza plasmonica di superficie hanno rivelato che la furamidina si lega non solo ai duplex di DNA, ma anche al DNA a singolo filamento, benché in grado minore. Analisi analoghe hanno poi mostrato che la furamidina interagisce con TDP1. Questi risultati hanno incrementato la possibilità di un meccanismo d’azione inibitorio che combini l’interazione tra il substrato di DNA e TDP1, che ricorda l’inibizione interfacciale dei Top1cc da parte degli inibitori Top1.

Altri due composti diamidinici, il berenile e la pentamidina, sono risultati meno efficaci della furamidina nell’inibizione di TDP1. Entrambi i composti mostrano una struttura complessiva curva,

33 come la furamidina, ma l’anello furanico della furamidina è sostituito con altri gruppi. Questo suggerisce che l’anello furanico sia importante per l’azione inibitoria verso TDP1, probabilmente a causa dell’interazione diretta col DNA o con TDP1 o con entrambi, o grazie alla stabilizzazione della curvatura complessiva del composto (Figura 26) [24].

Figura 26. sono mostrate le diverse attività sulla TDP1 da parte di furamidina, berenile e pentamidina: (A) struttura chimica dei tre composti. Le linee tratteggiate indicano le porzioni chimiche variabili; (B) reazioni a concentrazioni micromolari note dei tre composti; le reazioni sono portate avanti per 20 minuti, a pH 8.0 e 25°C, in presenza di 25 nM di substrato 14Y e 1 ng di TDP1. I campioni sono stati separati con un gel al 20% di urea-PAGE e poi visualizzati.

4. Agenti che mimano la fosfotirosina → il sistema AlphaScreen (saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato) a base di microsfere è stato utilizzato per valutare l’attività degli inibitori che mimano la fosfotirosina. L’insieme di composti farmacologicamente attivi presenti in letteratura (LOPAC) è stato analizzato per validare ulteriormente il saggio. Dopo l’analisi dei dati, sono stati selezionati quattro composti attivi: acido aurintricarbossilico (ATA), l’inibitore tirosinfosfatasico metil-3,4-defostatina e gli antagonisti delle proteine G Gα-specifici suramina e NF449 (Figura 27)

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[25]_{. La suramina blocca il legame di diversi fattori di crescita, inclusi il fattore di crescita insulino-}

simile I (IGF I), il fattore di crescita epidermico (EGF), il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e il fattore di crescita tumorale beta (TGF-beta), con i loro recettori, inibendo così la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali. Sia la suramina che il suo analogo NF449 sono stati riconosciuti come antagonisti dei recettori delle proteine G selettivi verso Gsα e dei recettori P2. Dunque essi possono agire da esche, poiché TDP1 può percepire la loro estesa rete di gruppi solfonici come molteplici siti fosfotirosinici. La nitrosoanilina, metil-3,4-defostatina, è un analogo stabile della defostatina ed è il più piccolo dei quattro composti attivi. È da notare che è considerevolmente più potente di vanadato e neomicina. La defostatina e i suoi analoghi sono inibitori tirosinfosfatasici (PTP) noti, che agiscono probabilmente anche come mimetici della fosfotirosina. La metil-3,4-defostatina, a differenza della defostatina, non inibisce le PTP associate a CD-45, dirigendosi esclusivamente sul rispettivo sito di legame. Abbiamo scoperto che la metil-3,4- defostatina inibisce la TDP1 a concentrazioni sub-micromolari, sia nei saggi primari che secondari, e rappresenta quindi il più potente inibitore di TDP1 riportato in letteratura [25].

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Figura 27. (A) Strutture dei quattro hits identificati nel saggio pilota; (B) è stata testata la risposta, in base alla dose, degli hits, sotto tre diverse condizioni di reazione: nella condizione A è stata usata 1 nM di enzima per 5 minuti; nella condizione B è stata usata 1 nM di enzima per 2 minuti; nella condizione C sono state usate 0,2 nM di enzima per 2 minuti. Man mano che la concentrazione di substrato diminuisce, si osserva una progressiva diminuzione dei valori della IC50 di tutti e quattro gli inibitori. (C) curve di risposta dose-dipendente degli hits testati nella condizione C. da sinistra andando verso destra vediamo le risposte di ATA (quadrati), metil-3,4-defostatina (rombi), NF449 (triangoli rovesciati) e suramina (triangoli). (D) Sono mostrati i grafici a dispersione tridimensionale dei dati qHTS, in cui mancano (in nero) o sono presenti (in blu) le relazioni tra risposta e concentrazione, riguardanti i saggi sulla serie LOPAC1280, effettuati sotto le condizioni di elevata conversione (a sinistra, condizione di reazione A) e di ridotta conversione (a destra, condizione di reazione C). L’aumentata sensibilità nel secondo saggio è evidenziata dall’aumento del numero di campioni che mostrano una più forte inibizione (punti blu).

36 4.3 TIROSIL-DNA-FOSFODIESTERASI 2 (TDP2)

Nelle cellule umane, esiste un altro enzima in grado di processare efficacemente le estremità 5’- fosfato delle rotture sul doppio filamento di DNA, in preparazione del legame col DNA. Questo enzima, una proteina associata al recettore di TRAF e TNF (TTRAP), è un membro della famiglia di fosfodiesterasi dipendenti da Mg2+/Mn2+. La deplezione di TTRAP cellulare porta ad un aumento della suscettibilità e della sensibilità delle rotture del doppio filamento indotte dalla DNA- topoisomerasi II. TTRAP è la prima porzione 5’-tirosil-fosfodiesterasica del DNA umano ad essere stata identificata; l’enzima viene perciò chiamato tirosil-DNA-fosfodiesterasi 2 (TDP2).

La TDP2 umana è più piccola di TDP1, con una massa molecolare di 41 kDa (362 residui amminoacidici). Come TDP1, anche TDP2 presenta due domini proteici, di cui il dominio catalitico è rappresentato dalla porzione C-terminale, mentre il dominio N-terminale presenta la porzione UBA, che, probabilmente, gioca un ruolo regolatorio. La TDP2 appartiene alla famiglia di nucleasi con dominio esonucleasico-endonucleasico-fosfatasico (EEP), che taglia DNA e RNA. TDP2 contiene quattro motivi catalitici conservati (TWN, LQE, GDXN, SDH), condivisi con le nucleasi Mg2+_/Mn2+ _{-dipendenti, incluse la DNAasi I e la endonucleasi AP (APE1). La maggior parte dei}

residui, in tutti e quattro i motivi, si è rivelata importante per TDP2 (Figura 28) [18].

Figura 28. Struttura cristallina di TDP2

A differenza di TDP1, TDP2 necessita di metalli bivalenti, ma non forma un intermedio covalente catalitico di transizione. Mg2+_{, Mn}2+_{, Co}2+ _{sono molto più efficienti, per la catalisi, rispetto a Ca}2+

o Zn2+. Il primo metallo è coordinato dai residui D262, H351 e N264, e coordina anche una molecola d’acqua deprotonata per l’attacco nucleofilo sul gruppo fosfato. Il secondo metallo è

37 coordinato dalle funzioni carbossiliche di D122 e E152. Il residuo N120 collega i siti di legame dei metalli, mediante legame ad idrogeno, coi residui E152 e D262. TDP2 genera terminazioni 5’- fosfato nell’acido nucleico; tali terminazioni, a differenza delle 3’-fosfato prodotte dalla TDP1, possono essere facilmente processate dalle ligasi (Figura 29).

Figura 29 Meccanismo di reazione proposto per il taglio del legame fosfodiestereo da parte della TDP2: (A) il peptide derivato dalla Top2 (topoisomerasi intrappolata) si lega in 5’ al DNA tramite legame fosfotirosinico; (B) sul legame del substrato covalente peptide-DNA, nel sito attivo della TDP2, due ioni magnesio vengono coordinati dai residui catalitici della TDP2, per l’attacco nucleofilo sul legame fosfotirosinico (frecce nere); (C) i prodotti del taglio consistono nel polipeptide topoisomerasi (top) e nel DNA con l’estremità 5’-fosfato libera.

TDP2 è stato identificato di recente come l’ospite per la VPg unlinkase, una fosfodiesterasi che idrolizza il legame tra VPg e i picornavirus, una vasta famiglia di virus di cui fanno parte poliovirus, coxackievirus, rhinovirus e il virus della malattia mano-piede-bocca. L'attività della TDP2 è vitale per la replicazione virale, poiché l'estremità 5’ dell'RNA genomico virale del picornavirus è legata covalentemente a una piccola (> 20 residui) capsula virale (VPg), attraverso un legame fosfotirosinico. Dopo l'infezione, VPg viene rimosso dall'estremità 5’ dell'RNA, grazie all'attività 5'-fosfotirosinica di TDP2, consentendo così la conversione delle proteine codificate dal virus. La famiglia Picornavirus comprende molti agenti patogeni responsabili di malattie nell'uomo e negli animali, come la poliomelite, il raffreddore e l'afta epizootica. Di conseguenza, inibitori di TDP2 possono servire per il trattamento di vaste popolazioni esposte a queste malattie [18].

38 4.4 INIBITORI DELLA TIROSIL-DNA-FOSFODIESTERASI 2

La recente scoperta dell’enzima tirosil-DNA-fosfodiesterasi 2 (TDP2) ha avuto un ruolo importante nella riparazione del danno al DNA mediata da topoisomerasi. Effettuando studi clinici, è stato ipotizzato che TDP2 potesse mediare la farmaco-resistenza verso l’inibizione di Top2 effettuata usando etoposide. Così, l’inibizione farmacologica selettiva di TDP2 è stata proposta come nuovo approccio per superare la resistenza, intrinseca o acquisita, ai farmaci inibitori di Top2.

Portando avanti una campagna di screening ad alto rendimento (HTS), sono stati identificati, come inibitori selettivi dell’enzima a dosaggi sub-micromolari, la toxoflavina e la deazaflavina.

I derivati della toxoflavina presentano una relazione struttura-attività (SAR) che ben chiarisce l’azione inibitoria verso TDP2. Tuttavia, la tendenza di questa serie di derivati a comportarsi da agenti riducenti, accanto ai problemi di metabolismo e farmacocinetica emersi in vitro, ne ha precluso un’ulteriore indagine.

I deazaflavinici sono stati sviluppati da un singolo hit HTS. Questa serie mostra SAR distinte, e non mostra attività redox; tuttavia la bassa permeabilità cellulare si è rivelata un problema [26]_.

Deazaflavina Toxoflavina

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